改良電抽搐療法治療精神分裂癥的生物學(xué)機(jī)制探討

王萍，劉可智，向波，譚清宇，陳德超，梁雪梅

1西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院，四川瀘州646000；2宜賓市第四人民醫(yī)院

精神分裂癥是最常見(jiàn)的重型精神病之一，抗精神病藥物是其基礎(chǔ)治療方法。復(fù)雜的遺傳性缺陷是精神分裂癥發(fā)病的最大已知風(fēng)險(xiǎn)因素。改良電抽搐療法(MECT)是一種安全、有效、快速的精神疾病物理治療方法[1]，目前認(rèn)為治療急性精神分裂癥有效，疾病緩解率達(dá)60%[2]。越來(lái)越多的研究表明，MECT聯(lián)合抗精神病藥物治療精神疾病效果顯著[3]。MECT的治療機(jī)制與多種分子途徑有關(guān)。有學(xué)者在大鼠實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)BRD1 mRNA表達(dá)變化可能與MECT的療效有關(guān)[4]。另一項(xiàng)研究表明，轉(zhuǎn)錄因子(TCF)家族可能在MECT治療中發(fā)揮作用[5]。還有研究發(fā)現(xiàn)腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)可能是精神病易感性生物學(xué)途徑中的下游基因[6]。然而，MECT治療精神分裂癥的機(jī)制仍不明確。第二代測(cè)序(NGS)法加速了疾病病理學(xué)的研究進(jìn)程，產(chǎn)生了新的研究方向，如基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、基因表達(dá)分析等[7]。本研究對(duì)采用MECT治療的精神分裂癥患者進(jìn)行療效評(píng)估，通過(guò)Illumina測(cè)序法及生物信息學(xué)方法，分析不同MECT治療反應(yīng)者表達(dá)差異基因，并進(jìn)行GO富集分析、KEGG通路功能富集分析、疾病相關(guān)分析、藥物相關(guān)分析、表型分析和全表型組關(guān)聯(lián)分析，初步探討MECT治療精神分裂癥的生物學(xué)機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2018年11月～2019年1月宜賓市第四人民醫(yī)院住院精神分裂癥患者16例進(jìn)入研究。入選標(biāo)準(zhǔn)：①符合精神疾病診斷和統(tǒng)計(jì)手冊(cè)(DSM)5的診斷標(biāo)準(zhǔn)；②接受MECT治療(≥6次，3次/周)；③年齡15～55歲，右利手，漢族；④小學(xué)畢業(yè)及以上文化。排除標(biāo)準(zhǔn)：①患有嚴(yán)重軀體疾病，神經(jīng)系統(tǒng)疾病，物質(zhì)依賴者；②入組時(shí)被診斷為精神分裂癥，在隨訪6個(gè)月后不能確定為精神分裂癥或診斷為其他精神障礙患者。選擇年齡、性別、學(xué)歷等一般資料相匹配的健康志愿者8例為正常對(duì)照組。排除患有精神障礙和人格障礙者，患器質(zhì)性精神障礙、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、物質(zhì)依賴者，二系三代精神疾病家族史陽(yáng)性者，曾服用過(guò)抗精神病藥、抗抑郁藥者。受試者均自愿加入本研究，并簽署知情同意書(shū)。本研究由西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 療效評(píng)估及分組 采用DSM-Ⅳ的定式檢查工具SCID-I/P(患者版)及SCID-NP(非患者版)分別對(duì)入組患者和正常對(duì)照組進(jìn)行系統(tǒng)精神檢查。