CLIA值對應(yīng)RPR滴度的ROC曲線分析及曲線擬合

滕 穎

天津市第二人民醫(yī)院檢驗(yàn)科 300192

梅毒是由蒼白密螺旋體(Treponema pallidum，TP)蒼白亞種引起的一種慢性系統(tǒng)性性傳播疾病，可引起人體多系統(tǒng)多器官的損害，產(chǎn)生多種臨床表現(xiàn)，導(dǎo)致組織破環(huán)，功能失常，甚至危及生命[1]。該疾病兼具有個(gè)人衛(wèi)生和公共衛(wèi)生的重要性，除了直接發(fā)病外，還會增加感染艾滋病毒的風(fēng)險(xiǎn)，并可能導(dǎo)致感染母親所生的兒童終身發(fā)病。如果不進(jìn)行治療，疾病可以經(jīng)過一系列臨床階段后最終導(dǎo)致不可逆的神經(jīng)或心血管并發(fā)癥[2]。WHO曾估計(jì)全球梅毒患病人數(shù)達(dá)到3 640萬，其中發(fā)病的人數(shù)達(dá)到1 060萬。

RPR技術(shù)現(xiàn)廣泛用于梅毒診斷和療效隨訪，其優(yōu)點(diǎn)是價(jià)格低廉、操作簡便，但RPR方法同時(shí)也存在一些缺點(diǎn)，如可由交叉反應(yīng)導(dǎo)致假陽性，在早期或一期梅毒中可由于前帶效應(yīng)出現(xiàn)假陰性。最重要的是人為主觀判定結(jié)果，操作者不同可引起結(jié)果判讀的差異。尤其在患者的長期治療過程中，極易由于操作人員前后不同導(dǎo)致結(jié)果判讀標(biāo)準(zhǔn)不盡相同進(jìn)而影響對療效的判斷。梅毒螺旋體化學(xué)發(fā)光免疫試驗(yàn) (Chemiluminescence immunoassay，CLIA)客觀性強(qiáng)且量化清晰，更適用于對梅毒的療效觀察。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2018年4月—2019年4月于本院就診的梅毒患者375例，所有納入者既往均經(jīng)RPR、CLIA、ELISA及TPPA等檢測確認(rèn)為梅毒感染，收集這些患者的RPR結(jié)果和CLIA結(jié)果進(jìn)行分析。

1.2 儀器與試劑 化學(xué)發(fā)光法采用美國雅培公司的ARCHITECT i2000SR全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光微粒子免疫分析儀，試劑為其配套Syphilis TP及相關(guān)校準(zhǔn)品、質(zhì)控品，快速血漿反應(yīng)素環(huán)狀卡片試驗(yàn)(RPR)試劑盒為上海實(shí)業(yè)科華生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 將RPR結(jié)果和CLIA結(jié)果進(jìn)行spearman相關(guān)性分析以確定RPR與CLIA是否有相同的變化趨勢。將CLIA檢測值依據(jù)RPR滴度不同分組進(jìn)行多組獨(dú)立樣本秩和檢驗(yàn)。以化學(xué)發(fā)光法檢測值為檢驗(yàn)變量，以RPR滴度從陽性無滴度至1∶32的各種滴度為狀態(tài)變量進(jìn)行ROC曲線分析和約登指數(shù)計(jì)算得出各種RPR滴度對應(yīng)的CLIA臨界值。以RPR滴度為橫坐標(biāo)，以CLIA檢測值為縱坐標(biāo)繪制散點(diǎn)圖并根據(jù)散點(diǎn)圖擬合出CLIA最優(yōu)曲線。所有數(shù)據(jù)采用SPSS25.0進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 經(jīng)spearman相關(guān)分析RPR滴度與CLIA檢測值正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)r=0.756，P<0.01。

