錯(cuò)配修復(fù)蛋白和p53蛋白在結(jié)直腸癌中的表達(dá)及其臨床意義

劉菊林 李 靜 陳 軍 盧國豐 王紅霞 楊 榮

上海健康醫(yī)學(xué)院附屬嘉定區(qū)中心醫(yī)院病理科(201800)

背景：研究表明，結(jié)直腸癌的主要發(fā)病途徑有兩條，即染色體不穩(wěn)定性途徑和微衛(wèi)星不穩(wěn)定性(MSI)途徑。目的：探討錯(cuò)配修復(fù)蛋白(MMRP)和p53蛋白在結(jié)直腸癌中的表達(dá)及其臨床意義。方法：采用免疫組化SP法檢測2013年1月—2017年12月上海市嘉定區(qū)中心醫(yī)院收治的276例結(jié)直腸癌中4種MMRP和p53蛋白表達(dá)，并分析其與臨床病理特征的關(guān)系。分析MSI對結(jié)直腸癌患者生存情況的影響。結(jié)果：MMRP表達(dá)缺失36例(13.0%)，MSI與組織病理學(xué)類型、TNM分期和血吸蟲感染有關(guān)(P<0.05)，而與患者性別、年齡、發(fā)病部位、分化程度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均無關(guān)(P>0.05)。p53蛋白在結(jié)直腸癌中的陽性表達(dá)率為44.9%，其表達(dá)與組織病理學(xué)類型、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和血吸蟲感染有關(guān)(P<0.05)，而與患者性別、年齡、發(fā)病部位和分化程度均無關(guān)(P>0.05)。MSI與p53表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.169，P<0.05)。MSI組和MSS組的1、3、5年生存率分別為100%、97.2%、83.1%和96.7%、81.9%、38.9%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=12.582，P=0.001)。結(jié)論：MSI和p53表達(dá)與結(jié)直腸癌的臨床病理特征關(guān)系密切，對腫瘤的惡性程度和預(yù)后的判斷有指導(dǎo)意義。MSI與p53表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，提示兩者可能參與結(jié)直腸癌不同階段的發(fā)生、發(fā)展過程。

全球范圍內(nèi)結(jié)直腸癌(colorectal cancer, CRC)的發(fā)病率較高，生存率較低，是嚴(yán)重危害人類健康的疾病之一[1]。近年來我國CRC的發(fā)病率呈逐年上升趨勢，且趨于年輕化[2]。隨著分子檢測技術(shù)的快速發(fā)展，已證實(shí)CRC的發(fā)病主要有兩種途徑：一條是以癌基因和抑癌基因?yàn)榇淼娜旧w不穩(wěn)定性途徑，如癌基因KRAS、BRAF、PIK3等，以及抑癌基因TP53、APC、DPC4等；另一條是因錯(cuò)配修復(fù)基因突變失活或甲基化失活導(dǎo)致的微衛(wèi)星不穩(wěn)定性(microsatellite instability, MSI)途徑，約15%的CRC與MSI相關(guān)[3-5]。錯(cuò)配修復(fù)蛋白(mismatch repair protein, MMRP)(包括MLH1、MSH2、MSH6、PMS2)失活將引起DNA錯(cuò)配積聚，導(dǎo)致MSI[6]。在CRC的發(fā)病機(jī)制中，關(guān)于MMRP和p53蛋白表達(dá)關(guān)系的報(bào)道較少見。本研究通過檢測CRC患者中MMRP和p53蛋白的表達(dá)，并分析其與臨床病理特征之間的關(guān)系，旨在探究CRC的分子發(fā)病機(jī)制，從而為臨床的精準(zhǔn)治療和預(yù)后判斷提供理論依據(jù)。

材料與方法

一、臨床資料

回顧性分析2013年1月—2017年12月上海市嘉定區(qū)中心醫(yī)院存檔的276例行手術(shù)切除且有完整臨床信息和隨訪資料的CRC標(biāo)本。其中男性158例，女性118例；平均年齡(64.28±5.69)歲；組織學(xué)類型為腺癌206例，黏液腺癌70例；高分化腺癌30例，中分化腺癌166例，低分化腺癌80例。TNM分期(2017版AJCC)Ⅰ+Ⅱ期160例，Ⅲ期+Ⅳ期116例；伴有血吸蟲感染者66例。每例標(biāo)本HE切片均經(jīng)兩位高年資病理醫(yī)師獨(dú)立閱片，參照WHO(2010)消化系統(tǒng)腫瘤進(jìn)行分類。所有病例術(shù)前均無化療、放療和免疫治療史。通過門診、住院復(fù)診和電話方式對納入患者進(jìn)行隨訪，隨訪截止時(shí)間為2019年1月。

