芍藥色素對(duì)2型糖尿病合并非酒精性脂肪肝小鼠的保護(hù)作用

焦宏偉

[海南省干部療養(yǎng)院(海南省老年病醫(yī)院)疼痛康復(fù)科，?？?571100]

2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)是一種與肥胖高度相關(guān)的代謝性疾病，長(zhǎng)期的血糖增高會(huì)對(duì)心、腦、血管、神經(jīng)系統(tǒng)、消化系統(tǒng)等帶來嚴(yán)重?fù)p傷，甚至威脅到患者的生命[1-3]。臨床研究發(fā)現(xiàn)，50%以上的T2DM合并有非酒精性脂肪肝(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)，NAFLD會(huì)促進(jìn)胰島素抵抗，導(dǎo)致病情進(jìn)一步加重[4-5]。

芍藥色素是一種天然水溶性植物色素，屬多酚類化合物，是花青素的一種。自然界中有數(shù)百種花青素，普遍具有抗炎、抗氧化等多種生物活性[6-7]。研究表明，黑豆種皮中提取的花青素能夠降低T2DM小鼠的血糖和血脂水平[8]，紫玉米中提取的花青素能夠促進(jìn)胰島素分泌和加快肝臟對(duì)葡萄糖的吸收[9]。芍藥色素對(duì)T2DM合并NAFLD的作用，筆者目前未見報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)研究了芍藥色素對(duì)T2DM合并NAFLD小鼠的保護(hù)作用，并初步探討了其作用機(jī)制，以期能為T2DM合并NAFLD的治療尋找到更多天然的藥物。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 本研究采用的無特定病原體(SPF)級(jí)的C57BL/6雄性小鼠(8周齡)，購自于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(京)2016-0011，飼養(yǎng)于海南醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，使用許可證號(hào)：SYXK(瓊)2012-0013。小鼠體質(zhì)量20～25 g。所有實(shí)驗(yàn)用小鼠在實(shí)驗(yàn)前先正常喂養(yǎng)1周以適應(yīng)環(huán)境。飼養(yǎng)環(huán)境保持溫度在20～25 ℃，相對(duì)濕度50%±5%，每12小時(shí)交替明暗光照。所有小鼠均自由飲水與進(jìn)食。

1.2試劑 實(shí)驗(yàn)用芍藥色素采用氯化芍藥色素-3-O-半乳糖(peonidin-3-galactoside，分子式C22H23ClO11，以下簡(jiǎn)稱芍藥色素，純度>97%，批號(hào)：GY1195AF01)購自上海惠誠生物科技有限公司；小鼠胰島素檢測(cè)試劑盒(批號(hào)：PI602)、丙二醛(MDA)檢測(cè)試劑盒(批號(hào)：032318180609)、超氧歧化酶(superoxide dismutase，SOD)檢測(cè)試劑盒(批號(hào)：040418180613)、增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑(批號(hào)：101617171013)、辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔抗體(批號(hào)：A0208)均購自上海碧云天生物科技有限公司；腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)檢測(cè)試劑盒(批號(hào)：M180424-102a)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)檢測(cè)試劑盒(批號(hào)：M170912-004a)購自欣博盛生物科技有限公司；p-p65抗體(批號(hào)：16)、p-IkB抗體(批號(hào)：18)、β-actin抗體(批號(hào)：17)購自美國Cell Signaling Technology公司；高脂飼料按照基礎(chǔ)飼料82%，豬油10%，膽固醇2.5%，膽酸鈉0.5%，蔗糖5%的比例自配。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1動(dòng)物建模及分組 參考文獻(xiàn)[10-11]，使用鏈脲佐菌素加高脂飼料建立T2DM合并NAFLD動(dòng)物模型。48只C57BL/6小鼠，按數(shù)字表法隨機(jī)選取8只作為正常對(duì)照組，給予普通飼料；其余40只小鼠喂食高脂飼料，持續(xù)喂養(yǎng)4周，之后腹腔注射使用檸檬酸鹽溶液配制的鏈脲佐菌素(30 mg·kg-1)溶液，正常對(duì)照組小鼠注射等體積檸檬酸鹽。3 d后高脂喂養(yǎng)小鼠靜脈采血檢測(cè)空腹血糖，若連續(xù)3 d空腹血糖大于11.1 mmol·L-1說明T2DM建模成功。繼續(xù)給予高脂飼料至第8周末，建T2DM合并NAFLD模型小鼠。按照隨機(jī)數(shù)字表法抽取建模成功小鼠，每8只為一組，分成模型對(duì)照組及芍藥色素大劑量組、中劑量組、小劑量組，每天分別給予劑量為400，200，100 mg·kg-1芍藥色素(蒸餾水溶解)灌胃，模型對(duì)照組及空白對(duì)照組用同體積的蒸餾水灌胃，繼續(xù)給藥6周后空腹采集小鼠血清，留取肝組織用于檢測(cè)。