采用陽(yáng)性和陰性癥狀量表(PANSS)評(píng)估臨床療效，要求病例組基線分?jǐn)?shù)≥60分，并計(jì)算MECT治療后減分率。減分率=(治療前評(píng)分-治療后評(píng)分)/(治療前評(píng)分-30)×100%。將病例組根據(jù)減分率分為治療應(yīng)答組8例(減分率≥60%)、治療無(wú)應(yīng)答組8例(減分率<60%)。治療應(yīng)答組男、女各4例，年齡(31.63±6.28)歲，學(xué)歷為初中5例、高中及以上3例，基線PANSS(83.63±7.11)分；治療無(wú)應(yīng)答組男、女各4例，年齡(34.69±11.01)歲，學(xué)歷為小學(xué)3例、初中2例、高中及以上3例，基線PANSS(89.13±9.00)分；正常對(duì)照組男、女各4例，年齡(31.25±11.22)歲，學(xué)歷為小學(xué)2例、初中3例、高中及以上3例。三組一般資料具有可比性。治療應(yīng)答組和治療無(wú)應(yīng)答組用藥方案及基線PANSS差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.3 外周血RNA提取及測(cè)序 分別于MECT治療前和治療后1～3 d清晨(07:00～09:00)采集各組受試者全血2 mL，使抗凝劑與血液混勻，按250 μL/管分裝于單獨(dú)凍存管中，加750 μL的TRIzol混勻，液氮速凍(≥1 h)后轉(zhuǎn)移至-80 ℃保存。正常對(duì)照組僅采血1次。7～10 d內(nèi)提取總RNA。用Nanodrop2000檢測(cè)RNA的濃度和純度，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA完整性，Agilent2100測(cè)定RIN值。單次建庫(kù)要求RNA總量1≥μg，濃度≥50 ng/μL，OD260/280為1.8～2.2。從總RNA中分離出mRNA，加入裂解液(fragmentation buffer)將mRNA隨機(jī)斷裂成300 bp左右的小片段，在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。加入End Repair Mix將雙鏈cDNA的黏性末端補(bǔ)成平末端，隨后在3′末端加上腺嘌呤(A)堿基。用PCR擴(kuò)增15個(gè)循環(huán)，2%低量程超瓊脂糖回收目的條帶，按數(shù)據(jù)比例混合上機(jī)，在cBot上進(jìn)行橋式PCR擴(kuò)增并進(jìn)行Illumina Hiseq測(cè)序(PE文庫(kù)，讀長(zhǎng)2×150 bp)。使用fastx_toolkit_0.0.14軟件對(duì)每個(gè)樣本的原始測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控，將質(zhì)控后的原始數(shù)據(jù)與參考基因組比對(duì)獲得用于后續(xù)轉(zhuǎn)錄本組裝、表達(dá)量計(jì)算等的映射數(shù)據(jù)(mapped Reads)，同時(shí)運(yùn)用TopHat2(http://ccb.jhu.edu/software/tophat/index.shtml)和HISAT2(http://ccb.jhu.edu/software/hisat2/index.shtml)軟件對(duì)該次轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的比對(duì)結(jié)果進(jìn)行質(zhì)量評(píng)估，包括測(cè)序飽和度、基因覆蓋度、數(shù)據(jù)(Reads)在參考基因組不同區(qū)域分布及Reads在不同染色體分布分析。

