包膜顆粒的表面磷脂重排對細胞內吞的影響

王 穎, 王 平, 張國梁, 朱 濤, 蔣中英,

(1. 南京大學 物理學院 固體微結構物理國家重點實驗室, 南京 210093; 2. 伊犁師范大學 電子與信息工程學院 微納電傳感技術與仿生器械重點實驗室, 伊寧 835000)

1 引 言

在生物醫(yī)學領域, 納米尺度材料被廣泛應用于疾病治療、病灶示蹤和組織修復. 通過納米材料載體實現物質的定向輸運是其中最為重要的課題[1]. 近年來, 研究者開發(fā)了一種生物膜包裹顆粒的策略來強化粒子的生物相容性、內含物的緩釋性和靶向輸運性. 該策略已經在多種腫瘤治療、毒素清除等中展現出廣闊的應用前景[2].

目前大量研究已經表明, 改變包被中的生物膜中的膜蛋白種類, 可以影響包膜粒子的細胞靶向與功能性質. 比如張良方等采用中性粒細胞膜包裹聚合物膠束, 膜內LFA-1等分子能夠誘導粒子深入擴散至軟骨基質, 對不同成因的類風濕性關節(jié)炎都獲得了良好的治療效果. 而不含淋巴細胞功能相關分子的血紅細胞膜則沒有對應的包裹功效[3]. 最近的一些研究也表明, 改變包被的生物膜的物理性質, 同樣可以顯著影響粒子的細胞內吞效率和分布狀態(tài)[4]. Ashley等提高了包被膜的流動性, 發(fā)現能夠促進膜表面的抗體重排, 強化與細胞表面受體結合, 從而促進細胞內吞效率[5]. Brinker等改變膜表面的帶電性, 發(fā)現負電性膜包裹粒子與細胞產生了靜電排斥作用, 內吞效率遠低于正電性膜. 并且, 膜包被的完整性可在內吞中發(fā)揮重要的調節(jié)作用[6].

但是, 人們對包膜粒子與細胞膜作用的動力學及內吞方式的認識仍十分匱乏. 蔣新宇實驗結合模擬研究發(fā)現, 當生物膜與顆粒的親和性較強時, 細胞以胞飲的方式將包膜顆粒整體攝入, 進入細胞的消化器官內涵體[7]; 而磷脂與硅表面具有極強的親和性, 包膜硅顆粒卻被熒光顯微觀測到, 以膜融合的方式逃逸內涵體內吞路徑, 直接進入細胞質環(huán)境[8]. 由于人們對包膜粒子與細胞膜作用機制的理解仍不全面, 因此許多相關實驗現象尚未得到解釋.

在本研究中, 我們構筑了仿生磷脂膜包裹的多孔硅納米粒子, 研究了包膜粒子的內吞過程和影響因素. 從內吞機制的角度, 理解了粒子表面的不同的磷脂重排性質產生的內吞差的物理根源. 基于Derjaguin-Landau-Verway-Overbeek(DLVO)理論構建物理模型, 分析了決定包膜顆粒與細胞膜作用的主要因素. 研究深化了包膜粒子內吞過程的認識, 為后續(xù)設計復雜的納米載藥體提供了新的思路和參考.

2 實驗部分

2.1 實驗材料

二油酰磷脂酰膽堿(DOPC)、二硬脂酰磷脂酰膽堿(DSPC)、磷脂酰絲氨酸(DOPS)、二棕櫚?；字＝z氨酸(DPPS)和NBD-PE熒光染料購于Avanti Polar Lipids. 油溶性量子點ZnCdSe/ZnS購于武漢珈源量子點技術開發(fā)公司. Hela細胞株、DMEM等細胞培養(yǎng)液購于江蘇凱基生物技術公司. 其它化學試劑購于國藥集團化學試劑公司. 所有化學試劑均為分析純.

2.2 多孔硅顆粒的制備

多孔硅顆粒核心通過十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)模板法與量子點硅封裝制備[9]. 首先, 在3 μM ZnCdSe/ZnS量子點的氯仿溶液中, 加入5 mL CTAB水溶液(55 mM). 劇烈攪拌形成均勻的微乳液. 然后, 將溫度升高至50 °C, 氯仿?lián)]發(fā)后加入45 mL NaOH水溶液(13 mM)、0.5 mL正硅酸乙酯與3 mL醋酸乙脂. 反應3 h, 經過水與乙醇的反復離心清洗、硝酸銨乙醇溶液萃取清除過量的反應物與CTAB. 最后, 冷凍干燥獲取多孔硅顆粒樣品.

