顱骨與骨髓源性間充質(zhì)干細胞移植治療大鼠缺血性腦卒中療效對比觀察

蘇紅軍，相蕾

1天津市寶坻區(qū)人民醫(yī)院，天津301800；2天津環(huán)湖醫(yī)院

近年來，中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的藥物和手術(shù)治療方面取得了較多進展，但尚不能提供根治性治療。間充質(zhì)干細胞(MSCs)移植作為一種治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的新方法受到了廣泛關(guān)注。有研究報道，在卒中模型中，MSCs移植可修復(fù)受損腦組織，促進神經(jīng)功能恢復(fù)[1， 2]。一些研究表明，不同來源的MSCs的特征可能有所不同[3，4]。因此，MSCs移植的效果可能受MSCs來源的影響。在MSCs的來源中，顱骨穹窿和面部的一些骨組織來自顱神經(jīng)嵴，四肢、髂骨和椎骨的骨組織來自中胚層[5]。Ullah等[6]研究顯示，牙髓源性干細胞來源于顱神經(jīng)嵴細胞，具有顯著的神經(jīng)源性活性，這是其他成人體細胞所沒有的。基于這些發(fā)現(xiàn)，我們推測顱骨來源的MSCs(cMSCs)對中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病(包括缺血性卒中)具有很高的治療潛力。2017年6月～2019年6月，本研究對比觀察了cMSCs與骨髓間充質(zhì)干細胞(bMSCs)移植治療大鼠缺血性腦卒中的效果?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與主要實驗材料 雄性SD大鼠100只，4～10周齡，體質(zhì)量250～300 g，購自上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司(動物使用許可證標號：SCXK滬2016-0005)。生長培養(yǎng)基購自美國Invitrogen公司。TrypLETMSelect購自美國Thermo Fisher Scientific公司?？勾笫驝D45、CD90、CD29、CD44和CD34均購自美國BD Biosciences公司。FACSVerse系統(tǒng)購自美國BD Biosciences公司。成骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基購自德國Promocell公司。茜素紅染液購自美國Sigma-Aldrich公司。油紅O染色(10 μmol/L)購自美國Sigma-Aldrich公司。Eclipse TE300倒置熒光顯微鏡購自日本Nikon公司。TRIzolTM試劑盒購自美國Thermo Fisher Scientific公司。RT-PCR試劑盒購自美國Thermo Fisher Scientific公司。TUNEL溶液購自美國Roche公司。二氨基聯(lián)苯胺(DAB)購自北京英特利根生物科技有限公司。

1.2 cMSCs與bMSCs的分離、鑒定 取6只4～5周齡雄性SD大鼠的股骨和脛骨作為骨髓標本，接種在生長培養(yǎng)基上，將黏附于培養(yǎng)皿底部的細胞作為第一代的bMSCs并傳代數(shù)次，分離出bMSCs。取6只雄性SD大鼠的顱骨，將骨膜、肌肉、硬腦膜和嗅神經(jīng)完全取出，將標本接種于生長培養(yǎng)基上，分離出cMSCs。收集第3代的bMSCs和cMSCs，通過流式細胞術(shù)檢測MSCs特異性標志物進行鑒定，bMSCs ：CD29、CD90、CD44、CD34、CD45陽性表達率分別為98.7%、99.1%、95.8%、0.3%、0.3%;cMSCs ：CD29、CD90、CD44、CD34、CD45陽性表達率分別為99.2%、96.2%、98.1%、0.3%、0.3%。取80%～90%融合的P3代bMSCs和cMSCs，檢測其成骨分化和成脂分化的能力以鑒定MSCs。結(jié)果見圖1。

注：A為bMSCs和cMSCs的原細胞；B為分化后的成骨細胞；C為分化后的脂肪細胞。

圖1 bMSCs和cMSCs向成骨細胞和脂肪細胞的分化潛能

1.3 cMSCs與bMSCs中神經(jīng)嵴相關(guān)基因、神經(jīng)營養(yǎng)因子檢測 采用qRT-PCR法檢測cMSCs與bMSCs中神經(jīng)嵴相關(guān)基因(Snail、Slug)和神經(jīng)營養(yǎng)因子(Bdnf、Gdnf、Ngf)的mRNA。

