急性減壓缺氧對大鼠氧化應(yīng)激損傷的研究

高迎春，孟盼盼，郭建魁，何 蕾，曹琪璐，張 俊

高原地區(qū)空氣中氧氣的含量隨著海拔高度的增加而降低，青藏高原的平均含氧量僅為海平面的60%[1]。當(dāng)人快速進(jìn)入高原地區(qū)時，空氣中的氧分壓下降，血氧飽和度迅速降低，造成人體組織器官的缺氧性損傷，甚至引發(fā)急性高原病，嚴(yán)重時導(dǎo)致死亡[2]。在高原缺氧環(huán)境下，機(jī)體內(nèi)的自由基代謝發(fā)生紊亂，自由基的含量異常增高，引起脂質(zhì)過氧化，損傷生物大分子和細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致氧化-抗氧化系統(tǒng)功能失衡，進(jìn)而使機(jī)體發(fā)生氧化性損傷[3-4]。近年來，隨著高原經(jīng)濟(jì)建設(shè)的發(fā)展和交通設(shè)施的完善，越來越多的高原從業(yè)者和旅游者需要進(jìn)入高原地區(qū)，因此，明確高原病的發(fā)病因素及防護(hù)機(jī)制，提高急進(jìn)高原人群的缺氧耐受力至關(guān)重要[5-6]。本研究通過采用大型低壓低氧動物實驗艙模擬高原海拔8000 m，對缺氧12、24、48 h大鼠心、腦組織進(jìn)行病理觀察和氧化應(yīng)激相關(guān)生化指標(biāo)測定，評價高原缺氧不同時間對心、腦組織損傷的影響，以期為高原疾病防治研究提供科學(xué)的實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實驗動物 SPF級Wistar雄性大鼠40只，體重180～220 g。購自蘭州大學(xué)動物科。合格證號：SCXK(京)2016-0006。飼養(yǎng)于聯(lián)勤保障部隊第九四〇醫(yī)院動物實驗科。

1.2儀器 FLYDWC50-ⅡA型低壓低氧動物實驗艙(中航工業(yè)貴州風(fēng)雷航空軍械有限責(zé)任公司)；SpectraMax i3全自動熒光酶標(biāo)儀(美國Molecular Devices 公司)；IMS-20制冰機(jī)(常熟雪科電器有限公司)；水浴鍋(上海醫(yī)療器械七廠)；高速離心機(jī)(德國Appendorf公司)；L486型-806超低溫冰箱(海爾Biochemical儀器有限公司)；Vortex渦旋儀(海門市其林貝爾儀器)；DK-8A型電熱恒溫水槽(上海精宏實驗設(shè)備有限公司)。

1.3藥品與試劑 甲醛(分析純，成都金山化學(xué)試劑有限公司)；生理鹽水(四川科倫藥業(yè)，批號:C215101607)；10%水合氯醛溶液(解放軍第一醫(yī)院，批號：20150523)；乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒(批號：20161219)；考馬斯亮藍(lán)法蛋白試劑盒(批號：20161203)；BCA法蛋白試劑盒(批號：20161212)；乳酸(LD)試劑盒(批號：20170106)；過氧化氫(H2O2)試劑盒(批號：20161219)；過氧化氫酶(CAT)試劑盒(批號：20161220)；谷胱甘肽(GSH)試劑盒(批號：20161209)；谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)試劑盒(批號：20161220)；總超氧化物歧化酶(T-SOD)試劑盒(批號：20161221)；糖原試劑盒(批號：20161230)；一氧化氮(NO)試劑盒(批號:20161216);一氧化氮合酶(NOS)試劑盒(批號：20161219)。以上試劑盒均由南京建成提供。

1.4缺氧方法 取SPF級健康Wistar雄性大鼠，適應(yīng)飼養(yǎng)3 d后隨機(jī)分為常氧對照組、缺氧12、24、48 h組，每組10只。常氧對照組大鼠不缺氧，其余3組置于大型低壓低氧動物實驗艙中，以10 m/s速度減壓上升至海拔8000 m高度，分別缺氧12、24、48 h。缺氧相應(yīng)時間完成后，以20 m/s速度將氧艙海拔降至3500 m，將大鼠立即處死，取心、腦組織檢測相關(guān)指標(biāo)。

