肺腺癌關(guān)鍵基因的生物信息學(xué)研究

劉冬琦，竇涪琳，楊曉東*

(1.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院，吉林 長春130033；2.山東大學(xué)第二醫(yī)院，山東 濟(jì)南250033)

肺癌是世界上發(fā)病率和致死率最高的惡性腫瘤，肺腺癌(LUAD)目前已成為肺癌中最主要的病理類型，占所有肺癌患者的80%-85%[1]。盡管早期診斷和治療方法取得了顯著進(jìn)展，但5年相對總生存率(OS)仍低于20%[2]。對于不能手術(shù)的癌癥患者和手術(shù)患者，化療仍然是最重要的輔助治療，然而，藥物不良反應(yīng)及耐藥性制約著化療的最終效果。因此，迫切需要新的策略來補(bǔ)充傳統(tǒng)的化療[3]。在過去的幾十年里，我們通過基因組學(xué)提高了對癌癥分子特征的認(rèn)知。晚期非小細(xì)胞肺癌的治療策略已經(jīng)從傳統(tǒng)的基于組織病理學(xué)的化療轉(zhuǎn)變?yōu)榛谥掳┮蛩氐膫€體化精確治療[4]。雖然發(fā)現(xiàn)的生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)對LUAD的診斷和治療做出了巨大貢獻(xiàn)，但由于LUAD的生物學(xué)復(fù)雜性和較差的預(yù)后，迫切需要更多的遺傳信息，以提供精確醫(yī)療的參考[5]。為了探索與癌癥相關(guān)的常見生物標(biāo)志物和用于癌癥治療、診斷和預(yù)后的直接藥物，近年來各國學(xué)者發(fā)布了諸多的癌癥基因芯片和高通量測序數(shù)據(jù)[6-9]。同時，為了克服不同技術(shù)平臺或小樣本應(yīng)用帶來的局限性，生物信息學(xué)方法被廣泛應(yīng)用于癌癥相關(guān)領(lǐng)域研究，發(fā)現(xiàn)了大量有價(jià)值的生物信息[10-12]。

應(yīng)用GSE33532、GSE40791和GSE19188的基因芯片數(shù)據(jù)，利用生物信息學(xué)方法識別LUAD組織與正常組織之間的差異表達(dá)基因(DEGs)。此外，還建立了1354個hub基因和3個核心模塊的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)。同時，通過Kaplan-Meier Plotter在線數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)NSCLC中有8個與OS相關(guān)的基因。此外，還對DEGs進(jìn)行了富集分析。本研究旨在從新的角度識別與NSCLC發(fā)病和預(yù)后相關(guān)的關(guān)鍵基因。

1 材料方法

1.1 數(shù)據(jù)獲取

我們在基因表達(dá)綜合數(shù)據(jù)庫(GEO，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/GEO)篩選出GPL570數(shù)據(jù)集中包含肺腺癌樣本及正常組織樣本的基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)(GSE33532、GSE40791、GSE19188、GSE31548、GSE43458)，在R軟件(3.5.2版，https://www.R-project.org/)環(huán)境下，使用affy/ affyPLM軟件包生成各個基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)的RNA降解圖，篩選5’-3’逐漸升高的數(shù)據(jù)。最終3個表達(dá)譜數(shù)據(jù)納入研究(GSE33532、GSE40791、GSE19188)。

所有數(shù)據(jù)都是基于Affymetrix人類基因組U133 Plus 2.0基因芯片，包含共計(jì)364例樣本被納入本項(xiàng)研究，其中包含179例肺腺癌樣本和185例正常肺組織樣本。

1.2 基因芯片數(shù)據(jù)分析

在R軟件(3.5.2版，https://www.R-project.org/)環(huán)境下，使用affy軟件包對數(shù)據(jù)預(yù)處理和識別、預(yù)處理和規(guī)范化。使用Limma包對每個GEO數(shù)據(jù)集的矩陣數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化和log2轉(zhuǎn)換，每個基因芯片中的差異表達(dá)基因也由Limma 包進(jìn)行篩選。|log2FC|≥2、調(diào)整P值<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.3 基因本體(GO)和京都基因與基因組百科全書(KEGG)富集分析

