氧糖剝奪再灌注后星形膠質(zhì)細(xì)胞活化、損傷、凋亡、自噬變化及意義

膽迎，李晨

天津市第五中心醫(yī)院，天津300450

腦卒中是由于腦組織缺血或出血導(dǎo)致局部供血中斷而引起腦組織損傷的嚴(yán)重疾病，可導(dǎo)致神經(jīng)功能障礙、神經(jīng)退行性疾病甚至死亡[1～3]。星形膠質(zhì)細(xì)胞作為腦內(nèi)最為豐富的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，負(fù)責(zé)水和電解質(zhì)穩(wěn)態(tài)、谷氨酸攝取、腦血流調(diào)節(jié)、血腦屏障的維持、神經(jīng)可塑性的調(diào)節(jié)以及神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)和神經(jīng)保護(hù)因子的分泌[4～6]。腦缺血后星形膠質(zhì)細(xì)胞活性降低[7]。減輕星形膠質(zhì)細(xì)胞在腦缺血期間損傷是研究的主要方向。自噬通過(guò)降解受損細(xì)胞器和錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)以維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)和正常細(xì)胞功能[8]。缺血性卒中后，大腦中各種類(lèi)型細(xì)胞中自噬被激活。然而，自噬在缺血性腦卒中過(guò)程中的具體作用和分子機(jī)制尚未闡明[9]。2019年1～10月，本研究采用體外培養(yǎng)的原代小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞制作氧糖剝奪再灌注(OGD/R)模型模擬體內(nèi)腦卒中損傷，觀察了OGD/R后星形膠質(zhì)細(xì)胞活化、損傷、凋亡、自噬水平的變化，探討自噬在星形膠質(zhì)細(xì)胞缺血性損傷中的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與主要材料 出生3 d內(nèi)的C57BL/6小鼠12只，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。LC3抗體購(gòu)自Sigma-Aldrich公司。GFAP抗體、GAPDH抗體、Caspase-3抗體購(gòu)自Proteintech公司。自噬抑制劑3-MA購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。乳酸脫氫酶(LDH)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京碧云天生物科技有限公司。CCK-8細(xì)胞活力檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京恩晶生物科技有限公司。TNF-α檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京金益柏生物科技有限公司。

1.2 小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞分離 取出生3 d的C57BL/6小鼠，麻醉并處死小鼠，分離腦組織，加入DMEM洗滌3次，將血管和腦膜組織剔除，去大腦皮質(zhì)，剪碎，在組織中加入0.25%胰蛋白酶，37 ℃孵育8 min，150目篩網(wǎng)過(guò)濾。加入DMEM洗滌，1 500 r/min離心5 min。添加含有青霉素-鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液(含有10%胎牛血清)，接種到多聚賴(lài)氨酸(PLL)包被的T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶中。放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育3 d，換液，待細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)后，在37 ℃、220 r/min條件下振蕩孵育18 h，將小膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元去除，用0.25%胰蛋白酶將貼壁細(xì)胞消化，接種到24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。

1.3 OGD/R對(duì)小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞活化、存活率、損傷、凋亡、自噬的影響觀察

1.3.1 細(xì)胞分組及OGD/R處理 將星形膠質(zhì)細(xì)胞接種到24孔板中，將細(xì)胞分為對(duì)照組和OGD/R組。對(duì)照組不做特殊處理。OGD/R組建立OGD/R模型：吸去正常培養(yǎng)基，用PBS清洗細(xì)胞2次，加入無(wú)糖DMEM培養(yǎng)基，將24孔板放入?yún)捬豕拗?，?7 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別于3、6、12 h后換成正常培養(yǎng)基，繼續(xù)在37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h。

1.3.2 活化標(biāo)志物檢測(cè) 采用Western blotting法檢測(cè)星形膠質(zhì)細(xì)胞活化標(biāo)志物膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)。將兩組細(xì)胞加入細(xì)胞裂解液在冰上提取總蛋白。4 ℃、12 000 r/min離心20 min。用BCA法進(jìn)行蛋白定量。SDS-PAGE電泳分離蛋白，濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜上。用TBST洗滌PVDF膜3次，每次15 min。5%脫脂牛奶室溫封閉2 h。加入一抗(GFAP，1∶2 000)，4 ℃過(guò)夜。用TBST洗3次，每次15 min。加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔或羊抗鼠IgG二抗(1∶2 000),室溫孵育2 h。用TBST洗3次，每次15 min。用化學(xué)發(fā)光顯色法顯影。以目的蛋白灰度值與內(nèi)參GAPDH灰度值的比值表示目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.3.3 細(xì)胞存活率測(cè)算 采用CCK-8法。將兩組細(xì)胞接種到96孔板中，在每個(gè)孔內(nèi)加入10 μL的CCK-8溶液，放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h。酶標(biāo)儀測(cè)定在450 nm處的吸光度值(A值)。細(xì)胞存活率=(OGD/R組A值/對(duì)照組A值)×100%。