1.5心肌組織和腦組織顯微結(jié)構(gòu)觀察 每組各取2只大鼠取其心、腦組織，經(jīng)生理鹽水漂洗放入10%甲醛溶液中浸泡1周后，將樣品送至聯(lián)勤保障部隊第九四〇醫(yī)院病理科，進(jìn)行石蠟包埋，組織切片，染色以及光鏡觀察。

1.6心肌組織和腦組織超顯微結(jié)構(gòu)觀察 每組各取2只大鼠，取其心、腦組織，并立即投入新鮮固定液中(2.5%戊二醛)固定1周后，取出用鋒利刀片切成1 mm的小塊。樣品送往蘭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院電鏡室，進(jìn)行浸透與包埋工作以及電鏡觀察。

1.7心肌組織和腦組織生化指標(biāo)測定 取大鼠心、腦組織標(biāo)本，準(zhǔn)確稱取各組織重量后，加入9倍冰生理鹽水，使用組織勻漿器在冰水浴中勻漿，3500 r/min，離心10 min，取上清于-80℃保存待測。指標(biāo)測定方法按照說明書要求進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1減壓缺氧對大鼠心、腦組織顯微結(jié)構(gòu)的影響 常氧對照組大鼠腦組織結(jié)構(gòu)正常，細(xì)胞形態(tài)完好，血管清晰可見；與常氧對照組比較，缺氧后大鼠腦組織血管、神經(jīng)細(xì)胞和膠質(zhì)細(xì)胞周圍間隙明顯擴(kuò)大，細(xì)胞核染色質(zhì)不均勻，呈空泡狀或網(wǎng)狀，間質(zhì)內(nèi)空泡狀結(jié)構(gòu)增多，且損傷程度隨著缺氧時間的延長而加重。見圖1。常氧對照組大鼠心組織結(jié)構(gòu)正常，細(xì)胞形態(tài)完好，心肌纖維排列整齊；與常氧對照組比較，心肌組織損傷隨著缺氧時間的延長而加重，肌細(xì)胞腫脹，肌纖維增粗排列不整齊，胞核增大深染，缺氧24 h后，心肌細(xì)胞空泡變性；至缺氧48 h后損傷尤其嚴(yán)重，肌纖維中部分肌原纖維溶解。見圖2。

2.2減壓缺氧對大鼠心、腦組織超顯微結(jié)構(gòu)的影響 常氧對照組大鼠神經(jīng)元細(xì)胞核膜平整光滑，異染色質(zhì)少，常染色質(zhì)多，細(xì)胞器多，且狀態(tài)良好；與常氧對照組比較，缺氧組大鼠神經(jīng)細(xì)胞組織損傷隨著缺氧時間的延長而加重，缺氧12 h后，血管間隙腫脹，神經(jīng)元細(xì)胞正常；缺氧24 h后損傷較12 h嚴(yán)重，線粒體腫脹，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，血管間隙腫脹；缺氧48 h后損傷最嚴(yán)重，血管外周間隙腫脹，細(xì)胞核凋亡早期內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張。見圖3。常氧對照組大鼠心肌纖維排列密集有序，肌絲連接處整齊，肌絲明暗帶交替明顯，寬度正常，線粒體圓形，形態(tài)良好，膜完整；與常氧對照組比較，缺氧12、24 h損傷較輕，缺氧12 h后，肌纖維輕度溶解；缺氧24 h后，血管輕度腫脹，肌質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張；至缺氧48 h可見明顯損傷，線粒體腫脹，受損嚴(yán)重的部分出現(xiàn)收縮帶，肌節(jié)縮短。見圖4。

圖1 4組大鼠腦組織病理觀察結(jié)果(HE×400)

