藤黃酸作用后小鼠血清代謝組學研究*

吳曉霞，于心悅，胡詩浩，黃寅，趙凱

(1.海口市人民醫(yī)院藥學部，?？?570208；2.中國藥科大學藥學院，南京 210009；3.中國藥科大學基礎醫(yī)學與臨床藥學學院，南京 210009)

藤黃是藤黃科植物藤黃(GarciniahamburyiHook.f.)樹干的裂口處分泌的干燥樹脂，具有破血散結、解毒、止血、殺蟲之功效，用于治療癌癥、腦水腫等多種病癥[1]。藤黃酸(gambogic acid，GA)是中藥藤黃的主要成分之一，占比約30%[2]；現(xiàn)代藥理學研究發(fā)現(xiàn)其具有抗腫瘤作用，對肝癌、肺癌、胃癌、胰腺癌等腫瘤細胞株均有明顯的抑制作用[1，3]。其抗癌作用與一般的化療抗癌藥有所區(qū)別，能選擇性地殺死癌細胞，而對正常的造血系統(tǒng)沒有影響，是一種很有前景的化療藥物[4]。但目前對于藤黃酸的研究大多集中在化合物本身，例如含量測定[2，5]、藥動學行為[6]、結構修飾[7]、新劑型開發(fā)[8]及作用后細胞表型觀測[9]等，即使是分子機制的研究也大多關注一些經(jīng)典的信號通路[9-10]。根據(jù)已有文獻[11-13]，藤黃酸在體內分布廣泛，以肝、腎、腸最多，主要通過膽汁排泄，其在Hep3B、SH-SY5Y等多種腫瘤細胞中能激活半胱天冬酶依賴的線粒體凋亡，導致線粒體能量代謝途徑改變，擾亂腫瘤細胞代謝，引起其凋亡。這提示藤黃酸對代謝穩(wěn)態(tài)的影響可能是其發(fā)揮藥效作用的機制之一，然而，目前對藤黃酸作用后機體效應分子的應答情況尚缺乏全面深入的研究。

代謝組學是研究生物體受藥物、疾病、環(huán)境等因素擾動后其內源性代謝物種類、數(shù)量及其變化規(guī)律的新興學科[14]。代謝物處于生命信息傳遞的終端，故可體現(xiàn)生物體整體狀態(tài)或功能變化的最終結果。代謝組學在腫瘤、心血管疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病等疾病的機制研究和藥物靶點發(fā)現(xiàn)發(fā)揮了重要作用[15-17]。本研究旨在整合運用液相色譜-質譜(LC/MS)和氣相色譜-質譜(GC/MS)聯(lián)用技術，全面表征藤黃酸作用后小鼠血清代謝指紋譜，篩選鑒定差異代謝物并探討其可能影響的代謝通路，為深入揭示藤黃酸的作用機制提供一定參考。

1 材料

1.1藥品與試劑 藤黃酸(中國藥科大學藥學院藥物化學系提供，批號：20180321，純度 > 97%)；甲醇、乙腈(HPLC級，德國Merck公司，批號：I0935307804和JA063230)；甲酸(HPLC級，美國ROE Scientific公司，批號：F8124-0500)；氯化鈉注射液(安徽雙鶴藥業(yè)有限責任公司，批號：H34023609)；甲氧胺(MOX，批號：LC09000V，純度 > 99.9%)、N-甲基-N-(三甲基硅基)三氟乙酰胺(MSTFA，批號：BCBW0186，純度>98.5%)、吡啶(批號：180205300D，純度>99.9%)以及十七酸(批號：SLBB1186V，純度 > 99.9%)均購自美國Sigma-Aldrich公司。格列本脲(批號：121633-201012，純度 > 99.0%)購買于中國食品藥品檢定研究院。

1.2儀器 快速液相色譜-離子阱飛行時間質譜儀(LC-IT-TOF-MS)、GCMS-QP2010 Ultra氣相色譜質譜聯(lián)用儀(日本島津公司)；5430R冷凍離心機(德國Eppendorf公司)；TMS-200超級恒溫混勻儀(杭州)；低溫恒溫攪拌反應浴(鄭州)；CentriVap型離心濃縮儀(美國LABCONCO公司)；MilliQ超純水制備系統(tǒng)(美國Milipore公司)。

2 方法

2.1動物實驗 SPF級雌性C57BL/6小鼠11只，體質量18～22 g，購自常州卡文斯實驗動物有限公司[實驗動物許可證號生產(chǎn)許可證：SCXK(蘇)2016-0010]。動物房內溫度(23±2) ℃，相對濕度50%～55%，動物自然晝夜節(jié)律光照。