1.3.2血清生化檢測(cè) 小鼠禁食12 h后眼球采血取血清，使用全自動(dòng)生化分析儀，檢測(cè)樣本血清中總膽固醇(total cholesterol，TC)、三酰甘油(triglyceride，TG)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase，ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase，AST)、空腹血糖(fasting blood glucose，F(xiàn)BG)水平。使用胰島素檢測(cè)試劑盒，檢測(cè)小鼠血清空腹胰島素(fasting insulin，F(xiàn)INS)水平。

1.3.3炎癥因子水平檢測(cè) 使用ELISA試劑盒，檢測(cè)血清中TNF-α、 IL-6水平。血清樣本稀釋后加入反應(yīng)孔，加入抗體37 ℃孵育1 h。洗滌后，加入100 μL辣根過氧化物酶標(biāo)記鏈霉親和素溶液，避光25 ℃下孵育30 min，洗滌后加入TMB溶液孵育20 min，之后加入終止液。檢測(cè)450 nm處的吸光度，與標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)比，計(jì)算TNF-α、IL-6的濃度。

1.3.4氧化應(yīng)激水平檢測(cè) 取小鼠肝組織加0.9%氯化鈉溶液制備肝組織勻漿，使用ELISA試劑盒，檢測(cè)肝組織勻漿中MDA、SOD的含量。

1.3.5肝組織病理學(xué)變化 取小鼠肝組織標(biāo)本置于4%多聚甲醛中固定，使用石蠟包埋并切片。使用蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色，通過400倍光學(xué)顯微鏡觀察肝組織病理變化。

1.3.6Western blotting檢測(cè)蛋白表達(dá) 提取小鼠肝組織蛋白，使用BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度。蛋白樣品在濃度為10%的聚丙烯酰胺凝膠中電泳分離、轉(zhuǎn)膜。之后加入5%脫脂奶粉封閉靜置2 h，加入一抗后于4 ℃下過夜，加入二抗繼續(xù)孵育2 h，采用ECL化學(xué)發(fā)光法顯色成像。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1一般情況對(duì)比 正常對(duì)照組小鼠活動(dòng)狀態(tài)好，進(jìn)食及飲水情況正常，皮毛光澤整潔；模型對(duì)照組小鼠活動(dòng)度明顯減少，進(jìn)食及飲水均增加，尿量增多、皮毛凌亂無光澤；芍藥色素大劑量組、中劑量組、小劑量組各組小鼠的一般情況，與模型對(duì)照組比較，均有不同程度的改善。在注射鏈脲佐菌素4周后，模型對(duì)照組小鼠體質(zhì)量增加不明顯，但與正常對(duì)照組比較，體質(zhì)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=8.93，P<0.05)；芍藥色素組小鼠的體質(zhì)量較模型對(duì)照組降低(P<0.05)，大劑量組降低最明顯(t=5.98，P<0.05)，結(jié)果見表1。

2.2血清生化學(xué)指標(biāo)比較 如表1，與正常對(duì)照組對(duì)比，模型對(duì)照組小鼠血清中TC、TG、ALT、AST、FBG、FINS水平上升(t=32.29，32.53，44.07，39.59，46.23，10.31，P<0.05)，與模型對(duì)照組比較，芍藥色素大、中、小劑量組小鼠血清中相應(yīng)生化指標(biāo)均下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其中大劑量組下降最明顯(t=21.28，18.93，31.42，29.07，34.56，6.89，P<0.05)。