A.常氧對照組；B.缺氧12 h組；C.缺氧24 h組；D.缺氧48 h組

圖2 4組大鼠心組織病理觀察結(jié)果(HE×400)

A.常氧對照組；B.缺氧12 h組；C.缺氧24 h組；D.缺氧48 h組

圖3 模擬高原缺氧不同時間對腦組織神經(jīng)元細(xì)胞的影響(×10 000)

A.常氧對照組；B.缺氧12 h組；C.缺氧24 h組；D.缺氧48 h組

圖4 模擬高原缺氧不同時間對心肌肌纖維的影響(×10 000)

A.常氧對照組；B.缺氧12 h組；C.缺氧24 h組；D.缺氧48 h組

2.3減壓缺氧對大鼠心、腦組織氧化應(yīng)激相關(guān)生化指標(biāo)的影響 與常氧對照組比較，缺氧組大鼠心組織CAT活力隨缺氧時間延長呈先降低后逐漸升高的趨勢，缺氧12 h降低顯著，缺氧24、48 h高于缺氧12 h，且缺氧48 h高于缺氧24 h(P<0.05，P<0.01)。與常氧對照組比較，缺氧組心組織H2O2含量呈先升高后逐漸降低的趨勢，缺氧12、24 h升高顯著，缺氧48 h低于缺氧12、24 h(P<0.05，P<0.01)。與常氧對照組比較，缺氧組心組織GSH含量在缺氧24、48 h時顯著降低，且缺氧24、48 h低于缺氧12 h(P<0.05，P<0.01)。與常氧對照組比較，缺氧組心組織T-SOD活力呈先降低后逐漸升高的趨勢，缺氧12 h降低顯著，且缺氧48 h高于缺氧12 h(P<0.05，P<0.01)；MDA含量呈先升高后降低趨勢，但僅缺氧24 h組高于常氧對照組(P<0.05)。與常氧對照組比較，缺氧組腦組織CAT活力呈先降低后逐漸升高的趨勢，缺氧12、24 h顯著降低，但缺氧48 h開始升高，且高于缺氧12、24 h(P<0.05)。缺氧組腦組織H2O2含量隨缺氧時間延長逐漸升高，缺氧48 h高于常氧對照組(P<0.05)，與缺氧12、24 h組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。與常氧對照組比較，缺氧組腦組織GSH含量隨著缺氧時間的延長逐漸降低(P<0.05)，但各缺氧組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。缺氧組腦組織T-SOD活力呈降低趨勢，缺氧24、48 h低于常氧對照組和缺氧12 h(P<0.05,P<0.01)；MDA含量缺氧12 h后逐漸升高，但僅缺氧48 h高于常氧對照組，且高于缺氧12、24 h組(P<0.05,P<0.01)。見表1。

表1 4組大鼠心、腦組織氧化應(yīng)激相關(guān)生化指標(biāo)變化

注：CAT為過氧化氫酶,GSH為谷胱甘肽，H2O2為過氧化氫,T-SOD為總超氧化物歧化酶，MDA為丙二醛；與常氧對照組比較，aP<0.05，bP<0.01；與缺氧12 h組比較，cP<0.05，dP<0.01；與缺氧24 h組比較，eP<0.05，fP<0.01