小鼠適應性飼養(yǎng)1周后，隨機(Excel軟件中的RAND函數(shù))分為對照組(5只)和GA組(6只)。GA組尾靜脈注射藤黃酸(溶液濃度2.0 mg·mL-1；注射體積根據(jù)小鼠體質量調整，約0.1 mL；劑量10 mg·kg-1)，對照組注射等量空白溶液。于1 h后眼球取血，室溫靜置40 min，離心(4 ℃，6 000 r·min-1，10 min)分離血清。

2.2質控樣本 為保證分析方法的可靠性，從每只動物血清樣本中取出等量，充分混合后分裝，制得質控(quality control，QC)樣品。于分析批中每4個真實樣品插入一個QC樣品，同法進行前處理和儀器分析。

2.3LC/MS分析 精密吸取血清20 μL，精密加入甲醇/乙腈(1：1，含內標格列本脲5 μg·mL-1)溶液200 μL，渦旋5 min，兩次高速離心(4 ℃，16 000 r·min-1，10 min)后，取上清進樣分析。LC/MS分析條件如下：色譜柱采用XSelect HSS T3 XP(2.1×100 mm，2.5 μm，美國Waters公司)；以甲醇(A)和0.01%甲酸的水溶液(B)為流動相進行梯度洗脫：0.00～4.00 min，5～50%A；4.00～10.00 min，50～85%A；10.00～15.00 min，85～100%A；15.00～20.00 min，100%A；20.00～20.01 min，100～5%A；20.01～30.00 min，5%A。柱溫：40 ℃；進樣量：5 μL。質譜采用電噴霧離子化源(ESI)正負離子切換模式，質量掃面范圍m/z100-1000。

2.4GC/MS分析 精密吸取血清10 μL，加入甲醇(含內標十七酸10 μg·mL-1)100 μL，渦旋5 min，兩次離心取上清后，經(jīng)MOX和MSTFA兩步衍生化，產(chǎn)物轉移至進樣小瓶，供GC/MS分析。GC/MS儀器參數(shù)如下：進樣口溫度250 ℃，高純氦氣為載氣，流速為57 cm·s-1；進樣量體積為1 μL，分流比為20：1；Rtx-5MS石英毛細管柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm，美國Restek公司)進行色譜分離，升溫程序如下：70 ℃保持2 min，以10 ℃·min-1的速度升至320 ℃，保持2 min。質譜采用電子轟擊離子源(EI)，電壓70 eV，質量掃描范圍m/z45-600。

2.5數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析 采用Profiling Solution軟件(日本Shimadzu公司)對UFLC-IT-TOF/MS和GC/MS采集的原始數(shù)據(jù)進行峰提取和峰匹配，所得的數(shù)據(jù)矩陣導入Mathematica軟件(Ver 11.3，Wolfram，USA)，利用實驗室編寫的軟件包進行預處理(扣減空白、缺失值填補、面積歸一化)和統(tǒng)計分析。以變量投影重要性(VIP)>1、調整P值(adjustedP)<0.05以及絕對變化倍數(shù)(FC)>1.3為條件篩選差異變量。通過與標準品或數(shù)據(jù)庫比對，鑒別差異代謝物。

3 結果

3.1數(shù)據(jù)可靠性 采用Profiling Solution軟件從LC/MS和GC/MS原始圖譜中分別提出3297和3242個離子。QC樣本總離子流圖如圖1所示，所有譜圖重疊度較高；超過90%的離子的峰面積RSD<30%。此結果表明本研究采用的LC/MS和GC/M分析方法穩(wěn)定、可靠，所得數(shù)據(jù)可用于進一步的分析。

3.2差異離子篩選 提取出的數(shù)據(jù)經(jīng)預處理后，首先利用偏最小二乘法判別分析(PLS-DA)對樣品進行模式識別，其得分圖如圖2所示，可以看出，在LC/MS和GC/MS上，對照組與GA組組內聚集良好、組間區(qū)分明顯。進而采用Stuendent’s T Test或Mann-Whitney U Test比較各個離子組間差異的顯著性，并計算變化倍數(shù)。最后，以VIP > 1、調整P<0.05以及|FC|>1.3為閾值篩分別選出差異變量75和55個。

3.3差異代謝物鑒定與通路分析 基于PLS-DA和非參數(shù)檢驗的結果，LC/MS和GC/MS分別篩選得到差異變量75和55個。對于LC/MS中的差異變量，根據(jù)保留時間、加和離子等相關信息，結合已有標準品和HMDB等數(shù)據(jù)庫進行對比歸屬，初步鑒定出差異代謝物12個(表1)；對于GC/MS中的差異變量，通過與標準品和NIST數(shù)據(jù)庫對比，初步鑒定出差異代謝物9個(表2)。在這21個差異代謝物中，亮氨酸、纈氨酸、蘇氨酸等7個物質含量顯著增加，琥珀酸、LysoPE、PC、色氨酸等14個物質含量顯著降低。將篩選得到的21個代謝物進行整合分析，參考KEGG、HMDB等數(shù)據(jù)庫，構建了藤黃酸影響小鼠的代謝通路，主要涉及氨基酸代謝、磷脂代謝等通路(圖3)。

圖1 QC樣本的總離子流圖

圖2 LC/MS(A)和GC/MS(B)中對照組和GA組的PLS-DA得分圖

表1 基于LC/MS鑒定出的差異代謝物

①由商業(yè)標準確定。

①Confirmed by the commercial standards.