2.2 經(jīng)Kruskal-Wallis分析，以RPR滴度分組，CLIA檢測值在不同組間分布不完全相同(P<0.01)。

2.3 經(jīng)ROC曲線分析及約登指數(shù)計(jì)算，將各RPR滴度對應(yīng)的化學(xué)發(fā)光法對應(yīng)臨界值匯總?cè)缦?見圖1～圖6及表1)，各臨界值具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖1 RPR陽性為治療標(biāo)準(zhǔn)的ROC曲線圖 圖2 RPR 1∶2為治療標(biāo)準(zhǔn)的ROC曲線圖 圖3 RPR 1∶4為治療標(biāo)準(zhǔn)的ROC曲線圖

圖4 RPR 1∶8為治療標(biāo)準(zhǔn)的ROC曲線圖 圖5 RPR 1∶16為治療標(biāo)準(zhǔn)的ROC曲線圖 圖6 RPR 1∶32為治療標(biāo)準(zhǔn)的ROC曲線圖

表1 各RPR滴度對應(yīng)的CLIA臨界值

注：RPR滴度表示以大于及等于該滴度作為治療標(biāo)準(zhǔn)。

2.4 曲線擬合選取R2最高的曲線為三次曲線，R2=0.695，F(xiàn)=281.805,P<0.01(見圖7)。

圖7 CLIA檢測值與RPR的散點(diǎn)圖及擬合曲線

3 討論

梅毒作為一種傳染性疾病，可累及多個(gè)器官，比如梅毒性心血管病，多在感染后10～25年開始出現(xiàn)心血管的臨床癥狀和體征，診斷很困難。臨床可有單純性主動(dòng)脈炎和繼發(fā)性主動(dòng)脈瓣關(guān)閉不全、冠脈口狹窄及主動(dòng)脈瘤等不同類型表現(xiàn)。梅毒性主動(dòng)脈炎是梅毒性心血管病最常見的表現(xiàn)[3]。張曉榮等證實(shí)即使RPR檢查陰性，如果檢查發(fā)現(xiàn)有升主動(dòng)脈增寬、主動(dòng)脈瓣關(guān)閉不全、主動(dòng)脈竇部增寬及冠狀動(dòng)脈口狹窄的表現(xiàn)，提示可能潛在梅毒性損害[4]。梅毒眼部表現(xiàn)同樣呈現(xiàn)多樣化，超過1/3患者有持續(xù)的視力異常，患有乳頭炎和視網(wǎng)膜炎可增加持續(xù)性視功能障礙的風(fēng)險(xiǎn)[5]。有學(xué)者指出早期神經(jīng)梅毒在原發(fā)感染后幾周到幾年中出現(xiàn)并進(jìn)展，并且主要涉及腦膜。綜合征包括梅毒性腦膜炎(通常伴有顱神經(jīng)病)，腦膜血管梅毒(伴有相關(guān)的缺血性中風(fēng))或無癥狀的神經(jīng)梅毒。同時(shí)該學(xué)者還認(rèn)為梅毒有助于HIV的傳播(反之亦然)，因此所有被診斷為梅毒的患者都應(yīng)接受HIV檢測[6]。Novikov YA等認(rèn)為在神經(jīng)梅毒患者中，無論是否存在臨床癥狀，腦脊液中IL-23和IL-12p40的水平均顯著超過無神經(jīng)系統(tǒng)特異性病變的患者[7]。梅毒還可引起膽管病變[8]、梅毒性肝炎[9]等。鑒于梅毒可引起多系統(tǒng)多器官的病變，中國疾病預(yù)防控制中心性病控制中心發(fā)布的梅毒感染診療指南中強(qiáng)調(diào)及早發(fā)現(xiàn)及治療后要經(jīng)過足夠時(shí)間的追蹤觀察[10]。

