夏枯草膠囊對自身免疫性甲狀腺炎大鼠NF-κB通路及免疫指標的影響

李 嫚，涂瑞沙，余書勇，徐小江，尹俊峰

自身免疫性甲狀腺炎是指以機體自身甲狀腺組織作為抗原的自身免疫性疾病，又稱為橋本甲狀腺炎[1]。自身免疫性甲狀腺炎的發(fā)病機制與誘發(fā)因素較復雜，可能與遺傳、免疫及環(huán)境等多種因素有關，而甲狀腺抗體對機體而言視為破壞性抗體，會引起機體免疫調節(jié)發(fā)生改變[2]。目前該疾病無特定的治療措施，大部分患者是在甲狀腺功能減退的情況下才開始用藥治療[3]。夏枯草是唇形科、夏枯草屬的多年生草本植物，其干燥果穗可入藥，辛、苦、寒，具有清熱瀉火、明目、散結消腫的功效。夏枯草在抗菌、抗病毒、抗過敏、降血壓及血糖等方面均有顯著效果，臨床可將其用于高血壓、肺結核以及甲狀腺腫大等疾病治療[4]，還可以減輕大鼠記憶力損傷[5]。夏枯草膠囊的主要成分是夏枯草提取物，可以改善橋本甲狀腺炎患者的甲狀腺功能[6]，但關于其對自身免疫性甲狀腺炎的作用機制以及對機體自身免疫情況的研究報道較少。因此，本研究通過制備自身免疫性甲狀腺炎大鼠模型來探索夏枯草膠囊對其免疫指標及NF-κB信號通路的影響，為自身免疫性甲狀腺炎臨床治療方案制定提供參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1試劑及儀器 夏枯草膠囊(國藥準字Z19991033，聚協(xié)昌北京藥業(yè)有限公司，規(guī)格：0.35×10?！?板)，全弗式佐劑(CFA)與不全弗式佐劑(IAF)購自美國Sigma公司，腫瘤壞死因子-α(TNF-α)試劑盒(中國上海喬羽生物科技有限公司)，白介素-12(IL-12)試劑盒(中國北京冬歌博業(yè)生物科技有限公司)，IL-10試劑盒(中國上海廣銳生物科技有限公司)，干擾素-γ(INF-γ)試劑盒(中國上海機純實業(yè)有限公司)，甲狀腺過氧化物酶抗體(TPOAb)試劑盒(中國上海冠導生物工程有限公司)，甲狀腺球蛋白抗體(TGAb)試劑盒(中國上海茁彩生物科技有限公司)，NF-κB抗體(佰思諾天津生物科技有限公司)，顯微鏡(Ti2-U，NIKON)，切片機(HM 340E，賽默飛)。

1.2動物及分組 SPF級SD雄性健康大鼠50只，4～5周齡，體質量190～210 g，購于南方醫(yī)科大學，生產(chǎn)許可證號SCXK(粵)2016-0041，適應性飼養(yǎng)1周，培育室溫度為20～25℃，濕度40%～50%，人工光照晝夜時間各12 h，飲水自由。將50只SD大鼠隨機分別為對照組、模型組、干預組，干預組又分為夏枯草低劑量組、夏枯草中劑量組、夏枯草高劑量組。每組10只。

1.3實驗方法

1.3.1模型制備：制模過程參考文獻[7]，將甲狀腺球蛋白(PTg)與CFA等體積混合乳化液于大鼠足墊部皮下與背部皮下多位點注射，其中PTg注射劑量為每只100 μg，1次/周，連續(xù)2周，完成初次免疫；從第3周開始至第6周，將PTg與IAF等體積混合乳化液進行注射，PTg劑量及皮下注射方式與上相同。

1.3.2藥物干預：各組大鼠第7周開始進行藥物干預，根據(jù)夏枯草膠囊成年人服用的最大劑量、大鼠與成人藥物折算系數(shù)(W)6.25進行換算，得出大鼠夏枯草膠囊的最大使用劑量為112 mg/100 g，夏枯草低、中、高劑量組大鼠分別進行28、56、112 mg/(100 g·d)灌胃干預，模型組及對照組大鼠灌胃等體積的生理鹽水，連續(xù)干預4周。

1.4檢測指標 藥物干預結束后，采取組織及血液，觀察各組大鼠甲狀腺病理組織變化，檢測甲狀腺激素水平[血清三碘甲狀腺素(T3)、甲狀腺素(T4)、促甲狀腺素(TSH)]、自身免疫抗體(TGAb、TPOAb)水平、炎性因子(IL-10、IL-12、TNF-α、INF-γ)水平以及甲狀腺組織中NF-κB蛋白水平，檢測各組大鼠甲狀腺組織中Bax、Bcl-2基因相對表達量。