1.4 差異表達(dá)基因篩選 基于所選參考基因組序列，使用StringTie軟件對(duì)Mapped Reads進(jìn)行拼接并與原有基因組注釋信息進(jìn)行比較，發(fā)掘新基因，補(bǔ)充和完善原有基因組注釋信息。將基因與六大數(shù)據(jù)庫(kù)(NR、Swiss-Prot、Pfam、EggNOG、GO和KEGG)進(jìn)行比對(duì)，對(duì)基因的表達(dá)水平進(jìn)行定量分析。獲得基因的表達(dá)量后，使用DESeq2軟件進(jìn)行樣本間基因的差異表達(dá)分析，用FDR(Benjamini/Hochberg法)進(jìn)行多重檢驗(yàn)矯正，篩選校正P<0.05者作為差異表達(dá)基因。分別獲得病例組治療前與正常對(duì)照組、治療應(yīng)答組治療前后、治療無(wú)應(yīng)答組治療前后的差異表達(dá)基因。

1.5 重疊基因功能富集分析 將“1.4”中篩選的病例組治療前與正常對(duì)照組、治療應(yīng)答組治療前后、治療無(wú)應(yīng)答組治療前后的差異表達(dá)基因進(jìn)行對(duì)比分析，獲得重疊基因，并根據(jù)基因表達(dá)水平的變化分為表達(dá)上調(diào)組和表達(dá)下調(diào)組，用WebGestalt(http://www.webgestalt.org)軟件[8]分別對(duì)表達(dá)上調(diào)組和表達(dá)下調(diào)組的重疊基因進(jìn)行功能富集分析即GO分析、KEGG通路分析、疾病相關(guān)分析、藥物相關(guān)分析表型分析(哺乳動(dòng)物、人類表型)、全表型組關(guān)聯(lián)分析(即PheWAS)。以adjP<0.05作為篩選標(biāo)準(zhǔn)，選擇每項(xiàng)分析中校正P值最低的前5項(xiàng)作為富集結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 差異表達(dá)基因分析結(jié)果 病例組治療前與正常對(duì)照組差異表達(dá)基因4 964個(gè)，表達(dá)上調(diào)2 618個(gè)、下調(diào)2 346個(gè)。治療無(wú)應(yīng)答組治療前后未發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)基因。治療應(yīng)答組治療前后差異表達(dá)基因343個(gè)，表達(dá)上調(diào)129個(gè)、下調(diào)214個(gè)。將病例組治療前與正常對(duì)照組差異表達(dá)基因、治療應(yīng)答組治療前后差異表達(dá)基因進(jìn)行對(duì)比分析，發(fā)現(xiàn)176個(gè)重疊基因，其中表達(dá)上調(diào)55個(gè)(ABCA13、SPTY2D1、ZNF654、EDEM3、USP38、SEC24A、PIK3CG、SMC4、LMBRD2、DENND1B等)，下調(diào)121個(gè)(VASH1-AS1、AC135050.1、SLC5A2、PPP1R14A、AC006213.1、AL021707.5、ETFB、HRAS、SIRT6、ZNF337-AS1等)。

2.2 差異表達(dá)基因GO富集分析結(jié)果 在重疊基因中，表達(dá)上調(diào)組顯著富集于生物學(xué)功能，涉及磷脂酰肌醇二磷酸激酶活性、磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸-3-激酶活性、胰島素受體底物結(jié)合、磷脂酰肌醇-3-激酶活性、1-磷脂酰肌醇-3-激酶活性；表達(dá)下調(diào)組顯著富集于細(xì)胞組分，包括核糖體亞單位、核糖體結(jié)構(gòu)、核糖體、胞質(zhì)核糖體和結(jié)構(gòu)分子活性的生物學(xué)功能。見(jiàn)表1。

表1 差異表達(dá)基因的GO富集分析

2.3 差異表達(dá)基因KEGG通路分析結(jié)果 表達(dá)上調(diào)的差異表達(dá)基因主要與慢性粒細(xì)胞白血病、腎細(xì)胞癌、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子信號(hào)通路、丙型肝炎、白細(xì)胞內(nèi)皮遷移通路有關(guān)，表達(dá)下調(diào)基因主要與核糖體、亨廷頓病、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、緊密連接、哮喘生物通路有關(guān)。見(jiàn)表2。

表2 差異表達(dá)基因KEGG通路分析

2.4 差異表達(dá)基因疾病相關(guān)分析 重疊的差異表達(dá)基因表達(dá)上調(diào)者與共濟(jì)失調(diào)有關(guān)(校正P=0.045)，表達(dá)下調(diào)基因與HIV有關(guān)(校正P=0.023)。

2.5 差異表達(dá)基因藥物相關(guān)分析 未發(fā)現(xiàn)重疊的差異表達(dá)基因與藥物有顯著關(guān)聯(lián)。

2.6 差異表達(dá)基因表型分析 重疊的差異表達(dá)基因表達(dá)上調(diào)者與腎發(fā)育不全、眼球突出、房間隔缺損、外周動(dòng)脈異常、動(dòng)脈狹窄顯著相關(guān)。見(jiàn)表3。

2.7 全表型組關(guān)聯(lián)分析 重疊的差異表達(dá)基因表達(dá)上調(diào)者與心房顫動(dòng)和撲動(dòng)、血壓升高、細(xì)菌感染、女性生殖器相關(guān)癥狀、維生素B復(fù)合物缺乏有關(guān)。表達(dá)下調(diào)基因與腸道吸收不良有關(guān)。