RPR檢驗(yàn)原理為梅毒螺旋體一旦感染人體，人體迅速對被損害的宿主細(xì)胞以及梅毒螺旋體細(xì)胞表面所釋放的類脂物質(zhì)作出免疫應(yīng)答，在3～4周產(chǎn)生抗類脂抗原的抗體(亦稱為反應(yīng)素)。這些抗體主要是IgG和IgM型混合抗體。RPR的優(yōu)勢在于價(jià)格低廉，操作簡單，抗原懸浮液穩(wěn)定，15min內(nèi)可完成檢測等。RPR的靈敏度取決于疾病階段，為73%～100%，特異性達(dá)98%[11]。血清稀釋按滴度判定，滴度越高，傳染性越強(qiáng)。

CLIA法是利用雙抗原夾心法化學(xué)發(fā)光免疫分析原理，采用梅毒螺旋體多種特異抗原包被固相發(fā)光微孔板，用辣根過氧化酶標(biāo)記相同蛋白抗原作為標(biāo)記抗原，與樣本中的梅毒螺旋體抗體形成雙抗原夾心復(fù)合物后，加入化學(xué)發(fā)光底物液，測定其發(fā)光值，根據(jù)閾值判定結(jié)果。CLIA操作自動(dòng)化，敏感性根據(jù)疾病分期為82%～100%,特異性99%[11],敏感性和靈敏性均略勝于RPR。CLIA較RPR更利于檢測流程標(biāo)準(zhǔn)化，結(jié)果判定客觀性更強(qiáng)，更利于量化每個(gè)患者數(shù)據(jù)的縱向比較，對治療效果的判讀具有一致性，不受操作人員的影響，還可應(yīng)用于大批量的檢測。

本次納入的樣本為根據(jù)PRP滴度選取，每個(gè)滴度選取標(biāo)本量相對較平均，現(xiàn)實(shí)標(biāo)本為低滴度的標(biāo)本多于高滴度的標(biāo)本，這和疾病本身分布以及治療后的血清固定有關(guān)。本次研究結(jié)果顯示CLIA和RPR呈正相關(guān)趨勢，兩者的相關(guān)系數(shù)為0.756，說明RPR滴度越高CLIA檢測值總體也越高，隨著RPR滴度的增加，CLIA的檢測值總體隨RPR增加呈增高的趨勢，同時(shí)兩者相關(guān)性較強(qiáng)。秩和檢驗(yàn)顯示以RPR滴度分組比較CLIA檢測值在不同組間分布不全相同，因此，將CLIA檢測值作為RPR的替代具備一定可行性，但具體是否RPR和CLIA結(jié)果之間有一一對應(yīng)的線性相關(guān)關(guān)系，進(jìn)而可完全取代RPR滴度測定，還是只在某些區(qū)段呈線性相關(guān)則需要接下來的ROC曲線分析和擬合曲線等統(tǒng)計(jì)方法論證。

目前臨床治療梅毒主要有3種結(jié)果即臨床治愈、血清固定和無效。主要采用RPR滴度作為指標(biāo)，RPR陽性則給予青霉素等藥物治療，臨床治愈指RPR轉(zhuǎn)為陰性，并且兩年內(nèi)持續(xù)觀察RPR為陰性；如規(guī)范抗梅毒治療后RPR降低并維持在較低滴度不再下降且無其他癥狀則為血清固定，RPR滴度不變甚至增高則為無效，需要下1個(gè)療程的治療。

