氣腫疽梭菌CctA全長(zhǎng)基因的克隆及生物信息學(xué)分析

陳曉潔，李新蘋，何高明＞，王 鋼，凌 晨，張 飛

（1.石河子大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，新疆 石河子 832000；2.天康生物股份有限公司，新疆 烏魯木齊 830000）

氣腫疽也稱為黑腿病，其病原菌是氣腫疽梭菌，該病被列為第三類傳染病，是一種嚴(yán)重的人畜共患細(xì)菌傳染疾病，可引起發(fā)熱、嚴(yán)重的肌壞死、水腫，最終導(dǎo)致受感染動(dòng)物死亡，對(duì)全球范圍的畜牧業(yè)生產(chǎn)造成了重大損失。氣腫疽梭菌是一種嚴(yán)格的厭氧、孢子形成、具有組織毒性、單形性和運(yùn)動(dòng)性的革蘭氏陽性致病菌，其生存能力強(qiáng)，在世界范圍內(nèi)廣泛傳播[1]。美國和日本報(bào)道人感染氣腫疽梭菌死亡的案例，從而打破了氣腫疽梭菌只感染動(dòng)物的言論，也將該病視為重要研究對(duì)象[2]。

黑腿病是影響反芻動(dòng)物最古老的臨床疾病之一，但其發(fā)病的確切機(jī)制仍不清楚，關(guān)于氣腫疽梭菌產(chǎn)生的毒素和毒力因子的作用也存在知識(shí)缺口[3，4]。CctA是 Joachim Frey等經(jīng)過全基因序列分析得出的一種新型蛋白質(zhì)毒素，屬于細(xì)菌毒素殺白細(xì)胞素超家族β-微孔形成毒素[5]。其具有很強(qiáng)的致病性，是氣腫疽梭菌的主要細(xì)胞毒素和溶血素[5]。有研究表明，將重組CctA接種動(dòng)物后，可針對(duì)氣腫疽梭菌的感染產(chǎn)生保護(hù)作用，因此，在預(yù)防黑腿病疫苗的研究中是非常有價(jià)值的候選抗原[6]。本研究擴(kuò)增出氣腫疽梭菌的細(xì)胞毒素CctA基因序列，并通過氨基酸序列分析該基因編碼蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)和功能域，預(yù)測(cè)該蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)、三級(jí)結(jié)構(gòu)，旨在為研究氣腫疽梭菌CctA基因功能提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 材料

氣腫疽梭菌C54-2標(biāo)準(zhǔn)菌株購自中國藥品監(jiān)察所。Ex Taq酶、DL5000 DNA Maker購自TaKaRa寶生物有限公司。

1.2 方法

1.2.1 引物的設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank中公布的CctA基因序列（登錄號(hào)：JQ692583），采用primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)編碼序列的特異性引物。引物序列為：上游引物CctA-F：5'-CGAG CTCATGATAAAAAGAATATTAATGCTTGCTTTA GC-3'；下游引物CctA-R：CCGCTCGAGTTAATA TCCTGCATGCTCAACAGTATGG-3'。由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2.2 CctA基因的擴(kuò)增 以氣腫疽梭菌C54-2標(biāo)準(zhǔn)菌株的基因組為模板，PCR擴(kuò)增CctA基因片段。反應(yīng)體系50 ul：Taq酶25 ul，引物CctA-F和CctA-R各1 ul，DNA模板2 ul，ddH2O 21 ul。PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性，5 min；95℃變性，45 s；58℃退火，45 s；72℃延伸，45s；72℃終延伸，10 min，共30個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束，用1%瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證。

1.2.3 CctA編碼蛋白的相關(guān)生物信息學(xué)分析 對(duì)CctA編碼蛋白的理化性質(zhì)預(yù)測(cè)應(yīng)用ExPASY在線分析軟件ProtParam完成，具體內(nèi)容包括氨基酸組成、分子量、等電點(diǎn)、不穩(wěn)定指數(shù)、脂溶指數(shù)等。此外，利用ProtScale工具還進(jìn)一步對(duì)該蛋白的親水/疏水性作在線預(yù)測(cè)，以確定該蛋白在生理?xiàng)l件下是屬于親水性蛋白還是疏水性蛋白。在線軟件TMHMM對(duì)CctA編碼蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測(cè)和分析。SignaIP 4.1 Server在線預(yù)測(cè)CctA編碼蛋白氨基酸序列信號(hào)肽。利用在線軟件NetNGlyc 、NetOGlyc 4.0 Server預(yù)測(cè)CctA編碼蛋白的糖基化位點(diǎn)，NetPhos 3.1 Server預(yù)測(cè)CctA編碼蛋白的磷酸化位點(diǎn)。通過SOPMA、SWISSMODEL軟件分別對(duì)其二級(jí)、三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)。利用在線軟件 ABCpred對(duì)CctA編碼蛋白潛在的B細(xì)胞抗原表位進(jìn)行預(yù)測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 氣腫疽梭菌CctA基因擴(kuò)增結(jié)果

瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，在970 bp處出現(xiàn)特異條帶（見圖1），與預(yù)期片段大小相符，說明通過PCR擴(kuò)增得到CctA基因片段。

圖1 CctA全長(zhǎng)基因PCR擴(kuò)增

圖2 CctA編碼蛋白疏水性分析

2.2 CctA編碼蛋白的結(jié)構(gòu)和功能預(yù)測(cè)

2.2.1 CctA編碼蛋白的理化性質(zhì)分析 應(yīng)用ExPASY在線分析軟件ProtParam對(duì)CctA編碼蛋白的理化性質(zhì)分析后，該蛋白分子量約為35.57KD，其分子式為C1577H2411N421O503S8，由317個(gè)氨基酸組成；CctA蛋白中帶正電荷的氨基酸殘基（Asp+Glu）總數(shù)為31，帶負(fù)電荷的氨基酸殘基（Arg+Lys）總數(shù)為29；等電點(diǎn)（PI）理論值為6.13；在哺乳動(dòng)物體外培養(yǎng)細(xì)胞中的半衰期約為30 h，在大腸桿菌體內(nèi)大于10 h；脂溶指數(shù)為69.50；不穩(wěn)定指數(shù)為28.28（＜40為穩(wěn)定蛋白），屬于穩(wěn)定蛋白。

2.2.2 CctA蛋白氨基酸序列的親疏水性分析 使用ProtScale分析CctA蛋白的親疏水性氨基酸殘基分布（見圖2），在第9位氨基酸處有最大疏水值為2.222，在第291位氨基酸處有最小疏水值為-2.833，其平均疏水值為-0.496，預(yù)測(cè)該蛋白為親水性蛋白。

圖3 CctA編碼蛋白信號(hào)肽預(yù)測(cè)

圖4 CctA蛋白N-糖基化位點(diǎn)預(yù)測(cè)

2.2.3 CctA蛋白的結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 利用TMHMM對(duì)CctA編碼蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測(cè)和分析，顯示CctA蛋白不具有跨膜結(jié)構(gòu)。表明為該蛋白全部1-317位氨基酸序列均屬于膜外側(cè)，不存在跨膜螺旋區(qū)。SignaIP 4.1 Server在線預(yù)測(cè)CctA編碼蛋白氨基酸序列，分析表明CctA蛋白于第1～29位氨基酸存在信號(hào)肽序列（見圖3）。應(yīng)用interpro在線軟件預(yù)測(cè)CctA蛋白的保守域和功能結(jié)構(gòu)，分析表明CctA蛋白于34～313位有1個(gè)殺白細(xì)胞素成孔超家族蛋白，且含有殺白細(xì)胞素結(jié)構(gòu)域位于第62～309位。經(jīng)UniProt的Blast比對(duì)分析顯示，CctA與肉毒桿菌α溶血素有相似性；與蠟樣芽胞桿菌溶血素Ⅱ相似性為35.9%；與金黃色葡萄球菌α溶血素相似性為30.9%。

2.2.4 蛋白質(zhì)糖基化位點(diǎn)及磷酸化位點(diǎn)的預(yù)測(cè) 通過NetNGlyc 1.0 Server和NetOGlyc 4.0 Server軟件對(duì)氨基酸序列進(jìn)行N-糖基化位點(diǎn)及O-糖基化位點(diǎn)預(yù)測(cè)，得分高于0.50分時(shí)才會(huì)被預(yù)測(cè)為糖基化位點(diǎn)，經(jīng)預(yù)測(cè)顯示該蛋白有4個(gè)N-糖基化位點(diǎn)（見圖4），1個(gè)O-糖基化位點(diǎn)。通過NetPhos 3.1 Server 軟件對(duì)CctA蛋白進(jìn)行磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)，經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)該蛋白多數(shù)在絲氨酸處最可能通過相應(yīng)位點(diǎn)的磷酸化來實(shí)現(xiàn)其功能的調(diào)控，絲氨酸位點(diǎn)的最大值多數(shù)在0.99以上，且多數(shù)屬于絲氨酸＞蘇氨酸＞酪氨酸，其中含有絲氨酸磷酸化位點(diǎn)39個(gè)；蘇氨酸磷酸化位點(diǎn)18個(gè)，酪氨酸磷酸化位點(diǎn)15個(gè)，由此表明，CctA蛋白在絲氨酸和蘇氨酸處的磷酸化位點(diǎn)較多，這一結(jié)果也說明了該蛋白在絲氨酸與酪氨酸處更易發(fā)生磷酸化（見圖5）。

圖5 CctA蛋白磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)

圖6 CctA編碼蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

2.2.5 CctA蛋白的二級(jí)、三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 通過SOPMA軟件對(duì)CctA編碼蛋白氨基酸序列進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)，顯示該蛋白有31個(gè)α-螺旋，占所有氨基酸比例的9.78%；20個(gè)β-轉(zhuǎn)角，占所有氨基酸比例的6.31%；97個(gè)延伸鏈，占所有氨基酸比例的30.60%；169個(gè)無規(guī)卷曲，占所有氨基酸比例的53.31%（見圖6）。應(yīng)用SWISS-MODEL預(yù)測(cè)得到CctA編碼蛋白的三維結(jié)構(gòu)模型（見圖7），該模型與模板序列4i0n.1.A的相似度為50.18%