二、方法

納入標(biāo)本以中性甲醛溶液固定，常規(guī)脫水、石蠟包埋，4 μm厚連續(xù)切片，分別進(jìn)行HE染色和免疫組化染色。免疫組化染色采用SP法。所有抗體、試劑盒和顯色劑均為福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司產(chǎn)品。應(yīng)用3% H2O2去除內(nèi)源性過氧化物酶活性，高溫高壓修復(fù)抗原，加入即用型MLH1、MSH2、MSH6、PMS2和p53抗體，DAB顯色，蘇木素復(fù)染。檢測過程中設(shè)立陽性對照和陰性對照。

結(jié)果判斷：MMRP在細(xì)胞核中呈明確棕黃色判定為陽性，任何比例的腫瘤細(xì)胞陽性均視為陽性，與核染色程度以及陽性細(xì)胞彌漫或局灶分布無關(guān)。細(xì)胞核不著色判斷為陰性。MLH1、MSH2、MSH6和PMS2蛋白中任意一種缺失，判定為MSI，而四種蛋白均表達(dá)則判定為微衛(wèi)星穩(wěn)定(MSS)。p53蛋白在腫瘤細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性。選擇陽性細(xì)胞較為集中的區(qū)域(熱點(diǎn)區(qū))，每個(gè)病例選取10個(gè)高倍(×400)視野，計(jì)數(shù)總細(xì)胞數(shù)，計(jì)算陽性細(xì)胞比例。陽性細(xì)胞比例≥30%為p53表達(dá)陽性，<30%為陰性。評判過程由兩名高年資病理科醫(yī)師雙盲獨(dú)立完成。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件。計(jì)數(shù)資料的比較采用χ2檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)性分析。生存情況分析采用Kaplan-Meier法，生存率的比較采用Log-rank檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、MMRP在CRC中的表達(dá)

276例CRC患者中，36例(13.0%)MMRP表達(dá)缺失，其中MLH1與PMS2共同表達(dá)缺失者22例(61.1%)，PMS2單獨(dú)缺失者2例(5.6%)，MSH2與MSH6共同表達(dá)缺失者10例(27.8%)，MSH6單獨(dú)缺失者2例(5.6%)(圖1)。

二、MSI與CRC臨床病理特征的關(guān)系

MSI與CRC患者組織病理學(xué)類型、TNM分期和血吸蟲感染有關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而與患者性別、年齡、發(fā)病部位、分化程度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均無關(guān)(P>0.05；表1)。

三、p53蛋白在CRC中的表達(dá)

276例CRC患者中，p53蛋白陽性表達(dá)124例，陽性率為44.9%(圖1)。

四、p53蛋白表達(dá)與CRC臨床病理特征的關(guān)系

p53蛋白表達(dá)與CRC患者組織學(xué)病理類型、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和血吸蟲感染有關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而與患者性別、年齡、發(fā)病部位、分化程度均無關(guān)(P>0.05；表1)。

A：MMRP表達(dá)陽性；B：MMRP表達(dá)陰性；C：p53表達(dá)陽性；D：p53表達(dá)陰性

表1 MSI和p53表達(dá)與CRC臨床病理特征的關(guān)系n(%)

五、MSI與p53相關(guān)性分析

Spearman相關(guān)性分析顯示，MSI與p53表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.169，P<0.05)。

六、MSI與患者預(yù)后的關(guān)系

MSI組和MSS組的1、3、5年生存率分別為100%、97.2%、83.1%和96.7%、81.9%、38.9%，組間相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=12.582，P=0.001；圖2)。

圖2 MSI組和MSS組的生存函數(shù)曲線比較(Kaplan-Meier法)

