子癇前期患者血清miR-195及其啟動子區(qū)甲基化水平觀察

牛三強，于康軍，譚憲巖，陳玲，陳東穎

1亳州市人民醫(yī)院，安徽亳州236800；2安徽省立醫(yī)院

子癇前期是一種常見且嚴重的妊娠并發(fā)癥[1]，是全世界孕產婦和嬰兒死亡的主要原因之一[2]。子癇前期發(fā)病機制尚不明確，癥狀表現(xiàn)為高血壓、顯著的蛋白尿、血管內皮功能障礙和全身炎癥反應，需要一些可靠標志物以幫助早期診斷。多項研究表明，先兆子癇的發(fā)病與相關基因甲基化狀態(tài)密切相關[3，4]。DNA甲基化通常是在胞嘧啶-磷酸-鳥嘌呤二核苷酸(CpG)的背景下以共價鍵添加一個甲基到胞嘧啶[5]。先前的研究表明，表觀遺傳修飾(包括甲基化)可調節(jié)基因的表達[6]。已有研究發(fā)現(xiàn)miR-195表達異常參與了子癇的發(fā)生[7]，但關于miR-195啟動子區(qū)甲基化在子癇前期發(fā)病中作用的研究較少。因此，本研究觀察了子癇前期患者血清miR-195及其啟動子區(qū)甲基化水平變化，并分析其與子癇前期臨床特征的關系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2017年8月～2018年8月在亳州市人民醫(yī)院就診的孕婦參與研究。子癇前期孕婦30例為病例組，年齡23～42(29.7±3.5)歲，孕次(1.7±0.6)次，BMI (27.5±2.2)kg/m2，排除有其他并發(fā)癥者。健康無合并癥孕婦30例為對照組，年齡24～41(30.8±2.3)歲，孕次(1.5±0.7)次，BMI (25.5±5.2)kg/m2。兩組一般資料差異均無統(tǒng)計學意義。本研究經亳州市人民醫(yī)院倫理委員會批準，并經患者知情同意。

1.2 血清miR-195檢測 采用qRT-PCR法。收集患者外周血2～3 mL，分離血清，-80 ℃冰箱冷凍保存?zhèn)溆谩Ｊ褂肨RIzol試劑盒(北京天根生物有限公司)提取細胞總RNA，miR-195和內參U6引物以及探針由上海閃晶分子生物有限公司設計合成，使用FTC-3000P PCR儀器(加拿大楓嶺生物公司)進行實驗。miR-195上游引物序列為5′-AGCTTCCCTGGCTCTAGCA-3′，下游引物序列為5′-CTGGAGCAGCACAGCCAATA-3′；U6上游引物序列為5′-GCTTCGGCAGCACATA-3′，下游引物序列為5′-CTTCACGAATTTGCGTG-3′。反應條件：95 ℃ 5 min，95 ℃ 20 s、60 ℃ 20 s、50個PCR循環(huán)。以2-ΔΔCt表示miR-195相對表達量。

1.3 miR-195啟動子區(qū)甲基化檢測

1.3.1 miR-195啟動子區(qū)甲基化特異性PCR(MSP)引物設計 通過UCSC數(shù)據(jù)庫，獲得miR-195啟動子區(qū)及其上下游各1 000 bp序列，使用Methprimer預測軟件設計miR-195啟動子區(qū)MSP引物，miR-195甲基化特異性引物(M)上游序列為5′-GGTTTGTAAAAATTTTCGGTATAAAC-3′，下游引物序列為5′-GACATATTTAATATCACACGACGAC-3′，擴增產物157 bp，退火溫度57 ℃；miR-195非甲基化特異性引物(U)上游序列為5′-TTGTAAAAATTTTTGGTATAAATGG-3′，下游引物序列為5′-CAACATATTTAATATCACACAACAAC-3′，擴增產物155 bp，退火溫度56 ℃。

1.3.2 MSP反應 PCR反應體系為20 L，模板為經去甲基化試劑盒處理的孕婦外周血DNA 2 L，10×PCR buffer 2 L，Mg2+1.6 μL，dNTP mix 0.4 L，DMSO 4 L，上下游引物10 pmol/L各2 L，HSTaq酶 0.2 L，滅菌水11.4 L。取5 L PCR擴增產物，2.0%瓊脂糖凝膠電泳25 min，使用凝膠成像系統(tǒng)觀察并拍照，根據(jù)DNA條帶判斷結果：甲基化陽性為M引物擴增出目的條帶、U引物未擴增出目的條帶，M引物和U引物均擴增出目的條帶；甲基化陰性為U引物擴增出目的條帶而M引物未擴增出目的條帶。