2.3血清炎癥因子水平比較 如表2，與正常對(duì)照組對(duì)比，模型對(duì)照組小鼠血清中炎癥因子TNF-α、IL-6水平顯著升高(t=50.44，34.32，P<0.05)；與模型對(duì)照組比較，芍藥色素大、中、小劑量組小鼠血清中TNF-α、IL-6水平均明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其中高劑量組下降最明顯(t=43.48，22.76，P<0.05)。

2.4肝組織氧化應(yīng)激水平比較 如表3，與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組肝組織勻漿中MDA水平升高(t=12.58，P<0.05)，SOD水平下降(t=22.32，P<0.05)；與模型對(duì)照組比較，芍藥色素大、中、小劑量組小鼠肝組織勻漿中MDA水平均明顯下調(diào)、SOD水平均明顯上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其中大劑量組差異最明顯(t=7.63，18.21，P<0.05)。

2.5肝組織病理學(xué)改變 如圖1，在顯微鏡下觀察小鼠肝組織HE染色切片，正常對(duì)照組肝小葉結(jié)構(gòu)正常，無明顯肝細(xì)胞脂肪變性及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；模型對(duì)照組小鼠肝組織可見彌漫性肝細(xì)胞脂肪變性且有大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；與模型對(duì)照組比較，芍藥色素大、中、小劑量組小鼠肝細(xì)胞脂肪變性及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)均有不同程度地減輕，其中大劑量組改善最顯著。

2.6肝組織NF-κB蛋白活化水平 如圖2，模型對(duì)照組肝組織代表NF-κB活性水平的p-p65、p-IkB蛋白表達(dá)水平與正常對(duì)照組比較明顯上調(diào)，芍藥色素組相應(yīng)蛋白表達(dá)水平與模型對(duì)照組比較明顯下調(diào)。

3 討論

T2DM與NAFLD高度相關(guān)[12-13]，T2DM可進(jìn)一步引發(fā)NAFLD，而NAFLD也會(huì)誘導(dǎo)T2DM的發(fā)生[14]。這與T2DM可引起胰島素抵抗促進(jìn)肝臟脂質(zhì)沉積，過量脂質(zhì)沉積加劇脂質(zhì)氧化又可促進(jìn)胰島素抵抗有關(guān)。T2DM與NAFLD之間的相互作用，會(huì)導(dǎo)致疾病進(jìn)一步加重，威脅生命健康[15]。

T2DM合并NAFLD的發(fā)病機(jī)制目前還沒完全明確，已有研究表明糖毒性、脂毒性及其引發(fā)的慢性炎癥是其重要發(fā)病機(jī)制[16]。肝臟是脂肪代謝的主要場(chǎng)所，過量脂肪的代謝會(huì)產(chǎn)生過量的氧自由基，氧自由基引起細(xì)胞脂質(zhì)過氧化，從而引起氧化應(yīng)激反應(yīng)和炎癥因子浸潤(rùn)，持續(xù)的炎癥進(jìn)一步會(huì)誘發(fā)胰島素抵抗，從而導(dǎo)致T2DM合并NAFLD疾病進(jìn)展[17]。因此抗炎、抗氧化是治療T2DM合并NAFLD的重要途徑。

芍藥色素是花青素中的一種，是常用的食品添加劑?；ㄇ嗨仡惢衔锲毡榫哂锌寡?、抗氧化的作用[18-19]。本研究中給予芍藥色素干預(yù)的小鼠，血清中TNF-α、IL-6、MOD水平明顯下降，SOD水平上升，結(jié)果表明芍藥色素對(duì)T2DM合并NAFLD小鼠有抗炎、抗氧化的作用。生化學(xué)指標(biāo)檢測(cè)顯示，芍藥色素干預(yù)后，小鼠血清中TC、TG、ALT、AST水平顯著下降。小鼠肝組織HE染色結(jié)果顯示肝細(xì)胞脂肪變性以及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)顯著減少，以上結(jié)果提示芍藥色素對(duì)T2DM合并NAFLD小鼠具有保護(hù)作用。