1.4.1HE染色：末次給藥后次日，麻醉處死大鼠，取出甲狀腺組織，一部分甲狀腺組織固定于10%甲醛中性溶液中，經(jīng)常規(guī)石蠟切片，蘇木精、伊紅染色、脫水、透明、固定封片，于顯微鏡下觀察各組大鼠甲狀腺組織病理結構。

1.4.2蛋白免疫印跡(Western blot)：將采集的甲狀腺組織一部分置于-80℃超低溫冰箱存儲，用于Western blot與RT-PCR實驗，提取組織總蛋白，調整蛋白質濃度，經(jīng)SDS-PAGE電泳、膜轉移至PVDF膜，加入NF-κB、β-actin一抗，于4℃條件下孵育過夜，再用TBST漂洗40 min，分為3次漂洗，再加入經(jīng)HRP標記的二抗繼續(xù)孵育1 h，根據(jù)ECL試劑盒說明書對蛋白條帶進行顯影、定影，觀察各組蛋白條帶成像情況，并進行蛋白條帶分析。

1.4.3RT-PCR：采用Trizol試劑盒提取甲狀腺組織的總RNA，根據(jù)逆轉錄cDNA試劑盒說明書逆轉錄生成cDNA，參考RT-PCR試劑盒說明書進行PCR反應體系配比、擴增體系設置，所用內參基因及Bax、Bcl-2引物均由上海生工提供，以2-ΔΔCt計算目標基因的相對表達量。

1.4.4甲狀腺激素、自身免疫抗體及炎性因子檢測：末次給藥后次日，麻醉各組大鼠，采取心臟血2 ml，3000 r/min離心20 min，取上層血清用于實驗，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測TGAb、TPOAb、T3、T4、TSH、IL-10、IL-12、TNF-α、INF-γ水平，詳細操作過程參考試劑盒說明書。

2 結果

2.1大鼠甲狀腺組織病理情況比較 采用HE染色觀察各組大鼠甲狀腺組織病理情況，結果顯示對照組甲狀腺濾泡形狀橢圓形，且大小均勻排列，濾泡中充滿膠質，無炎性浸潤；模型組大鼠甲狀腺濾泡形狀不規(guī)則，有劈裂情況，且濾泡間隙增大，濾泡中膠質較少，有明顯炎性浸潤；夏枯草組甲狀腺濾泡形態(tài)較模型組規(guī)則，濾泡腔內含有膠質，炎性浸潤減少。見圖1。

2.2大鼠T3、T4、TSH比較 模型組與夏枯草低、中、高劑量組血清T3、T4、TSH水平均明顯高于對照組(P<0.05)；夏枯草低、中、高劑量組血清T3、T4、TSH水平低于模型組，且隨著劑量的增加而逐漸降低(P<0.05)。見表1。

表1 5組大鼠血清T3、T4、TSH水平比較

注：夏枯草低、中、高劑量組分別給予夏枯草膠囊28、56、112 mg/(100 g·d)；T3為血清三碘甲狀腺素，T4為甲狀腺素，TSH為促甲狀腺素；與對照組比較，aP<0.05；與模型組比較，cP<0.05；與夏枯草低劑量組比較，eP<0.05；與夏枯草中劑量組比較，gP<0.05

2.3大鼠自身免疫抗體水平 模型組與夏枯草低、中、高劑量組TGAb、TPOAb水平均高于對照組(P<0.05)；夏枯草低、中、高劑量組TGAb、TPOAb水平均低于模型組，且隨著劑量的增加而逐漸降低(P<0.05)。見表2。

2.4大鼠血清炎性因子水平 模型組與夏枯草低、中、高劑量組血清IL-12、TNF-α、INF-γ水平高于對照組，而IL-10水平低于對照組(P<0.05)；夏枯草低、中、高劑量組血清IL-12、TNF-α、INF-γ水平低于模型組，而IL-10水平高于模型組，且呈劑量依賴性(P<0.05)。見表3。

表2 5組大鼠TGAb、TPOAb水平比較

注：夏枯草低、中、高劑量組分別給予夏枯草膠囊28、56、112 mg/(100 g·d)；TGAb為甲狀腺球蛋白抗體，TPOAb為甲狀腺過氧化物酶抗體；與對照組比較，aP<0.05；與模型組比較，cP<0.05；與夏枯草低劑量組比較，eP<0.05；與夏枯草中劑量組比較，gP<0.05