DAVID數(shù)據(jù)庫(The Database for Annotation,Visualization and Integrated Discovery，https://david-d.ncifcrf.gov/home.jsp)是一個強(qiáng)大的基因功能分析工具，可對DEGs的GO進(jìn)行注釋及富集分析，去研究DEGs的生物功能，包括生物過程(BP)、分子功能(MF)和細(xì)胞成分(CC)。KEGG(https://www.kegg.jp/)可用于通路分析。P<0.05為存在顯著性差異。

1.4 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和模塊分析

STRING數(shù)據(jù)庫(STRING，https://string-db.org/)是一個探索PPI的在線工具。從STRING數(shù)據(jù)庫中獲得DEGs中的PPI信息，使用Cytoscape 3.7.1軟件進(jìn)一步構(gòu)建。使用軟件中的cytoHubba模塊對所有DEGs進(jìn)行篩選，并根據(jù)Degree進(jìn)行排序，篩選出排名前十的基因作為核心基因(Hub genes)，應(yīng)用MCODE插件篩選出評分均>10的模塊。并以各模塊DEGs為基礎(chǔ)進(jìn)行KEGG富集分析。P<0.05存在顯著性差異。

1.5 數(shù)據(jù)驗(yàn)證

基因表達(dá)譜交互分析(GEPIA)是一個在線網(wǎng)絡(luò)工具，可以對癌癥基因組圖譜(TCGA)和基因型組織表達(dá)(GTEx)的腫瘤和正常數(shù)據(jù)進(jìn)行基因表達(dá)分析，并將結(jié)果繪制成箱線圖，我們可以在該網(wǎng)站調(diào)取Hub genes在LUAD組織中的表達(dá)情況來驗(yàn)證本研究數(shù)據(jù)的可靠性和重復(fù)性。

1.6 Hub genes的生存分析

生存曲線庫 (K-M plotter，http://kmplot.com/)是一個在線數(shù)據(jù)庫，基于GEO、TCGA數(shù)據(jù)庫，分析腫瘤中某特定基因與死亡時間的關(guān)系，結(jié)果以95%置信區(qū)間和危險(xiǎn)比來表示。本研究對Hub genes在肺腺癌中預(yù)后預(yù)測價(jià)值進(jìn)行了分析。

2 結(jié)果

2.1 差異基因

在GEO數(shù)據(jù)庫GPL570數(shù)據(jù)平臺中選取的5個包含肺腺癌及正常肺組織基因芯片的數(shù)據(jù)集，并根據(jù)RNA降解情況(圖1)選取了其中3個(GSE33532、GSE40791、GSE19188)共計(jì)364例樣本被納入本項(xiàng)研究，并對其中179例LUAD和185例正常肺組織進(jìn)行了分析，共篩選出1354個DEGs(938個下調(diào)基因及416個上調(diào)基因)，見圖2。

2.2 差異基因的生物學(xué)功能注釋

為了進(jìn)一步了解差異基因的功能，應(yīng)用DAVID數(shù)據(jù)庫確定其GO分類及途徑。結(jié)果表明，BP方面，下調(diào)的DEGs主要聚類于細(xì)胞黏附、生物附著、血管生成等，上調(diào)的DEGs主要聚類于M期、凋亡、細(xì)胞核分裂等。在分子功能方面，下調(diào)的DEGs主要聚類于碳水化合物結(jié)合、生長因子結(jié)合、結(jié)合方式等，上調(diào)的DEGs主要聚類于抗原結(jié)合、微管主動運(yùn)動、金屬內(nèi)肽酶活性等。細(xì)胞成分分析結(jié)果顯示，上調(diào)的DEGs主要聚類于紡綞體、染色體、濃縮染色體等，下調(diào)的DEGs主要聚類于細(xì)胞外、細(xì)胞膜，見圖2。

2.3 DEGs的KEGG途徑分析

如圖3所示，上調(diào)的DEGs在細(xì)胞周期、p53信號通路、細(xì)胞外基質(zhì)受體相互作用、卵母細(xì)胞減數(shù)分裂等通路中顯著聚集。下調(diào)的DEGs主要富集于細(xì)胞黏附分子、血管平滑肌收縮、補(bǔ)體途徑、黏著等。