表3 差異表達(dá)基因的表型分析

3 討論

雖然已有研究發(fā)現(xiàn)了一些能預(yù)測(cè)MECT對(duì)精神分裂癥療效的生物學(xué)標(biāo)志物，但其生物學(xué)機(jī)制至今尚不清楚。研究者通過(guò)動(dòng)物模型或精神分裂癥患者對(duì)各種神經(jīng)遞質(zhì)、受體及激素進(jìn)行了廣泛的探索，發(fā)現(xiàn)了與MECT抗精神病效應(yīng)有關(guān)的因素，并形成了眾多的假說(shuō)，如神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)作用、中樞免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)、神經(jīng)再生等。腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子在成年期神經(jīng)細(xì)胞的存活、分化、維持和連接中起著重要作用，也參與應(yīng)激反應(yīng)中下丘腦-垂體-腎上腺軸的功能。MECT后的精神分裂癥患者血清BDNF水平升高，且臨床癥狀得到改善。有學(xué)者通過(guò)探究MECT對(duì)血清中細(xì)胞因子水平的影響，來(lái)闡明免疫功能在MECT療效中的重要作用。已有多項(xiàng)研究顯示，精神分裂癥患者M(jìn)ECT前后血液中某些蛋白水平發(fā)生改變且與臨床癥狀相關(guān)，但從基因轉(zhuǎn)錄水平去探索MECT治療精神分裂癥機(jī)制的研究極少。本研究通過(guò)分析精神分裂癥患者M(jìn)ECT前后外周血mRNA轉(zhuǎn)錄水平的差異，探索MECT治療精神分裂癥的生物學(xué)機(jī)制。

本研究發(fā)現(xiàn)，MECT聯(lián)合抗精神病藥物治療精神分裂癥療效顯著，這與先前的研究一致[9]。對(duì)病例組治療前與正常對(duì)照組、治療應(yīng)答組治療前后、治療無(wú)應(yīng)答組治療前后的差異表達(dá)基因進(jìn)行對(duì)比分析，發(fā)現(xiàn)176個(gè)重疊的差異表達(dá)基因，其中表達(dá)上調(diào)55個(gè)(ABCA13、SPTY2D1、ZNF654、EDEM3、USP38、SEC24A、PIK3CG、SMC4、LMBRD2、DENND1B等)，下調(diào)121個(gè)(VASH1-AS1、AC135050.1、SLC5A2、PPP1R14A、AC006213.1、AL021707.5、ETFB、HRAS、SIRT6、ZNF337-AS1等)。重疊基因GO富集分析發(fā)現(xiàn)，表達(dá)上調(diào)基因顯著富集于磷脂酰肌醇激酶活性，與相關(guān)研究一致[10]。有研究發(fā)現(xiàn)磷脂酰肌醇-4-磷酸-5-激酶Ⅱa(PIP5K2A)在異源基因表達(dá)系統(tǒng)中調(diào)節(jié)神經(jīng)元kcnq2/kcnq3和kcnq3/kcnq5通道功能，從而導(dǎo)致精神分裂癥相關(guān)突變體(N251S)-PIP5K2A被破壞，有助于精神分裂癥癥狀緩解[11]。現(xiàn)有臨床和臨床前期數(shù)據(jù)表明，MECT治療精神分裂癥的療效可能與部分激活磷脂酰肌苷3-激酶-蛋白激酶B途徑(PI3K-PKB)通路有關(guān)。表達(dá)下調(diào)基因主要富集于核糖體，與核糖體蛋白S28、L28、P2、S9、S19、L36顯著相關(guān)，而人類基因組核糖體基因復(fù)制數(shù)升高導(dǎo)致的rRNA失調(diào)可能是精神分裂癥發(fā)展的遺傳因素之一[12]。