2 結果

2.1 兩組血清miR-195水平比較 病例組、對照組血清miR-195水平分別為0.558±0.153、0.955±0.213，病例組血清miR-195水平低于對照組(P<0.01)。

2.2 兩組miR-195啟動子區(qū)甲基化水平比較 病例組、對照組miR-195啟動子區(qū)甲基化陽性率分別為62%(23/30)、24%(11/30)，病例組miR-195啟動子區(qū)甲基化陽性率高于對照組(P<0.05)。

2.3 miR-195表達及啟動子區(qū)甲基化與子癇前期臨床病理參數(shù)的關系 臍動脈S/D≥2.6的子癇前期患者血清miR-195水平高于S/D<2.6者，miR-195啟動子區(qū)甲基化陽性率低于S/D<2.6者(P均<0.05)。血清miR-195及其啟動子區(qū)甲基化水平與患者年齡、孕周、BMI及尿蛋白水平無關。見表1。

表1 血清miR-195及其啟動子區(qū)甲基化與子癇前期臨床病理參數(shù)的關系

注：#Fisher′s檢驗結果。

3 討論

miRNA通過調節(jié)基因表達來影響幾乎所有細胞功能[8]。miRNA是長度為18～22個核苷酸的小非編碼RNA，其通過抑制核糖體上的基因翻譯過程或通過降解相應的mRNA，在轉錄后水平上起作用[9，10]。目前已經鑒定了超過1 500種人類miRNA，約50%的蛋白質編碼基因都受其調節(jié)[9～11]。子癇前期的發(fā)病機制復雜，尚未完全了解。對于miRNA在子癇前期發(fā)病過程中的調控機制也不完全清楚。目前已知缺氧可能是影響胎盤活動過程的主要因素。一系列miRNA(miR-205、335、224、451、491、210)在低氧水平下表達上調，而miR-424表達減少[12]。miRNA在轉錄水平受到調節(jié)，但表觀遺傳機制也可以影響miRNA的表達[13]。

滋養(yǎng)細胞分化與DNA甲基化及非甲基化狀態(tài)有關。滋養(yǎng)細胞分化過程中，一些基因啟動子區(qū)甲基化及非甲基化狀態(tài)可以改變基因表達狀態(tài)，繼而影響滋養(yǎng)細胞生理功能，參與子癇前期的發(fā)病[14]。胎盤形成的機制是滋養(yǎng)層細胞對蛻膜和子宮肌層的遷移和侵襲[15]。有學者發(fā)現(xiàn)，在重度子癇前期狀態(tài)下，miR-675表達下調可促進過多滋養(yǎng)層細胞增殖[16]。還有研究表明，miR-195、miR-376c和miR-378a-5p通過抑制Nodal/TGF-β信號轉導，促進滋養(yǎng)細胞遷移和侵襲，三者在子癇前期患者中表達下調[7，17，18]。血液循環(huán)中miRNA的特異性等特點使其具備了作為疾病早期診斷分子標志物的可能[19]。已有研究開始利用外周血miRNA定量檢測來評估及預測子癇前期等疾病。本研究采用qRT-PCR法檢測了子癇前期患者血清中的miR-195，結果顯示，病例組血清miR-195水平低于對照組，提示miR-195表達變化可能參與了子癇前期的發(fā)病，具體機制目前尚未明確。

馬穎等[20]研究顯示，子癇前期與鳥嘌呤核苷酸結合蛋白(GNA12)啟動子甲基化水平降低相關，外周血基因甲基化檢測對子癇前期的早期診斷也有一定意義。本研究通過MSP檢測子癇前期患者和對照組血清miR-195啟動子區(qū)甲基化水平，結果表明，病例組血清miR-195啟動子區(qū)甲基化水平高于對照組，且子癇前期孕婦miR-195啟動子區(qū)甲基化水平與孕婦年齡、分娩時間、BMI及尿蛋白量無關，而與臍動脈S/D有關，可能是miR-195啟動子區(qū)高甲基化抑制了miR-195表達，通過促進其下游的與子癇前期相關的靶基因過表達，影響相關通路的調節(jié)功能，導致子癇前期的發(fā)病。已有研究表明，miR-195通過干擾其靶基因ActRIIA表達，影響Activin/Nodal信號轉導而導致子癇前期的發(fā)生[16]。因此，我們推測miR-195在子癇前期中低表達可能主要與其啟動子區(qū)高甲基化有關，其甲基化水平變化可能參與子癇前期的發(fā)生發(fā)展。

總之，本研究結果顯示，子癇前期患者血清miR-195水平降低，啟動子區(qū)甲基化水平升高，推測miR-195表達變化可能參與了子癇前期的發(fā)病，具體機制將在后續(xù)研究中進一步闡明。