1.4 大腦中動脈閉塞模型(MCAO)建立與分組處理 隨機選擇90只大鼠建立MCAO模型。大鼠腹腔注射2%戊巴比妥鈉(2 mL/kg)進行麻醉。取頸部中間切口，并在鎖骨肌和胸腹肌之間找到右頸總動脈(CCA)、頸外動脈(ECA)和頸內(nèi)動脈(ICA)。將ECA的分叉結(jié)扎，同時將ECA與CCA的連接處結(jié)扎。動脈夾夾住CCA的近端部分。將3-0尼龍縫合線穿過ECA的近分叉的底部并打結(jié)，不完全收緊。在CCA的分叉距離1.0 mm處使用微剪刀儀器切口。將單絲尼龍縫合線輕輕插入ICA中，使其尖端達到大腦中動脈(MCA)起始點，將縫合線收緊以阻斷MCA血液供應(yīng)。將切口分層縫合，并將末端約1 cm的單絲尼龍縫合線留在外面。在缺血2 h后，小心拉出左單絲直至感覺到阻力，表明尖端已至CCA分叉處?；謴?fù)MCA血供。在再灌注21 d后處死大鼠并取出大腦，以供制備各種組織切片。另選擇20只大鼠為假手術(shù)組，僅手術(shù)暴露CCA、ECA和ICA，但不對其進行處理。對建模大鼠進行Bederson評分[7]，評分高于1分判定為建模成功。90只建模大鼠中，排除4只死亡大鼠，排除Bederson評分為0或4分的5只大鼠，在剩余81只大鼠中選擇60只，隨機分為模型組、bMSCs組、cMSCs組各20只。模型組單純給予PBS，bMSCs組和cMSCs組大鼠分別在MCAO后24 h經(jīng)尾靜脈注射bMSCs、cMSCs(1.0×106/300 μL PBS)。模型組和假手術(shù)組在相同時間注射等體積的PBS。

1.5 運動功能評價 術(shù)后2、7、14、21 d分別進行平衡木實驗和Garcia評分。每項測試進行3次，結(jié)果取均值。平衡木實驗：將大鼠放在一條狹窄的木條(30.0 cm×1.3 cm)上平衡進行測定；四肢均在木條上平衡計1分，單側(cè)肢體能抓住木或在木頭上搖晃計2分，一條或兩條肢體從木上滑落計3分，三條肢體從木上滑落計4分，在木上掙扎后摔倒計5分，懸掛在木頭上掙扎后摔倒計6分，完全不掙扎立即摔倒計7分。Garcia評分包括評估自發(fā)活動、四肢對稱運動、前爪伸直、攀爬、身體本體感覺和對觸碰振動的反應(yīng)。

1.6 海馬組織病理觀察 再灌注21 d后處死大鼠并取出大腦，將制成的海馬組織石蠟切片在二甲苯Ⅰ和二甲苯Ⅱ中浸泡10 min。然后將切片依次用100%、95%、90%、75%乙醇洗滌5 min，蘇木精染色10 min，再用1%蘇紅染色5 min，用中性樹脂固定。在BZ-9000多功能顯微鏡下觀察海馬組織病理變化。

1.7 海馬組織局灶性腦梗死(CI)面積測算 再灌注21 d后處死大鼠并取出大腦，將制備好的海馬組織作2.0 mm厚冠狀切片浸泡在TTC溶液中，37 ℃恒溫黑暗中孵育，直到正常區(qū)域被染成亮紅色、梗死區(qū)域被染成白色。將染色切片放入4%甲醛溶液固定24 h，取出腦切片，濾紙脫水。每組5個切片，隨機抽取3個切片，用Image J軟件分析并計算CI面積(梗死區(qū)面積占大腦總面積的百分比)。

1.8 海馬組織神經(jīng)元凋亡率測算 再灌注21 d后處死大鼠并取出大腦，取各組大鼠海馬組織，用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，做3 μm厚切片，室溫孵育15 min，PBS洗滌后，加入50 μL的TUNEL溶液，37 ℃培養(yǎng)60 min，然后加入50 μL轉(zhuǎn)化劑過氧化物酶37 ℃中孵育30 min，再加入50 μL的DAB室溫孵育10 min。蘇木精再次用于細胞核染色，并在光學(xué)顯微鏡下對封閉切片進行圖像分析。被染色呈黃色或棕色的細胞為TUNEL陽性細胞。每個切片選取6個不同的高倍視野進行觀察，記錄每個高倍視野下的 TUNEL陽性細胞數(shù)和細胞總數(shù)。根據(jù)公式計算細胞凋亡率。細胞凋亡率=TUNEL陽性細胞/總細胞數(shù)×100%。

