唑尼沙胺對(duì)PS1/APP小鼠學(xué)習(xí)記憶功能和前額葉皮層中BDNF和TrkB的影響

周儒奎 劉晉芳 楊李旺 牛曉軍 儲(chǔ)開(kāi)博 武赟 翟曉艷

(山西中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，山西 晉中 030621)

阿爾茨海默病(AD)是一種在老年人群中經(jīng)常出現(xiàn)的神經(jīng)退行性疾病，其主要的臨床特征是漸進(jìn)性發(fā)展的認(rèn)知功能障礙，特別是進(jìn)行性記憶功能受損，最終導(dǎo)致癡呆〔1〕。腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)是一種對(duì)學(xué)習(xí)和記憶功能極其重要的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子〔2〕，通過(guò)連接它的主要受體酪氨酸激酶受體(Trk)B在神經(jīng)元的生長(zhǎng)、生存、分化過(guò)程中發(fā)揮重要作用，維持神經(jīng)元的正常功能和突觸可塑性，從而維護(hù)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的正常功能，而在AD患者大腦皮層和海馬中BDNF和TrkB的表達(dá)減少，參與了AD的記憶功能缺陷病理機(jī)制中〔3，4〕。

唑尼沙胺(ZNS)可以通過(guò)血腦屏障到達(dá)神經(jīng)系統(tǒng)，一直以來(lái)作為一種抗癲癇的藥物來(lái)使用并且沒(méi)有什么副作用〔5〕，同時(shí)ZNS可以改善帕金森病患者的主要癥狀〔6〕。研究表明ZNS可以通過(guò)抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的活性和抗氧化作用起到神經(jīng)保護(hù)作用〔7〕，在周?chē)窠?jīng)損傷研究中發(fā)現(xiàn)，ZNS可以通過(guò)促進(jìn)BDNF和TrkB的表達(dá)，來(lái)促進(jìn)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元神經(jīng)突伸長(zhǎng)和軸突的再生〔8〕。目前關(guān)于ZNS對(duì)AD中BDNF和TrkB的變化調(diào)節(jié)來(lái)改善學(xué)習(xí)記憶功能的研究國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)擬觀察對(duì)PS1/APP小鼠學(xué)習(xí)記憶功能和前額葉皮質(zhì)BDNF和TrkB的影響，探討ZNS在AD治療中的可能作用及作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1材料 Morris水迷宮設(shè)備(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院研制)；ZNS(TCI上?；捎邢薰?；綿羊多克隆BDNF抗體、兔多克隆TrkB體(Abcam司)，小鼠多克隆GAPDH抗體(中杉金橋公司)，HRP標(biāo)記兔抗綿羊IgG(康維生物公司)，HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG(中杉金橋公司)，蛋白酶抑制劑(Sigma-Aldrich公司)，蛋白裂解液、BCA試劑盒、ECL Plus發(fā)光液(碧云天生物公司)，DAB染色劑(中杉金橋生物公司)。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 PS1/APP雙轉(zhuǎn)基因小鼠14只和野生C57L/6J小鼠7只，體重20～30 g，6月齡，小鼠飼養(yǎng)在24℃左右通風(fēng)良好的房間，維持相對(duì)濕度在60%左右，每天12 h光照環(huán)境，給予清潔的飲水和飼料，14只PS1/APP小鼠隨機(jī)平均分為兩組，分別為生理鹽水(PS1/APP-veh)組、ZNS(PS1/APP-ZNS)組，7只野生C57/BL6J小鼠作為野生生理鹽水(WT-veh)組，給藥采取腹腔注射，分別每天注射20 mg/kg生理鹽水、20 mg/kg ZNS、20 mg/kg生理鹽水，所有小鼠加藥4 w。

1.3Morris水迷宮行為學(xué)測(cè)試

1.3.1定位航行實(shí)驗(yàn) 在加藥4 w后，利用水迷宮評(píng)估小鼠的空間記憶，先做定位航行試驗(yàn)測(cè)試，其中環(huán)狀水池，黑色，水池劃分為四個(gè)象限，在第二象限放置直徑為8 cm的平臺(tái)，注水，將水溫調(diào)節(jié)在(24±1)℃，使水位高于平臺(tái)2 cm。設(shè)置每次檢測(cè)的時(shí)間為60 s，小鼠放入水中時(shí)，面向箱壁邊緣，60 s內(nèi)讓小鼠在水下尋找平臺(tái)，當(dāng)小鼠尋找到平臺(tái)并在平臺(tái)逗留超過(guò)2 s后，錄像自動(dòng)停止，記錄下每只小鼠的潛伏期時(shí)間(從入水至停留到平臺(tái)的時(shí)間)，當(dāng)小鼠在水下尋找平臺(tái)時(shí)間超過(guò)60 s時(shí)，人為地引領(lǐng)小鼠至平臺(tái)，繼續(xù)讓小鼠在平臺(tái)上逗留大約10 s，記錄時(shí)間為60 s。每天讓每只小鼠先后依次從劃分的四個(gè)象限固定位置入水，持續(xù)5 d，撤去平臺(tái)。