討 論

CRC在西方國家的發(fā)病率高，僅次于肺癌[7]。隨著生活水平的提高以及生活方式的西化，我國CRC的發(fā)病率已位居消化道癌癥的第二位。CRC發(fā)病隱匿，多數(shù)患者發(fā)現(xiàn)時(shí)已處于晚期，雖然目前有各種治療手段綜合應(yīng)用于CRC，但其5年生存率和總生存率仍較低，探討其可能的分子發(fā)病機(jī)制仍是非常重要的課題。目前普遍認(rèn)為CRC的發(fā)生遵循著正常上皮-腺瘤上皮內(nèi)瘤變-癌的分子演變過程，但越來越多的研究發(fā)現(xiàn)DNA錯(cuò)配修復(fù)缺陷及其導(dǎo)致的MSI為一條重要的替代性通道[8]。MSI是由DNA復(fù)制時(shí)插入或缺失突變引起的微衛(wèi)星序列長度改變的現(xiàn)象，常由錯(cuò)配修復(fù)功能缺陷引起。正常人體內(nèi)，DNA錯(cuò)配修復(fù)對維持超時(shí)遺傳信息的完整性是非常必要的，在DNA復(fù)制過程中出現(xiàn)堿基錯(cuò)配時(shí)，MMRP識(shí)別并予以修復(fù)，以保證基因組穩(wěn)定性。如MMRP中的任意一種基因發(fā)生突變或甲基化失活，將引起錯(cuò)配修復(fù)功能缺失，基因組不穩(wěn)定，可能使某些癌基因高表達(dá)或抑癌基因失表達(dá)，繼而形成腫瘤[9]。本研究發(fā)現(xiàn)，276例CRC患者中的MSI發(fā)生率為13.0%，與國內(nèi)外研究[10-11]結(jié)果相近。本課題組還發(fā)現(xiàn)，在4種錯(cuò)配修復(fù)基因中，MLH1常與PMS2共同缺失，MSH2常與MSH6共同缺失，與以往研究[12]結(jié)果相似。

本研究發(fā)現(xiàn)，MSI更常見于黏液腺癌中，這與國外研究[10]結(jié)果相近。多數(shù)黏液腺癌屬于低分化腺癌，預(yù)后差，但部分黏液腺癌的發(fā)病機(jī)制可能為MSI途徑，其預(yù)后更好。故有待于進(jìn)一步研究來探討具體的機(jī)制。在伴有血吸蟲病的CRC患者中，MSI的發(fā)生率更高，這與以往的研究[13]結(jié)果相似。本課題組的前期研究[14]結(jié)果表明，伴有血吸蟲病的CRC患者中黏液腺癌所占比例高于無血吸蟲病的CRC患者。而MSI更常見于黏液腺癌中，推測這可能是其發(fā)生率高的原因之一。有研究指出，伴有MSI的CRC患者臨床病理特征包括腫瘤常見于結(jié)腸近端、腫瘤分期為Ⅱ期、分化差以及黏液腺癌等[15-16]。本研究中，MSI與CRC患者組織病理學(xué)類型、TNM分期和血吸蟲感染有關(guān)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而與患者性別、年齡、發(fā)病部位、分化程度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均無關(guān)(P>0.05)。

p53基因是目前研究最多的抑癌基因之一[17]，分為野生型和突變型，其突變或缺失可導(dǎo)致多種腫瘤的發(fā)生。p53在CRC中的陽性率為40%～75%，與腫瘤分化、浸潤程度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)[18]。本研究發(fā)現(xiàn)，p53在CRC中的表達(dá)陽性率為44.9%，且與TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。在從腺瘤上皮內(nèi)瘤變到癌變的過程中，p53抑癌基因突變通常是一個(gè)晚期事件，預(yù)示著更差的預(yù)后。此外，伴有血吸蟲感染患者的p53陽性表達(dá)率明顯高于無感染患者，這與Zalata等[19]的研究結(jié)果一致。

有研究[20]發(fā)現(xiàn)，MSI CRC中p53基因的總突變率和點(diǎn)突變率分別為53.3%和32.5%。本研究中，MSI患者的p53蛋白陽性表達(dá)率為66.7%，且MSI與p53表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。提示在CRC發(fā)病機(jī)制中，MSI和p53基因突變可能是兩條不同的通路，在腫瘤的不同階段發(fā)揮作用。另有研究[21]顯示p53、MSI與CRC患者預(yù)后密切相關(guān)，p53突變者的預(yù)后較差，而MSI途徑的CRC盡管分化程度低，但其預(yù)后優(yōu)于p53基因突變等染色體不穩(wěn)定性途徑的CRC，其具體機(jī)制目前尚未完全闡明。且MSI CRC患者對5-FU為基礎(chǔ)的輔助化療不敏感，因此聯(lián)合檢測p53與MSI可對患者預(yù)后進(jìn)行評估，同時(shí)為臨床合理用藥提供依據(jù)。

總之，MSI和p53與CRC的臨床病理特征關(guān)系密切，對腫瘤惡性程度以及預(yù)后的判斷有指導(dǎo)意義。MSI與p53表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，提示兩者可能參與CRC不同階段的發(fā)生、發(fā)展過程。但研究結(jié)論仍需行進(jìn)一步研究證實(shí)。