1.3.4 LDH漏出率及TNF-α檢測(cè) 向細(xì)胞培養(yǎng)板中加入LDH釋放試劑，400 r/min離心5 min，取各組上清液120 μL，加入到新的96孔板中；各孔分別加入60 μL的LDH檢測(cè)工作液，混勻，室溫避光孵育30 min；測(cè)量490 nm處的A值；LDH漏出率=(實(shí)驗(yàn)組A值-對(duì)照組A值)/(細(xì)胞最大酶活性A值-對(duì)照組A值)×100%。采用ELISA法檢測(cè)兩組細(xì)胞培養(yǎng)液中的TNF-α。

1.3.5 凋亡蛋白檢測(cè) 采用Western blotting法檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3。方法參照“1.3.2”。

1.3.6 自噬相關(guān)蛋白檢測(cè) 采用Western blotting法檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白LC3B-Ⅱ。方法參照“1.3.2”。

1.4 自噬對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞活化、存活率、損傷、凋亡的影響觀察 取出生3 d的C57BL/6小鼠，參照“1.2”方法分離星形膠質(zhì)細(xì)胞，分為對(duì)照組、3-MA對(duì)照組、OGD/R組、OGD/R+3-MA組。對(duì)照組不做特殊處理。OGD/R組、OGD/R+3-MA組建立OGD/R模型(缺氧缺糖培養(yǎng)后6 h更換正常培養(yǎng)基)。3-MA對(duì)照組及OGD/R+3-MA組造模前加入1 mmol/L的3-MA[10]。參照前述方法檢測(cè)GFAP、細(xì)胞存活率、LDH漏出率、TNF-α水平、Caspase-3。

2 結(jié)果

2.1 OGD/R后星形膠質(zhì)細(xì)胞活化、存活率、凋亡、自噬變化 OGD/R組不同處理時(shí)間細(xì)胞GFAP表達(dá)、LDH漏出率、TNF-α水平均高于對(duì)照組，細(xì)胞存活率低于對(duì)照組(P均<0.05)；OGD/R組6 h、12 h時(shí)的Caspase-3/Pro-Caspase-3及LC3B-Ⅱ表達(dá)高于對(duì)照組(P均<0.05)。詳見(jiàn)表1。

表1 兩組細(xì)胞GFAP表達(dá)、細(xì)胞存活率、LDH漏出率、TNF-α水平、Caspase-3及LC3B-Ⅱ表達(dá)比較

注：與對(duì)照組比較，*P<0.01。

2.2 自噬抑制的星形膠質(zhì)細(xì)胞活化、存活率、凋亡情況變化 OGD/R組細(xì)胞GFAP表達(dá)、LDH漏出率、TNF-α水平、Caspase-3/Pro-Caspase-3表達(dá)均高于對(duì)照組，細(xì)胞存活率低于對(duì)照組(P均<0.05)。OGD/R+3-MA組細(xì)胞GFAP表達(dá)、LDH漏出率、TNF-α水平、Caspase-3/Pro-Caspase-3表達(dá)均低于OGD/R組，細(xì)胞存活率高于OGD/R組(P均<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 各組細(xì)胞GFAP表達(dá)、細(xì)胞存活率、LDH漏出率、TNF-α水平、Caspase-3表達(dá)比較