2.3 包膜顆粒的制備

通過單層磷脂小囊泡在多孔硅表面的自發(fā)融合制備包膜顆粒(圖1A)[10]. 首先, 配制給定磷脂組分的氯仿溶液(部分實驗中, 磷脂摻雜了1 mol%的NBD-PE用于熒光空間定位). 氮氣吹干和真空干燥箱干燥形成磷脂干膜. 隨后, 加入不完全DMEM緩沖液在60 °C水化3 h. 擠出器(30 nm濾膜)擠壓脂質體制備得到單層磷脂小囊泡. 然后, 將0.2 mg多孔硅顆粒溶于100 uL小囊泡溶液中, 共同培養(yǎng)12 h. 最后, 采用不完全DMEM培養(yǎng)液反復離心清洗除去過量囊泡, 獲得包膜顆粒用于細胞實驗.

2.4 粒子物理性質的表征

納米材料的形貌通過透射電鏡(TEM, 日本電子JEM-2100)表征. 流體力學直徑與zeta電位采用動態(tài)光散射(DLS, 馬爾文Nano S90)獲取. 生物膜側向流動性基于硅襯底表面的生物膜的熒光漂白恢復(FRAP)實驗考察. FRAP實驗步驟為使用488 nm激光輻照生物膜, 使照射區(qū)的熒光淬滅. 基于熒光強度逐漸恢復速率考察磷脂膜的側向流動性.

2.5 細胞內吞的熒光表征

Hela細胞以恒定密度接種在24孔板表面[11]. 在完全DMEM培養(yǎng)液(血清、雙抗)中培養(yǎng)24 h后, 將細胞外部溶液更換為含0.1 μM包膜顆粒的不完全DMEM培養(yǎng)液. 培養(yǎng)4 h后, 使用磷酸緩沖鹽溶液反復漂洗. 最后多聚甲醛固定, 奧林巴斯IX73倒置熒光顯微鏡觀測. 顆粒的內吞量通過統(tǒng)計5張以上相似細胞密度下的多孔硅顆粒的熒光強度獲得.

2.6 DLVO理論分析

包膜顆粒與細胞作用勢(W)的計算基于DLVO理論, 使用Mathlab數值計算獲得. 與早先的研究一致, 物理模型考慮了范德華(WvdW)、電雙層(WDL)與水合(Whyd)相互作用[12, 13].

W=WvdW+WDL+Whyd

(1)

(2)

(3)

(4)

其中,A為Hamaker常數,D為包膜粒子與細胞膜之間的距離,ψ是表面電位(通過zeta電位測試獲得), 1/κ是德拜長度,l0是水合作用的衰變長度(0.3 nm).

3 結果與討論

多孔硅顆粒核心基于CTAB模板法與量子點硅封裝制備. 圖1B給出了多孔硅顆粒的TEM圖片, 粒子中心偏暗的結構為量子點. 內部封裝的量子點用于對多孔硅顆粒的熒光追蹤(激發(fā)光波長約488 nm, 發(fā)射光640 nm). DLS顯示多孔硅顆粒的流體力學直徑約116 nm. 小囊泡通過擠出法制備. 將它與多孔硅顆?；旌? 可自發(fā)融合形成顆粒外部包被的支撐膜結構(圖1A). 表1展示了多孔硅顆粒在包裹磷脂膜前后的粒徑與zeta電位. 包膜使粒子尺寸提高了約10 nm, 近似于兩個磷脂雙層膜的厚度[14]. 并且在包膜后, 粒子的zeta電位與磷脂電位相近. TEM圖片顯示在粒子表面出現了一層厚度約4 nm的有機結構(圖1C). 熒光顯微表明多孔硅顆粒和生物膜的熒光存在空間共定位(圖1D). 均表明在多孔硅表面形成了生物膜包被的結構.

圖1 包膜多孔硅顆粒的制備及表征. (A)材料制備; (B)多孔硅與(C)包膜多孔硅顆粒的TEM圖片, 標尺代表100 nm; (D)生物膜(摻雜NBD-PE, 綠色)與顆粒(紅色)的熒光共定位, 最右側為前兩個熒光通道的疊加圖, 標尺代表1 μm.

生物膜包被使用了兩種磷脂混合組分. 在生理溫度條件下, 分別是處于液相的DOPS/DOPC和處于凝膠相的DPPS/DSPC. 其中DOPS、DPPS為負電性磷脂酰絲氨酸, 而DOPC、DSPC為電中性膽堿磷酸. 在不特別說明時, 負電性磷脂所占的摩爾百分比恒定為20 mol%. 將它們制備的囊泡在硅襯底表面融合形成磷脂支撐膜, 圖2展示了它們在37C的FRAP圖像. 液相磷脂膜的光漂白區(qū)域在短時間內恢復熒光, 說明良好的磷脂側向流動性. 而凝膠相磷脂膜的光漂白區(qū)域在實驗時間內無明顯恢復, 說明磷脂的側向流動性較差[15]. 除了側向流動性差異, 兩種混合磷脂的表面帶電性、膜厚度等物理性質十分相近(表1).