圖1 RNA降解圖

圖2 DEGs的GO及KEGG富集分析

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)分析

在SRTING數(shù)據(jù)庫的基礎(chǔ)上，用Cytoscape軟件構(gòu)建出的蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)，包含817個節(jié)點(diǎn)和5557條連線(圖4)，應(yīng)用cytoHubba模塊根據(jù)Degree篩選出前八個基因作為hubgenes，分別為CDK1、CDC20、CCNA2、CCNB1、BUB1、CCNB2、TOP2A及AURKB。應(yīng)用MCODE插件共檢測到3個評分>10的模塊，對以上模塊進(jìn)行富集分析，其各自主要聚集途徑這八個hub genes均在LUAD中高表達(dá)，且均在第一個模塊內(nèi)聚集(圖5)。

圖3 KEGG 富集分析

2.5 數(shù)據(jù)驗(yàn)證

應(yīng)用GEPIA篩選了LUAD組織和正常組織之間的hub基因表達(dá)水平，圖6反映了與正常組織相比，這8個基因在LUAD組織中的表達(dá)水平顯著增高。

圖4 PPI網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)圖，藍(lán)色為上調(diào)基因，紅色為下調(diào)基因

圖5 三個核心模塊及其KEGG富集情況

圖6 hub genes在LUAD的表達(dá)情況

2.6 hub基因的預(yù)后價(jià)值

本研究采用K-M Plotter評價(jià)8個hub基因的預(yù)后預(yù)測價(jià)值。肺腺癌患者的總生存率是根據(jù)每個基因的高表達(dá)和低表達(dá)來計(jì)算的。腺癌患者中CDK1、CDC20、CCNA2、CCNB1、BUB1、CCNB2、TOP2A及AURKB高表達(dá)者OS更差，見圖7。

圖7 hub genes相關(guān)生存曲線

3 討論

目前，肺腺癌已成為肺癌的最主要類型，然而，其發(fā)生和發(fā)展的潛在分子機(jī)制仍未充分闡明。本研究采用生物信息學(xué)方法預(yù)測肺癌的潛在治療和預(yù)后評估靶點(diǎn)，并探討肺癌可能的分子機(jī)制。本研究共篩選出1354個差異基因，其中938個下調(diào)基因，416個上調(diào)基因，通過構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)和富集分析，結(jié)合生存分析結(jié)果，共篩選出8個過表達(dá)關(guān)鍵基因CDK1、CDC20、CCNA2、CCNB1、BUB1、CCNB2、TOP2A及AURKB。在生物過程方面，下調(diào)的DEGs主要聚類于細(xì)胞黏附、生物附著、血管生成等，上調(diào)的DEGs主要聚類于M期、凋亡、細(xì)胞核分裂等，這與以前的認(rèn)識一致，即細(xì)胞周期和細(xì)胞增殖調(diào)節(jié)因子的功能缺陷是腫瘤發(fā)生和發(fā)展的主要原因。根據(jù)Cavallaro等學(xué)者[13]的研究，細(xì)胞黏附分子表達(dá)的改變可以影響細(xì)胞的黏附功能、細(xì)胞的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)狀態(tài)、細(xì)胞與環(huán)境的相互作用，并在腫瘤的進(jìn)展、侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。我們的結(jié)果提示，這些上調(diào)和下調(diào)的DEGs參與了這些BP，可能在NSCLC的進(jìn)展中起重要作用。

本結(jié)果顯示這8個過表達(dá)的hub genes 均與模塊1相關(guān)，模塊1在細(xì)胞周期途徑中富集。表明這些基因均參與了細(xì)胞周期途徑，并在癌癥發(fā)展中發(fā)揮了重要的作用。

CDC20作為一種調(diào)節(jié)蛋白，在細(xì)胞周期的多個點(diǎn)上與其他幾種蛋白質(zhì)相互作用，它需要兩個微管依賴的過程，后期的核運(yùn)動和染色體分離。CDC20的高表達(dá)可預(yù)測肺癌患者甚至肺腺癌患者的預(yù)后不良[14]。CDC20的高表達(dá)與肺癌以外的許多癌癥的預(yù)后不良相關(guān)，并且與腫瘤分級和分期相關(guān)[15]。