注：與對(duì)照組比較，*P<0.01;與OGD/R+3-MA組比較，#P<0.01。

3 討論

腦卒中可影響各種腦功能區(qū)，涉及復(fù)雜的損傷反應(yīng)[11]。腦缺血通過(guò)多種機(jī)制誘導(dǎo)神經(jīng)損傷，包括神經(jīng)興奮毒性、線(xiàn)粒體反應(yīng)、自由基釋放、蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊和炎癥改變[12]。星形膠質(zhì)細(xì)胞的損傷和凋亡以及白質(zhì)損傷也會(huì)導(dǎo)致腦損傷。星形膠質(zhì)細(xì)胞是營(yíng)養(yǎng)支持神經(jīng)元，同時(shí)星形膠質(zhì)細(xì)胞的終足與周?chē)?xì)血管壁連接，參與血腦屏障維持。故而星形膠質(zhì)細(xì)胞在腦卒中的損傷與恢復(fù)中發(fā)揮重要作用[13～15]。我們采用體外培養(yǎng)的原代小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞制作OGD/R模型模擬體內(nèi)腦卒中損傷，觀察了OGD/R后星形膠質(zhì)細(xì)胞活化、凋亡、自噬的變化，結(jié)果顯示，OGD/R組不同處理時(shí)間細(xì)胞GFAP表達(dá)、LDH漏出率、TNF-α水平均高于對(duì)照組，細(xì)胞存活率低于對(duì)照組；OGD/R組中6 h、12 h亞組Caspase-3/Pro-Caspase-3及LC3B-Ⅱ表達(dá)高于對(duì)照組。這表明星形膠質(zhì)細(xì)胞OGD/R后活化且自噬水平升高，同時(shí)細(xì)胞分泌TNF-α水平增加，LDH漏出率增加，細(xì)胞凋亡增多。TNF-α可以激活凋亡受體，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。生理狀態(tài)下LDH位于細(xì)胞內(nèi)，在外界刺激下，LDH分泌到細(xì)胞外。TNF-α和LDH漏出率增加，表明星形膠質(zhì)細(xì)胞活化促進(jìn)缺血缺氧條件下星形膠質(zhì)細(xì)胞的損傷。

大量研究表明，缺血刺激后腦組織中自噬被激活，但是自噬在腦缺血中的作用及影響尚未達(dá)成共識(shí)。目前普遍認(rèn)為腦卒中后自噬激活具有雙向作用，一方面具有神經(jīng)保護(hù)作用，可以保護(hù)細(xì)胞免受缺血損傷；另一方面也會(huì)促進(jìn)缺血后神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞凋亡[16,17]。自噬過(guò)度活化會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞“自噬性死亡”[18]。本研究發(fā)現(xiàn)，OGD/R后星形膠質(zhì)細(xì)胞中的LC3B-Ⅱ蛋白表達(dá)增加，表明自噬被激活，同時(shí)凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3表達(dá)水平也顯著升高，表明OGD/R誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞自噬激活的同時(shí)也伴隨著凋亡的發(fā)生。研究表明，自噬和凋亡雖然是不同的機(jī)制，但有一些常見(jiàn)的信號(hào)分子共同參與其中，如AMPK、p62等[19]。有學(xué)者在大鼠tMCAO模型中使用RNAi方法抑制自噬的同時(shí)也抑制凋亡的發(fā)生，改善了tMCAO大鼠的預(yù)后[20]。這表明“自噬性細(xì)胞死亡”可能通過(guò)凋亡途徑介導(dǎo)細(xì)胞損傷作用，因此推測(cè)在缺糖缺氧條件下,星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)自噬激活可能通過(guò)促進(jìn)凋亡加重星形膠質(zhì)細(xì)胞的損傷。本研究進(jìn)一步觀察了自噬抑制的星形膠質(zhì)細(xì)胞活化、存活率、凋亡情況，結(jié)果顯示，OGD/R+3-MA組細(xì)胞GFAP表達(dá)、LDH漏出率、TNF-α水平、Caspase-3/Pro-Caspase-3表達(dá)均低于OGD/R組，細(xì)胞存活率高于OGD/R組。這提示抑制OGD/R星形膠質(zhì)細(xì)胞自噬可以抑制凋亡的發(fā)生，減少TNF-α分泌，降低LDH漏出率，提高細(xì)胞存活率，抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化，進(jìn)一步說(shuō)明抑制OGD/R后自噬的發(fā)生對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞具有保護(hù)作用。

綜上所述，OGD/R后星形膠質(zhì)細(xì)胞活化增強(qiáng)，凋亡蛋白表達(dá)增加，自噬激活。自噬可能促進(jìn)了星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化和凋亡，誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞缺血性損傷。上述研究結(jié)果對(duì)于理解星形膠質(zhì)細(xì)胞自噬和凋亡的相關(guān)性有一定參考價(jià)值。雖然自噬參與了缺糖缺氧條件下星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化過(guò)程，并通過(guò)調(diào)節(jié)凋亡的進(jìn)程影響星形膠質(zhì)細(xì)胞的存活，但是由于自噬和凋亡調(diào)控機(jī)制的復(fù)雜性，許多相關(guān)調(diào)控因子在自噬和凋亡通路中的作用仍有待于進(jìn)一步研究闡明。