表1 包膜前后多孔硅顆粒、小囊泡的流體力學直徑與zeta電位

樣品流體力學直徑(nm)Zeta電位(mV)多孔硅顆粒116 ± 10-34 ± 2DOPS/DOPC囊泡32 ± 5-24 ± 1包DOPS/DOPC膜多孔硅顆粒126 ± 8-24 ± 2DSPC/DPPS囊泡36 ± 3-25 ± 1包DSPC/DPPS膜多孔硅顆粒127 ± 9-26 ± 1

圖2 磷脂支撐膜的FRAP表征. (A)具有漂白恢復性的DOPS/DOPC膜; (B)漂白恢復性差的DPPS/DSPC膜. 標尺代表100 μm.

圖3 Hela細胞對包膜多孔硅顆粒的內吞(A)DOPS/DOPC包被的多孔硅; (B)DPPS/DSPC包被的多孔硅. 紅色為多孔硅核心熒光, 黃色為生物膜包被的熒光. 坐標尺表示30 μm.

為表征包膜顆粒的內吞量, 我們把它加入Hela細胞的DMEM培養(yǎng)液中, 在37 °C共培養(yǎng)4 h. 隨后將細胞反復漂洗并使用熒光顯微鏡觀測. 如圖3A所示, DOPS/DOPC包被的顆粒實驗中, 多數細胞內部出現了明顯的紅色熒光, 表明納米粒子順利內吞進入細胞. 且熒光分布較為分散, 說明粒子均勻分布在細胞質環(huán)境中. 而對于DPPS/DSPC包膜的顆粒實驗中(圖3B), 多數細胞中的熒光很低, 說明顆粒的內吞量很低. 且熒光分布較為離散, 說明粒子非均勻地分布在細胞中. 以上結果表明, 流動性好的磷脂包被有助于提高粒子的內吞量, 且能夠使顆粒脫離內涵體的局域富集分布狀態(tài)[16]. 進一步將顆粒表面的生物膜標記NBD-PE, DOPS/DOPC實驗中的細胞膜表面出現了該熒光分布, 說明粒子內吞中發(fā)生了部分的膜融合(圖3A，4A). 而DPPS/DSPC實驗中, 熒光多分布在細胞內部, 說明粒子主要以胞飲內吞方式進入細胞(圖3B，4A)[17]. 這進一步表明了不同流動性膜包裹粒子的內吞方式是存在差異的.

圖4 細胞膜與包膜顆粒的作用勢隨間隔距離的變化. (A)包膜顆粒表面的磷脂流動性與組分重排, 紅色代表負電磷脂, 綠色表示電中性磷脂; (B)不同磷脂重排下，兩膜間的作用勢變化.

我們構建了一個理論模型理解以上現象. 由于Hela細胞膜的負電性, 在包膜粒子與細胞接近過程中, 對于側向流動不良的生物膜, 負電性是表面均勻分布的; 而對于側向流動性良好的生物膜, 負電性分子會被排斥到距離接觸面更遠的一端(圖4A). 這造成了包被生物膜與細胞膜靠攏的難易差異. 通過DLVO理論, 基于范德華、電相互作用和水合力定量分析了兩膜在靠近過程中作用勢的變化[12, 13]. 如圖4B所示, 對于均勻分布的負電荷膜, 融合的膜接近涉及很高的勢壘(24 μJ/m2). 而磷脂重排后, 兩膜在靠攏至自由能最低的過程中不再存在勢壘. 所以, 高流動性膜的側向分布重排可以極大地降膜間接觸的勢壘, 從而促進膜間融合和內吞. 而對于低流動性膜, 由于膜間排斥力較大, 則只能通過胞飲的方式被動地內吞進入細胞[18].

最后, 我們進一步負電加大帶電量, 將負電性磷脂DOPS及DPPS比例提高至50 mol%. 圖5定量給出了不同帶電性及流動性膜包被的內吞量.發(fā)現不論膜側向流動性高低, 負電組分提高使內吞量均顯著降低了.這表明了在生物膜帶電分子比例很高的情況下, 磷脂重排對膜間靜電排斥的降低效應有限, 從而產生了相近的內吞效率的下降.

圖5 Hela細胞對50 mol%負電含量磷脂膜包裹的多孔硅顆粒的內吞. (A)DOPS/DOPC包被的多孔硅; (B)DPPS/DSPC包被的多孔硅. 坐標尺表示30 μm; (C)多孔硅顆粒內吞量統(tǒng)計值.

4 結 論

我們實驗結合理論研究了兩種不同流動性磷脂包裹顆粒的內吞過程. 發(fā)現高流動性膜可以通過融合的方式進入細胞, 而低流動性膜只能通過胞飲形式進入細胞. 前者相對后者的膜融合的勢壘更低, 內吞效率也更高. 研究表明了包膜顆粒的表面生物膜物理性質可以顯著影響粒子的內吞方式與細胞內的空間分布. 結果深化了包膜顆粒中磷脂重排對內吞影響的理解, 為后續(xù)設計與制備復雜的納米載藥體系用于生物醫(yī)學治療提供了參考.