2 結(jié)果

2.1 cMSCs與bMSCs中神經(jīng)嵴相關(guān)基因、神經(jīng)營養(yǎng)因子表達比較 cMSCs中Snail、Slug、Bdnf、Gdnf、Ngf mRNA相對表達量均高于bMSCs(P均<0.05)。見表1。

表1 bMSCs和cMSCs中Snail、Slug、Bdnf、Gdnf、Ngf mRNA表達比較

注：與bMSCs相比，*P<0.05。

2.2 各組大鼠運動功能評分比較 假手術(shù)組均未發(fā)現(xiàn)明顯的神經(jīng)功能障礙，其他三組大鼠均表現(xiàn)出不同程度的神經(jīng)功能障礙。隨著時間的推移，各組從平衡木實驗得分逐漸下降，Garcia評分逐漸升高。模型組、bMSCs組、cMSCs組在各時點平衡木實驗得分高于假手術(shù)組，Garcia評分低于假手術(shù)組(P均<0.05)。bMSCs組、cMSCs組建模后7、14、21 d的平衡木實驗得分低于模型組，Garcia評分高于模型組(P均<0.05)；cMSCs組建模后7、14、21 d平衡木實驗得分低于bMSCs組，Garcia評分高于bMSCs組(P均<0.05)。詳見表2。

表2 大鼠運動功能評分比較(分，

注：與同時點假手術(shù)組相比，*P<0.05；與同時點模型組相比，#P<0.05；與同時點bMSCs組相比，△P<0.05。

2.3 各組大鼠海馬組織病理變化 假手術(shù)組海馬組織結(jié)構(gòu)完整且均勻排列，具有清晰的核仁，皮質(zhì)錐體細胞的核大而圓，且細胞膜清晰，細胞數(shù)量相對較大。模型組腦組織結(jié)構(gòu)消失，神經(jīng)元損傷加重，細胞體積減小，細胞變圓形或卵形，核固縮，間質(zhì)水腫加重，細胞間隙擴大。在bMSCs組中，海馬組織結(jié)構(gòu)不清晰、混亂，錐體細胞松散排列，體積減小，細胞間隙擴大，核固縮，部分細胞壞死。與bMSCs組相比，cMSCs組的損傷相對減輕，壞死區(qū)域縮小，細胞結(jié)構(gòu)不完整，核固縮程度下降，間質(zhì)水腫減輕(見圖2)。

注：A為假手術(shù)組；B為模型組；C為bMSCs組；D為cMSCs組。

圖2 各組大鼠海馬組織病理變化

2.4 各組大鼠海馬組織CI面積比較 在TTC染色后，假手術(shù)組大鼠腦切片顯示為紅色，沒有CI區(qū)。模型組大鼠右側(cè)大腦皮層和海馬區(qū)與正常組比較，呈現(xiàn)白色CI病變。假手術(shù)組、模型組、bMSCs組、cMSCs組CI面積分別為0、28.94%±2.07%、20.54%±1.13%、15.17%±1.04%。bMSCs組、cMSCs組CI面積小于模型組，cMSCs組CI面積小于bMSCs組(P均<0.05)。見圖3。

圖3 各組大鼠海馬組織CI面積(TTC染色)

2.5 各組大鼠海馬組織神經(jīng)元凋亡率比較 假手術(shù)組、模型組、bMSCs組、cMSCs組海馬組織神經(jīng)元凋亡率分別為6.02%±0.89%、74.30%±4.82%、56.21%±4.06%、33.99%±3.84%。模型組、bMSCs組、cMSCs組海馬組織中神經(jīng)元凋亡率高于假手術(shù)組，bMSCs組、cMSCs組神經(jīng)元凋亡率低于模型組，cMSCs組神經(jīng)元凋亡率低于bMSCs組(P均<0.05)。見圖4。