從本文的統(tǒng)計(jì)結(jié)果可以看出，RPR陽性對應(yīng)的化學(xué)發(fā)光法臨界值為13.655。即CLIA檢測值高于13.655的患者可不再通過其他梅毒檢測進(jìn)行確診，此前楊華等也曾報(bào)告以陽性預(yù)測值≥95%為目標(biāo)，化學(xué)發(fā)光法篩查抗梅毒螺旋體抗體的復(fù)檢范圍S/Co比值設(shè)定為1.0～8.0，若S/Co比值≥8.1，可直接發(fā)出報(bào)告[12]。本文結(jié)果提示高于13.655表示需要給藥治療，或者已治療者排除了血清固定的情況下尚需要進(jìn)入下1個(gè)療程，如果CLIA檢測值長時(shí)間持續(xù)低于13.655，表示已臨床治愈，不再需要抗生素治療。本文的統(tǒng)計(jì)結(jié)果中對應(yīng)于RPR滴度1∶2、1∶4、1∶8、1∶16和1∶32的CLIA法臨界值依次為15.320、19.100、17.945、20.055和18.615?？梢钥闯?，雖然CLIA法臨界值大體上呈隨RPR滴度上升而上升的趨勢，但在1∶8及1∶32兩個(gè)滴度對應(yīng)的CLIA趨勢相反，雖然相反趨勢的變化幅度并不大，但對應(yīng)不同RPR滴度的CLIA檢測值已有交叉，在未進(jìn)行散點(diǎn)圖及曲線擬合情況下分析這一結(jié)果可能有兩個(gè)原因，一是RPR結(jié)果判定的主觀性影響，即對于相鄰結(jié)果的判定存在一定不確定性，這需要進(jìn)一步加大納入樣本量甚至明確指定檢驗(yàn)操作者來進(jìn)一步分析這種結(jié)果的倒錯(cuò)是否為主觀性影響；二是CLIA本身分布的類型問題，即CLIA檢測值和RPR滴度兩者間不是完全對應(yīng)的線性相關(guān)。秩和檢驗(yàn)后兩兩比較的結(jié)果也印證了這一點(diǎn)，并且這一推測在之后的曲線擬合中進(jìn)一步得到了印證，從散點(diǎn)圖即可看出RPR滴度和CLIA檢測值之間并不是線性趨勢，擬合出的最優(yōu)曲線為三次多項(xiàng)式曲線，即CLIA的分布為先升高之后下降后再上升，這和之前ROC曲線的結(jié)果相互對應(yīng)，即在RPR滴度低于1∶4之前RPR滴度和CLIA檢測值之間變化趨勢相同，高于1∶4之后兩者趨勢變化不盡相同，即以CLIA檢測值分辨RPR滴度高于1∶4的樣本時(shí)存在困難，目前臨床上對于血清固定的認(rèn)定基本不高于1∶8，但相對于更低滴度的血清固定來說，固定于1∶8的血清固定者較少，本文的CLIA法臨界值雖然如前述在1∶8上有所反復(fù)，但在RPR陽性至1∶4這一階段所對應(yīng)的CLIA法S/Co值與RPR滴度正相關(guān)的趨勢較好，即在臨床應(yīng)用中可滿足大部分血清固定者的判定。更為保守一點(diǎn)的判讀則可以將CLIA法S/Co值15.320以下，13.655以上的檢測值作為血清固定的判定指標(biāo)，此外，本文中RPR更高滴度(高于1∶32)的病例數(shù)據(jù)尚且較少，有可能CLIA值和RPR值的曲線關(guān)系比三次多項(xiàng)式曲線更為復(fù)雜，未來可進(jìn)一步收集高滴度病例以完善高滴度RPR與CLIA檢測值之間的對應(yīng)關(guān)系。

綜上所述，CLIA檢測值與RPR滴度的對應(yīng)關(guān)系為三次方曲線，CLIA檢測值總體隨RPR滴度增高有升高趨勢，但在某些滴度有部分倒錯(cuò)。CLIA檢測值高于13.655可不需要其他檢測方法驗(yàn)證而直接作為梅毒患者確診的指標(biāo)，13.655也可作為給藥和停藥的指標(biāo)，尚不能對RPR滴度始終高于1∶4的陽性患者的療效進(jìn)行判斷，治療后CLIA值介于13.655和15.320之間的病例可認(rèn)定為血清固定，CLIA方法在判斷滴度較低的血清固定病例有一定優(yōu)勢。以CLIA檢測值完全取代RPR滴度作為療效觀察尚需更多的依據(jù)。