圖7 CctA編碼蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

2.2.6 CctA編碼蛋白質(zhì)潛在抗原表位的預(yù)測(cè) 利用在線軟件 ABCpred對(duì)CctA編碼蛋白潛在的B細(xì)胞抗原表位進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示該蛋白有22個(gè)優(yōu)勢(shì)的B細(xì)胞抗原表位，分別是33～47位、105～120位、212～227位等。利用在線軟件NetMHCIIpan 3.1 Server對(duì)CctA編碼蛋白的抗原表位進(jìn)行預(yù)測(cè)，限制性 Th 細(xì)胞表位為DRB1-0101，得到3個(gè)強(qiáng)結(jié)合多肽段和33個(gè)弱結(jié)合多肽段。

3 討論

氣腫疽梭菌主要影響牛，其引起暴發(fā)性肌壞死，迅速導(dǎo)致動(dòng)物死亡。由于黑腿病具有高致死率，因此在全球范圍內(nèi)造成畜牧業(yè)生產(chǎn)的重大損失[1,4,7,8]。據(jù)推測(cè)，該菌孢子是由巨噬細(xì)胞從腸道或口腔損傷處運(yùn)送到肌肉的，一旦進(jìn)入這些組織，孢子就處于休眠狀態(tài)，直到形成厭氧環(huán)境，就會(huì)導(dǎo)致孢子的增殖和外毒素的釋放[9]。Jayaramaiah等[10]鑒定了氣腫疽梭菌的一些細(xì)胞表面相關(guān)蛋白，如烯醇化酶、黃素蛋白等，但這些表面相關(guān)蛋白在預(yù)防黑腿病中的作用還需進(jìn)一步研究。有研究表明，DNAse、透明質(zhì)酸酶和唾液酸酶、鞭毛蛋白以及氣腫疽梭菌毒素A（CctA）均為氣腫疽梭菌的重要毒力因子[11-14]。其中最典型的CctA是氣腫疽梭菌的主要細(xì)胞毒性和溶血性[5]，表明除CctA外，無其他可產(chǎn)生溶血活性的物質(zhì)。CctA在全球50多年間采集的氣腫疽梭菌菌株之間完全保守[1]，它們都編碼相同的CctA的氨基酸序列，進(jìn)而證明了從易與氣腫疽梭菌混淆的敗血癥梭菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、諾維梭菌、肉毒梭菌、艱難梭菌等相關(guān)菌株中不能擴(kuò)增出CctA基因。

CctA蛋白結(jié)構(gòu)域分析顯示，該蛋白無跨膜區(qū)，有信號(hào)肽存在，于34～313位有1個(gè)殺白細(xì)胞素成孔超家族蛋白，且含有殺白細(xì)胞素結(jié)構(gòu)域位于第62～309位。這與Frey等[5]報(bào)道的CctA屬于殺白細(xì)胞素超家族β-桶狀造孔毒素家族相一致。分析顯示，CctA與肉毒桿菌α溶血素有相似性；與蠟樣芽胞桿菌溶血素Ⅱ相似性為35.9%；與金黃色葡萄球菌α溶血素相似性為30.9%，也佐證了CctA與肉毒桿菌α溶血素有相似性[15]；與蠟樣芽胞桿菌溶血素II[16]有48%氨基酸相似；與金黃色葡萄球菌α毒素有50%氨基酸相似的報(bào)道。經(jīng)分析表明，該蛋白有4個(gè)N-糖基化位點(diǎn)，1個(gè)O-糖基化位點(diǎn)，該蛋白有1個(gè)糖基化位點(diǎn)，周小菊等[17]表明，糖基化修飾差異，可能會(huì)影響相關(guān)蛋白的表達(dá)水平、結(jié)構(gòu)及功能，對(duì)重組蛋白生物學(xué)活性及免疫原性均有重要影響。為CctA重組蛋白的研究提供一定參考。預(yù)測(cè)該蛋白有多個(gè)磷酸化位點(diǎn)，而蛋白質(zhì)的修飾往往也影響這蛋白的穩(wěn)定性，研究表明，一些蛋白底物的絲氨酸或蘇氨酸位點(diǎn)磷酸化后與E3泛素連接酶的結(jié)合力增強(qiáng)，其穩(wěn)定性會(huì)明顯減弱[18]。CctA蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)分析顯示含有大量無規(guī)卷曲，是構(gòu)成酶活性部位和其他蛋白質(zhì)特異的功能部位[19]。由此可推測(cè)該蛋白可能含有較多抗原表位，這一結(jié)論也在抗原表位預(yù)測(cè)中得到證實(shí)。蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)及功能預(yù)測(cè)為找到其致病的分子機(jī)理提供一定依據(jù)，對(duì)氣腫疽的免疫及防治工作具有重要意義。