注：A為假手術(shù)組；B為模型組；C為bMSCs組；D為cMSCs組。

圖4 TUNEL法檢測各組大鼠海馬神經(jīng)元細胞凋亡情況

3 討論

顱骨主要來源于顱神經(jīng)嵴，是通過膜內(nèi)而不是軟骨內(nèi)骨化發(fā)育形成的扁平骨。盡管顱骨具有一個狹小的骨髓空間，但Zhao等[8]研究顯示顱骨縫合線為MSCs提供了一個生存環(huán)境。而四肢、髂骨和椎骨的骨骼來自中胚層[5]，長骨或髂骨的骨髓中存在MSCs。以往的研究表明，MSCs在體外表現(xiàn)出神經(jīng)分化的潛力[9，10]。而目前普遍認為MSCs移植對體內(nèi)缺血性腦損傷的治療作用與其分泌的一系列營養(yǎng)因子有關(guān)，進而促進了缺血性腦組織修復(fù)[11]。神經(jīng)營養(yǎng)因子發(fā)揮多種神經(jīng)保護作用，包括刺激組織內(nèi)的干細胞增殖和分化[12]。Bdnf是一種重要的神經(jīng)營養(yǎng)因子，可促進神經(jīng)發(fā)育和血管生成，提供神經(jīng)保護，減輕炎癥和細胞凋亡，改善缺血性腦損傷后的突觸可塑性[13]。Matsuda等[14]報道，Bdnf有助于預(yù)防IL-1β和TNF-α誘導(dǎo)的內(nèi)皮屏障功能障礙和調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)。曹景麗等[15]研究表明，Bdnf通過增加抗凋亡蛋白Bcl-2的表達和抑制細胞內(nèi)鈣超載來減少心肌細胞凋亡。Ngf也是一種神經(jīng)營養(yǎng)因子，體外研究已證實其神經(jīng)保護作用[16]。Bianco等[17]報道Ngf能夠快速激活抗氧化防御系統(tǒng)，抑制活性氧(ROS)的生成。本研究成功分離和鑒定了cMSCs和bMSCs，并通過檢測顯示cMSCs組比bMSCs組表達更多的神經(jīng)嵴相關(guān)基因Snail、Slug和神經(jīng)營養(yǎng)因子Bdnf、Gdnf、Ngf。這些結(jié)果提示cMSCs來源于神經(jīng)嵴，而不是中胚層； cMSCs大量表達神經(jīng)營養(yǎng)因子Bdnf和Ngf，cMSCs的發(fā)育特異性可能使得神經(jīng)營養(yǎng)因子大量表達。

缺血性腦卒中的神經(jīng)細胞凋亡與許多事件有關(guān)。細胞凋亡最初是由鈣內(nèi)流、線粒體受損和能量消耗引起的，隨后是由于氧和葡萄糖消耗引起谷氨酸興奮性毒性[18]。NO、氧自由基和其他ROS的釋放會進一步損傷神經(jīng)元。此外，內(nèi)皮細胞釋放MMP和其他蛋白酶破壞血腦屏障，導(dǎo)致免疫細胞浸潤，而免疫細胞釋放的細胞因子也會增強炎癥反應(yīng)，加重腦損傷[19]。至于運動缺陷的恢復(fù)，有研究報告，初始運動缺陷水平和隨后的恢復(fù)依賴于皮質(zhì)纖維投射纖維的完整性[20]。本研究發(fā)現(xiàn)，與模型組相比，bMSCs和cMSCs移植治療有效改善了MCAO大鼠的神經(jīng)功能障礙，并且cMSCs組改善效果優(yōu)于bMSCs組。因此，cMSCs移植較bMSCs可以誘導(dǎo)MCAO大鼠神經(jīng)功能更好的恢復(fù)。此外，與bMSCs組相比，cMSCs組大鼠海馬組織CI面積和海馬神經(jīng)元凋亡率均顯著降低，從而解釋了cMSCs組大鼠運動功能改善程度優(yōu)于bMSCs組，進一步說明減少細胞凋亡可能是bMSCs、cMSCs移植治療缺血性腦卒中的一個機制。

鑒于cMSCs可分泌豐富的神經(jīng)營養(yǎng)因子，cMSCs移植可促進缺血性腦卒中模型大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)且效果優(yōu)于bMSCs移植，因此，顱骨可能是用于治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的理想MSCs來源。下一步還應(yīng)考慮使用源自人顱骨的MSCs進行移植治療研究。