NF-κB是機(jī)體中調(diào)節(jié)TNF-α、IL-6等炎癥因子的重要轉(zhuǎn)錄因子，p65是NF-κB蛋白重要的亞型，磷酸化IkB激活NF-κB，從而使其發(fā)揮轉(zhuǎn)錄活性[20-21]。研究發(fā)現(xiàn)，草莓和桔梗中提取的花青素，能夠通過NF-κB通路來抑制小鼠的炎癥[22]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，芍藥色素能夠下調(diào)T2DM合并NAFLD小鼠肝組織中p-IkB、p-p65的表達(dá)。提示芍藥色素可能通過NF-κB信號(hào)通路來調(diào)節(jié)炎癥因子的分泌，從而發(fā)揮抗炎作用。

表1 5組小鼠體質(zhì)量及血清生化指標(biāo)

組別體質(zhì)量/gTCTGFBG(mmol·L-1)ALTAST(U·L-1)FINS/(mU·L-1)正常對(duì)照組24.26±0.851.348±0.2131.215±0.1876.872±0.52626.427±4.56235.764±5.25912.457±1.036模型對(duì)照組28.85±1.18①6.351±0.383①5.126±0.284①18.326±0.463①215.295±11.231①184.672±9.247①21.879±2.367①芍藥色素 小劑量組26.95±1.29②4.264±0.227②3.569±0.246②13.245±0.387②95.478±5.893②87.882±6.721②17.478±1.875② 中劑量組26.37±1.56②3.112±0.217②2.958±0.273②12.458±0.318②81.342±6.775②75.354±5.732②15.578±1.679② 大劑量組25.23±1.24②2.876±0.258②2.536±0.263②11.182±0.357②76.788±5.421②66.544±6.825②15.268±1.327②

①與正常對(duì)照組比較，P<0.05；②與模型對(duì)照組比較，P<0.05。

①Compared with normal control group，P<0.05；②compared with model control group，P<0.05.

表2 5組小鼠血清炎癥因子水平

組別TNF-αIL-6正常對(duì)照組42.471±4.56824.513±3.376模型對(duì)照組235.665±9.823①125.788±7.633①芍藥色素 小劑量組82.364±5.679②68.385±5.234② 中劑量組75.324±4.236②58.572±4.281② 大劑量組71.677±4.163②53.321±4.782②

①與正常對(duì)照組比較，P<0.05；②與模型對(duì)照組比較，P<0.05。

①Compared with normal control group，P<0.05；②compared with model control group，P<0.05.

表3 5組小鼠肝組織氧化應(yīng)激水平

組別MDA/(μmol·g-1)SOD/(U·mg-1)正常對(duì)照組0.657±0.086203.451±9.245模型對(duì)照組2.135±0.321①115.267±6.274①芍藥色素 小劑量組1.467±0.224②128.356±3.679② 中劑量組1.235±0.189②142.379±4.127② 大劑量組1.187±0.143②164.587±4.398②

①與正常對(duì)照組比較，P<0.05；②與模型對(duì)照組比較，P<0.05。

①Compared with normal control group，P<0.05；②compared with model control group，P<0.05.

圖1 5組小鼠肝組織HE染色(×400)

①與模型對(duì)照組比較，P<0.01。

圖2 5組小鼠NF-κB蛋白活化水平

①Compared with model control group，P<0.01.

Fig.2TheproteinexpressionofNF-κBinfivegroupsofmice

綜上所述，芍藥色素對(duì)T2DM合并NAFLD小鼠具有抗炎、抗氧化、調(diào)節(jié)血糖和胰島素的作用，進(jìn)一步研究提示芍藥色素可能是通過NF-κB通路來發(fā)揮抗炎作用的。雖然目前的研究未能明確芍藥色素介導(dǎo)NF-κB通路的具體機(jī)制，但表明芍藥色素可能是治療T2DM合并NAFLD的一個(gè)潛在的藥物，作為常用的食品添加劑，芍藥色素在飲食和健康領(lǐng)域可以發(fā)揮更大的作用。