1.3.2空間探索實(shí)驗(yàn) 第6天測(cè)試時(shí)，從水迷宮中取出水下的平臺(tái)，讓小鼠從第四象限入水，讓其在水中游泳60 s，記錄小鼠游過(guò)原先放置平臺(tái)位置的次數(shù)。

1.4免疫組化檢測(cè)BDNF和TrkB在前額葉的表達(dá) 各組小鼠10%水合氯醛腹腔注射麻醉，左心室注射4%多聚甲醛灌流固定，取出腦組織，放于4%的多聚甲醛中過(guò)夜固定，再依次用20%蔗糖溶液、25%蔗糖溶液、30%蔗糖溶液處理后，使用恒冷冰凍切片機(jī)切片，厚度為7 μm，切好的冰凍切片置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆?。切片在室溫放? h，用過(guò)氧化物酶室溫孵育10 min，用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗3次；分別用兔血清和山羊血清孵育各組切片15 min，棄血清，滴加羊BDNF抗體和兔TrkB抗體，濃度均為1∶100，4℃過(guò)夜；次日PBS洗3次，各組切片分別滴加辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的兔抗羊二抗和羊抗兔二抗，室溫孵育15 min，PBS洗3次，滴加生物鏈霉素，室溫孵育15 min；二氨基連苯胺(DAB)呈色，PBS水洗，常規(guī)脫水、透明，用中性樹(shù)膠封片。

1.5Western印跡檢測(cè)BDNF和TrkB在前額葉皮層的表達(dá) 各組小鼠腹腔注射10%水合氯醛麻醉，小鼠斷頭取腦，分離出前額葉皮層；將前額葉皮層置于裝有蛋白裂解酶和蛋白酶抑制劑的離心管中，超聲粉碎后放于4℃過(guò)夜，次日4℃ 12 000 r/min離心30 min，取上清；二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量；煮樣，分裝、-80℃凍存?zhèn)溆?；等量樣品加入?%十二烷基硫酸鈉(SDS)凝膠中，轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯 (PVDF) 膜，將膜放入5%小牛血清(BSA)封閉2 h后，按蛋白分子量裁膜，加入1∶1 000稀釋的兔多克隆TrkB抗體、1∶2 000稀釋的羊多克隆BDNF、1∶2 000稀釋的兔多克隆GAPDH，放于4℃冰箱過(guò)夜，TBST洗膜后，加入相應(yīng)經(jīng)稀釋1∶5 000 HRP標(biāo)記的羊抗兔免疫球蛋白(Ig)G和兔抗羊IgG，37℃孵箱孵育2 h后，TBST洗膜，經(jīng)電化學(xué)發(fā)光(ECL)，Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)采圖，Image J軟件分析。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS22.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)，方差分析。

2 結(jié) 果

2.1Morris水迷宮行為學(xué)測(cè)試結(jié)果 在定位航行試驗(yàn)中，隨著訓(xùn)練次數(shù)增加，各組小鼠找到水下平臺(tái)的時(shí)間縮短，PS1/APP-veh組小鼠較WT-veh組小鼠需消耗更長(zhǎng)時(shí)間找到水下平臺(tái)(P<0.05)；PS1/APP-ZNS組較PS1/APP組小鼠找到水下平臺(tái)的時(shí)間縮短(P<0.05)；空間探索試驗(yàn)中，PS1/APP-veh組小鼠較WT-veh組小鼠穿越原平臺(tái)位置次數(shù)減少(P<0.05)；PS1/APP-ZNS組小鼠較PS1/APP-veh組小鼠穿越原平臺(tái)位置次數(shù)增加(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組不同時(shí)間水迷宮行為學(xué)測(cè)試結(jié)果比較

與WT-veh組比較：1)P<0.05；與PS1/APP-veh組比較：2)P<0.05，下表同

2.2免疫組化分析BDNF蛋白和TrkB蛋白在前額葉皮層的表達(dá) 鏡下觀察到WT-veh組前額葉區(qū)BDNF和TrkB陽(yáng)性反應(yīng)產(chǎn)物呈棕褐色，與WT-veh組相比，PS1/APP-veh組BDNF和TrkB陽(yáng)性反應(yīng)產(chǎn)物著色變淺，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)減少，積分光密度明顯減少(P<0.05)；與PS1/APP-veh組相比，PS1/APP-ZNS組BDNF和TrkB的陽(yáng)性反應(yīng)產(chǎn)物變深，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)增多，積分光密度明顯增多(P<0.05)。該實(shí)驗(yàn)證實(shí)PS1/APP小鼠較正常小鼠前額葉皮層中出現(xiàn)BDNF和TrkB水平的下降，注射ZNS可以促進(jìn)PS1/APP小鼠前額葉皮層中BDNF和TrkB的表達(dá)。見(jiàn)圖1，表2。