3 討論

當(dāng)機(jī)體長時間暴露于缺氧環(huán)境中，會使機(jī)體的內(nèi)源性抗氧化酶活性下降，打破生物體內(nèi)自由基產(chǎn)生和清除之間的動態(tài)平衡，從而自由基攻擊體內(nèi)生物大分子，導(dǎo)致機(jī)體一系列氧化性損傷[7-8]。當(dāng)機(jī)體吸入的氧氣不足時，心臟便會啟動代償機(jī)制，使血管擴(kuò)張，加速心率和加大心臟動力，增加單位時間內(nèi)的血流量，從而提高機(jī)體的攝氧能力[9]。但同時也會加重心臟的負(fù)擔(dān)，導(dǎo)致心臟病、心力衰竭等。大腦是機(jī)體內(nèi)耗氧量最大的器官之一，缺氧環(huán)境對腦代謝、腦自動調(diào)節(jié)、腦血流速度、腦血管反應(yīng)、腦功能和形態(tài)都有一定的影響，因此大腦不可避免地會受到氧化應(yīng)激的影響[10]。本研究HE染色結(jié)果顯示，大鼠腦組織缺氧后可見明顯損傷，腦組織血管、神經(jīng)細(xì)胞和膠質(zhì)細(xì)胞周圍間隙明顯擴(kuò)大，細(xì)胞核染色質(zhì)不均勻，呈空泡狀或網(wǎng)狀，間質(zhì)內(nèi)空泡狀結(jié)構(gòu)增多，但缺氧12、24、48 h損傷無明顯差異；心組織損傷隨著缺氧時間的延長而加重，肌細(xì)胞腫脹，肌纖維增粗排列不整齊，胞核增大深染，心肌細(xì)胞空泡變性，肌纖維中部分肌原纖維溶解。組織病理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，缺氧后大鼠腦組織神經(jīng)元細(xì)胞超顯微結(jié)構(gòu)受到嚴(yán)重?fù)p傷，損傷程度隨著缺氧時間的延長而加重，血管間隙腫脹，線粒體腫脹，細(xì)胞核凋亡。缺氧12、24 h對大鼠心肌纖維的超顯微結(jié)構(gòu)損傷較小，至缺氧48 h后，心肌纖維受到嚴(yán)重?fù)p傷，線粒體腫脹，受損嚴(yán)重的部分出現(xiàn)收縮帶，肌節(jié)縮短。

在正常生理情況下，機(jī)體內(nèi)產(chǎn)生的少量自由基可隨時被體內(nèi)的抗氧化物酶清除，二者處于動態(tài)平衡。但當(dāng)機(jī)體處于缺氧環(huán)境時，由于氧(O2)含量低，體內(nèi)電子積累量高，更多的電子攻擊可用O2基態(tài)形成超氧陰離子(O2-)，進(jìn)而通過鏈?zhǔn)椒磻?yīng)形成H2O2和羥基自由基(OH-)[11]，體內(nèi)產(chǎn)生的大量活性氧(ROS)攻擊生物膜中的酶和不飽和脂肪酸，引發(fā)脂質(zhì)過氧化作用，形成以MDA為主的多種過氧化物，對機(jī)體造成損傷[12-13]。同時機(jī)體的抗氧化能力防御體系包括酶促與非酶促兩個體系均受到干擾，使抗氧化酶活性(CAT、T-SOD)和GSH含量降低[14]，最終導(dǎo)致氧化-抗氧化系統(tǒng)功能失衡。本研究結(jié)果顯示，隨著缺氧時間的延長心組織H2O2、MDA含量呈先升高后降低趨勢，CAT、T-SOD活力呈先降低后升高趨勢，GSH含量缺氧12 h后開始顯著降低，其中H2O2缺氧12 h、MDA缺氧24 h升高較明顯，CAT、T-SOD缺氧12 h降低較明顯，GSH缺氧24 h降低較明顯；腦組織H2O2含量呈逐漸升高趨勢，MDA、CAT呈先降低后升高趨勢，T-SOD活力和GSH含量呈逐漸降低趨勢，其中H2O2、MDA缺氧48 h升高較明顯，CAT缺氧24 h下降較明顯，GSH、T-SOD缺氧48 h下降較明顯。

綜上所述，本實驗主要從病理學(xué)觀察、氧化/抗氧化系統(tǒng)兩方面探討了模擬海拔8000 m不同時間對大鼠心、腦組織損傷的影響，且損傷程度與缺氧時間有關(guān)，隨著缺氧時間的延長，腦組織損傷逐漸加重。但是心組織在缺氧暴露12 h時損傷較嚴(yán)重，可能是缺氧損傷與機(jī)體防衛(wèi)機(jī)制相互對抗的結(jié)果。