KEGG通路分析顯示，表達(dá)上調(diào)基因與神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子信號(hào)通路相關(guān)，主要由SH-PTP2和PI3K介導(dǎo)。神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子在神經(jīng)元生長(zhǎng)、可塑性和存活的信號(hào)通路中起重要作用。研究表明，MECT可導(dǎo)致海馬組織體積增加，其機(jī)制可能與神經(jīng)發(fā)生、膠質(zhì)生成、突觸形成、血管生成相關(guān)，而神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子似乎在這些過(guò)程中起著重要的中介作用[13]。神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子相關(guān)的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路在精神分裂癥等神經(jīng)精神疾病的病理生理學(xué)過(guò)程中至關(guān)重要[14]。神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子信號(hào)通路中的PIK3CG、PIK3CA、PTPN11參與神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)形成的關(guān)鍵階段。SH-PTP2是一種參與多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的多功能酪氨酸磷酸酶，在神經(jīng)系統(tǒng)中分布廣泛，參與介導(dǎo)神經(jīng)元存活的途徑，也是多種神經(jīng)反應(yīng)的重要參與因子。調(diào)控PI3K/Akt信號(hào)通路有助于保護(hù)神經(jīng)功能，促進(jìn)血管生成[15]。我們推測(cè)MECT通過(guò)調(diào)節(jié)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子信號(hào)通路而產(chǎn)生療效。未來(lái)研究可從神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的生物學(xué)、表觀遺傳調(diào)控及其在發(fā)育過(guò)程中的相互作用方面作進(jìn)一步探索[16]。表達(dá)下調(diào)基因與亨廷頓病通路相關(guān)，與通路中亨廷頓基因(HTT)顯著相關(guān)。亨廷頓病的發(fā)病機(jī)制與HTT序列中CAG三核苷酸擴(kuò)增有關(guān)。小鼠實(shí)驗(yàn)表明，電休克治療可通過(guò)刺激腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子產(chǎn)生、保護(hù)神經(jīng)元免受應(yīng)激、減少突變型HTT對(duì)紋狀體神經(jīng)元的損害，從而延緩亨廷頓疾病的發(fā)展。未來(lái)的研究可探索精神分裂癥與HTT的關(guān)聯(lián)。同時(shí)，表達(dá)下調(diào)基因也與緊密連接通路相關(guān)。緊密連接通路與谷氨酸能、γ-氨基丁酸能突觸的形成和神經(jīng)傳遞有關(guān)，在緊密連接途徑中TNNA1和MYH2基因的高甲基化也參與了神經(jīng)管缺陷的發(fā)生[17]。

疾病相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，表達(dá)下調(diào)的差異表達(dá)基因與HIV顯著相關(guān)。HIV患者患精神分裂癥的風(fēng)險(xiǎn)更高，且能增加病死率[18]。精神分裂癥與HIV具有正相關(guān)的遺傳關(guān)系，因?yàn)閮烧咿卓剐远嘈缘膯魏塑账岫鄳B(tài)性鑒定的基因功能富集于突觸傳遞和神經(jīng)遞質(zhì)傳遞的調(diào)節(jié)[19]。重疊基因表型分析和全性狀組關(guān)聯(lián)分析顯示，差異表達(dá)基因與心血管疾病及癥狀相關(guān)，如動(dòng)脈狹窄、心房顫動(dòng)和撲動(dòng)等。心血管疾病是精神分裂癥患者過(guò)早死亡的最常見(jiàn)原因，精神分裂癥的陰性癥狀可增加心血管疾病風(fēng)險(xiǎn)[20]。MECT對(duì)精神分裂癥患者心律的影響可能與麻醉藥物的使用有關(guān)。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)藥物聯(lián)合MECT治療精神分裂癥療效顯著。MECT治療精神分裂癥的機(jī)制可能與調(diào)節(jié)神經(jīng)元通路、促進(jìn)神經(jīng)元生長(zhǎng)、存活和可塑性、調(diào)節(jié)突觸傳遞和神經(jīng)遞質(zhì)有關(guān)。未來(lái)的研究可從大腦內(nèi)部基因差異表達(dá)探索MECT治療精神分裂癥相關(guān)的生物機(jī)制。本研究也存在一定局限性，如在MECT治療過(guò)程中藥物使用可能會(huì)對(duì)結(jié)果產(chǎn)生影響、基于外周血基因表達(dá)差異并不能反映大腦組織中基因表達(dá)的變化、樣本量較小等，未來(lái)我們還將進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量，深入研究MECT的治療機(jī)制。