箭頭表示陽(yáng)性細(xì)胞圖1 各組前額葉中BDNF與TrkB的表達(dá)(免疫組化，×200)

表2 各組前額葉中BDNF與TrkB積分光密度比較

2.3Western印跡方法觀察前額葉皮層BDNF蛋白和TrkB蛋白表達(dá) PS1/APP-veh組較WT-veh組前額葉皮層中BDNF和TrkB水平減少(P<0.05)，PS1/APP-ZNS組較PS1/APP-veh組前額葉皮層中BDNF和TrkB水平增多(P<0.05)。該實(shí)驗(yàn)也證實(shí)PS1/APP小鼠中較正常小鼠前額葉皮層中BDNF和TrkB水平的下降，注射ZNS可以促進(jìn)PS1/APP小鼠前額葉皮層中BDNF和TrkB的表達(dá)。見(jiàn)表3，圖2。

1～3：WT-veh組、PS1/APP-veh組、PS1/APP-ZNS組圖2 Western印跡顯示各組前額葉中BDNF和TrkB的表達(dá)

表3 各組前額葉中BDNF與TrkB蛋白表達(dá)比較

3 討 論

AD主要的表現(xiàn)是學(xué)習(xí)記憶功能衰退和其他認(rèn)知能力的下降，并且病人通常伴有一定程度的精神和行為障礙〔9〕。PS1/APP小鼠能夠模擬AD的主要病理生理機(jī)制，出現(xiàn)相似的學(xué)習(xí)記憶功能障礙等癥狀，是公認(rèn)的比較好的AD模型〔10〕。

ZNS主要通過(guò)抑制鈉離子通道和T型鈣通道、間接抑制谷氨酸受體的活性從而增強(qiáng)抑制型神經(jīng)遞質(zhì)γ-氨基丁酸(GABA)的釋放來(lái)起到抗癲癇的作用〔11〕，在帕金森病中ZNS可以對(duì)多巴胺細(xì)胞起到神經(jīng)保護(hù)作用〔12，13〕，在腦損傷中ZNS也可以起到神經(jīng)保護(hù)的作用〔14〕，在周?chē)窠?jīng)損傷研究中發(fā)現(xiàn)，ZNS可以通過(guò)促進(jìn)BDNF和TrkB的表達(dá)來(lái)促進(jìn)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元神經(jīng)突伸長(zhǎng)和軸突的再生〔15〕。

在大腦發(fā)育過(guò)程中，BDNF作為一種生長(zhǎng)因子，能夠促進(jìn)神經(jīng)元突觸中軸突、樹(shù)突的生長(zhǎng)和成熟，有利于增強(qiáng)突觸的可塑性，在學(xué)習(xí)和記憶過(guò)程中起到重要的促進(jìn)作用〔16〕。BDNF通過(guò)與TrkB作用，激活三大信號(hào)通路，包括增殖蛋白激酶-細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(MEKs-ERK)、磷酯酶Cγ1-三磷酸肌醇/二酰基甘油(PLCγ1-IP3/DAG)和磷脂?；技っ?蛋白激酶B(PI3K-Akt)通路，這些通路對(duì)突觸生長(zhǎng)和突觸的可塑性有重要作用〔17，18〕。BDNF通過(guò)增加神經(jīng)元樹(shù)突棘的數(shù)目和大小促進(jìn)軸突的形成，BDNF與TrkB結(jié)合，可以激活ERK和PI3K途徑，促進(jìn)突觸相關(guān)蛋白突觸小泡蛋白(SYP)、生長(zhǎng)相關(guān)蛋白(GAP)-43和突觸后致密蛋白(PSD)95的表達(dá)〔19〕。Marchetti〔20〕認(rèn)為BDNF和TrkB的減少會(huì)降低突觸可塑性，損傷神經(jīng)元，是前額葉皮層和海馬退行性變化的主要原因。前額葉皮層是人類(lèi)大腦高級(jí)認(rèn)知活動(dòng)相關(guān)的關(guān)鍵區(qū)域，在注意力、情緒調(diào)節(jié)、學(xué)習(xí)記憶過(guò)程和思維推理中起重要作用〔21〕。向AD小鼠模型注入BDNF可以改善前額葉皮層和海馬的退行性變化和改善其學(xué)習(xí)和記憶功能〔22〕。

本研究結(jié)果表明ZNS可以通過(guò)促進(jìn)前額葉皮層內(nèi)BNDF和TrkB的表達(dá)，有利于突觸相關(guān)蛋白的表達(dá)和增強(qiáng)突觸的可塑性，從而改善PS1/APP小鼠中的學(xué)習(xí)和記憶功能。