表2 基于GC/MS鑒定出的差異代謝物

①由商業(yè)標準確定。

①Confirmed by the commercial standards.

PC：磷脂酰膽堿；PE：磷脂酰乙醇胺；LysoPE：溶血磷脂酰乙醇胺；TCA：三羧酸循環(huán)；紅色和綠色箭頭分別代表GA組與對照組相比差異代謝物含量的升高和降低。

圖3 藤黃酸作用后小鼠血清中受影響的代謝通路

PC：phosphatidylcholine；PE：phosphatidylethanilamine；LysoPE：lysophosphatidylethanilamine；TCA：Tricarboxylic acid cycle；Red and green arrows indicate increase and decrease in GA groupvscontrol group，respectively

Fig.3Metabolicpathwaysinmouseserumaftergambogicacidtreatment

4 討論

本研究利用LC/MS和GC/MS平臺對藤黃酸作用后小鼠血清樣本進行了分析，篩選和鑒定出21個差異代謝物，主要包括氨基酸類、磷脂類等物質。其中，氨基酸在細胞生長中發(fā)揮著核心作用，氨基酸作為重要信號分子參與機體多種生理病理學的調控[18]。有代謝組學研究報道[19-20]，腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中伴隨著氨基酸含量的顯著變化。如，劉長庭等[21]發(fā)現(xiàn)肺癌患者血漿中蘇氨酸、絲氨酸、谷氨酸、亮氨酸、精氨酸等氨基酸含量與正常人相比均顯著降低，纈氨酸較正常人也有所下降。腫瘤細胞快速增長需要從血漿中攝取大量氨基酸作為底物合成蛋白質和氨基酸，同時腫瘤組織吸收氨基酸使整個機體蛋白質處于分解狀態(tài)，大量的機體蛋白質分解為氨基酸進入血漿得以補充血漿的不足，從而使血漿總氨基酸維持正常，腫瘤患者大多處于高代謝狀態(tài)，長期易造成營養(yǎng)不良[22-23]。利用腫瘤細胞和正常細胞代謝的差異，具有針對性的調節(jié)某些特定氨基酸的含量，可能對腫瘤的治療有所幫助[24]。本研究篩選出7種含量顯著變化的氨基酸，其中谷氨酸、精氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、亮氨酸和纈氨酸共6種氨基酸含量升高，色氨酸含量降低。這一結果提示，藤黃酸很可能對某些腫瘤的治療有所幫助。

除氨基酸代謝外，本研究還發(fā)現(xiàn)了磷脂代謝途徑中的8個節(jié)點物質含量顯著改變，說明藤黃酸干擾了小鼠的磷脂代謝。磷脂是細胞膜的主要組成成分并參與細胞的生命活動，腫瘤細胞需要更多的膜成分來維持細胞的快速增殖[25]。有文獻報道[26]，藤黃酸可通過脂代謝紊亂誘導腫瘤細胞的自噬。在本研究中，注射藤黃酸后，小鼠血清中LysoPA(a-13：0/0：0)、PC(20：4/22：6)和PC(22：2/16：1)含量降低，表明干擾磷脂代謝可能是藤黃酸抗腫瘤作用的機制之一。

此外，鑒定出的其他差異代謝物也可能與藤黃酸的體內作用相關。如，葡萄糖、琥珀酸在能量代謝通路中占據(jù)重要地位，兩者含量均有所下降，說明藤黃酸可能抑制了能量代謝[27-28]；硬脂酸可經(jīng)過一些列生化反應轉化為合成前列腺素的前體物質，而前列腺素等生物活性物質可以促進腫瘤細胞的生長代謝[29]，藤黃酸作用后硬脂酸含量下降可能會間接減少前列腺素的生成。

本實驗利用基于色譜-質譜聯(lián)用技術的代謝組學方法，研究了藤黃酸作用后小鼠血清代謝物的整體變化，發(fā)現(xiàn)氨基酸代謝、磷脂代謝、能量代謝等通路受到顯著影響，提示藤黃酸很有可能通過干擾相關通路發(fā)揮藥效作用，也說明藤黃酸的作用有單成分、多靶點的特點。下一步可采用荷瘤鼠模型、結合抑瘤率等藥效學指標，深入研究疾病狀態(tài)下藤黃酸的體內效應分子，為其作用機制闡釋和安全應用提供科學數(shù)據(jù)。