CCNB1作為參與有絲分裂的關(guān)鍵調(diào)控蛋白，在細(xì)胞周期G2/M轉(zhuǎn)換中起著重要作用。Soria等人[16]的工作建立了CCNB1在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)。結(jié)果表明，不同亞型的NSCLC不僅在生物學(xué)上存在差異，而且在CCNB1表達(dá)上也存在差異。在所檢測的所有病理性分型中，CCNB1在鱗狀細(xì)胞癌(SCC)中的過表達(dá)更為常見。這種過表達(dá)也會影響患者的生存時間，并可能成為SCC患者的不良預(yù)后標(biāo)志物。細(xì)胞周期蛋白A2(CCNA2)是哺乳動物A型細(xì)胞周期蛋白家族中的一員。CCNA2控制細(xì)胞周期的G1/S和G2/M轉(zhuǎn)換。在乳腺癌、肝癌、前列腺癌和肺癌等多種腫瘤中發(fā)現(xiàn)其蛋白表達(dá)升高，并可能成為預(yù)測生存率或早期復(fù)發(fā)的預(yù)后指標(biāo)[17]。

Ⅱ型拓?fù)洚悩?gòu)酶包含兩種同工酶：TOP2A和TOP2B。在多種癌癥中均檢測到TOP2A的高表達(dá)，更重要的是TOP2A已成為公認(rèn)的可用于臨床中的癌癥靶點(diǎn)。在乳腺癌、頭頸部鱗狀細(xì)胞癌和非小細(xì)胞肺癌，TOP2A在中、低分化腫瘤中的表達(dá)明顯高于高分化腫瘤。TOP2A在NSCLC組織中的高表達(dá)水平與腫瘤的增殖、侵襲等惡性生物學(xué)行為密切相關(guān)，對TOP2A表達(dá)的干擾也可以抑制NSCLC細(xì)胞的增殖和侵襲[18]。

BUB1編碼一種通過磷酸化有絲分裂啟動子復(fù)合體的成員并激活紡錘體啟動子而在有絲分裂中起無中心作用的堿/蘇氨酸蛋白激酶。該基因的異常表達(dá)和突變與非整倍體和多種癌癥有關(guān)。迄今為止，越來越多的證據(jù)表明，BUB1在各種癌癥(包括胰腺癌和胃癌)中顯著過表達(dá)與不良預(yù)后相關(guān)[19,20]。BUB1在不同類型癌癥中不同作用的一個原因可能是不同的表達(dá)水平。然而，在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)BUB1在LUAD中顯著過表達(dá)，并與腫瘤不良預(yù)后相關(guān)，表明BUB1可能在LUAD的發(fā)生和發(fā)展中起作用。

AURKB是編碼絲氨酸/蘇氨酸激酶亞家族的一個成員，參與有絲分裂和減數(shù)分裂過程中染色體排列和分離的調(diào)節(jié)。已有研究證實(shí)，通過抑制AURKB，人肺癌細(xì)胞具有抗腫瘤和放射增敏作用[21]。

此外，我們研究的Kaplan-Meier繪圖儀生存分析表明，這8個hub基因的mRNA表達(dá)水平與肺癌的臨床預(yù)后顯著相關(guān)。雖然這些可能暗示了它們在NSCLC進(jìn)展中的作用，從而使它們成為NSCLC診斷和治療的潛在靶點(diǎn)，但仍有必要對每個hub基因及其亞型的臨床意義進(jìn)行進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

與以往的研究相比，本研究整合了來自多個數(shù)據(jù)集的相對較大樣本量的基因芯片數(shù)據(jù)，并通過RNA降解圖篩選出了質(zhì)量較高的幾組數(shù)據(jù)進(jìn)行研究，結(jié)果可信度更高。雖然本研究通過生物信息分析，篩出了肺腺癌潛在的診斷和預(yù)后生物標(biāo)志物，但結(jié)論仍有待于相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)證實(shí)。