表3 5組大鼠血清炎性因子水平比較

注：夏枯草低、中、高劑量組分別給予夏枯草膠囊28、56、112 mg/(100 g·d)；IL-10為白介素-10，IL-12為白介素-12，TNF-α為腫瘤壞死因子-α，INF-γ為干擾素-γ；與對照組比較，aP<0.05；與模型組比較，cP<0.05；與夏枯草低劑量組比較，eP<0.05；與夏枯草中劑量組比較，gP<0.05

2.5大鼠NF-κB、Bax、Bcl-2水平 模型組與夏枯草低、中、高劑量組NF-κB蛋白水平高于對照組，Bcl-2 mRNA水平低于對照組(P<0.05)；模型組Bax mRNA水平高于對照組，夏枯草低、中、高劑量組Bax mRNA水平均低于對照組(P<0.05)；夏枯草低、中、高劑量組NF-κB蛋白和Bax mRNA水平均低于模型組，而Bcl-2 mRNA水平高于模型組(P<0.05)。見圖2、表4。

圖2 5組大鼠甲狀腺組織NF-κB蛋白水平蛋白免疫印跡結果

1.對照組；2.模型組；3.夏枯草低劑量組；4.夏枯草中劑量組；5.夏枯草高劑量組

表4 5組大鼠甲狀腺組織NF-κB蛋白與Bax、Bcl-2基因水平比較

注：夏枯草低、中、高劑量組分別給予夏枯草膠囊28、56、112 mg/(100 g·d)；與對照組比較，aP<0.05；與模型組比較，cP<0.05；與夏枯草低劑量組比較，eP<0.05；與夏枯草中劑量組比較，gP<0.05

3 討論

自身免疫性甲狀腺炎屬于免疫性疾病，臨床常采用甲狀腺激素替代治療、免疫治療等措施，病情嚴重者會采取手術治療。西藥在自身免疫性甲狀腺炎治療過程中取得較好療效，尤其當患者出現(xiàn)其他急癥時，西藥治療可以快速緩解患者的病情，但是單純西醫(yī)治療也存在不良反應多的局限性。中醫(yī)認為自身免疫性甲狀腺炎屬于“癭病”及“虛勞”的范疇，其發(fā)病與飲食失調、七情內傷、先天失養(yǎng)等多種因素有關。夏枯草膠囊是夏枯草中藥制劑，具有抗病毒、抗炎以及降血糖等多種功效，廣泛應用于臨床[8]。本研究結果顯示，自身免疫性甲狀腺炎大鼠的甲狀腺濾泡呈現(xiàn)出形狀不規(guī)則，間隙較大且其中膠質較少，還有炎性浸潤，而夏枯草膠囊干預可以明顯減輕這種病理變化，表明夏枯草膠囊對自身免疫性甲狀腺炎大鼠的甲狀腺組織結構損傷有較好的保護作用。

甲狀腺能夠調節(jié)機體能量代謝速度、機體合成蛋白以及調節(jié)機體對多種激素的敏感性，行使這些功能主要是通過甲狀腺素來實現(xiàn)。本研究結果顯示，模型組血清T3、T4水平升高，同時還發(fā)現(xiàn)血清TSH、TGAb、TPOAb含量也增加，提示自身免疫性甲狀腺炎大鼠的甲狀腺功能呈現(xiàn)出減退情況。夏枯草膠囊干預后可以降低大鼠血清T3、T4、TSH、TGAb、TPOAb含量，此結果與俞靈鶯等[9]研究結果相似，由此表明夏枯草膠囊可以改善自身免疫性甲狀腺炎大鼠的甲狀腺功能。甲狀腺組織病理結果以及機體血清學指標均表明自身免疫性甲狀腺炎大鼠的甲狀腺功能存在損傷，而夏枯草膠囊干預治療可以緩解這種情況，也證實夏枯草膠囊確實可以用于治療此類疾病。

淋巴細胞以及自身抗體介導的免疫反應也參與自身免疫性甲狀腺炎的發(fā)生，如Th細胞介導產(chǎn)生的炎性因子。Th1細胞可以分泌TNF-α以及INF-γ等細胞因子，參與機體細胞免疫[10]。Th2細胞可以分泌IL-10、IL-6等因子，參與機體體液免疫[11]。IL-12主要是由B細胞、巨噬細胞產(chǎn)生，能夠促進活性T細胞增殖，促進Th0細胞向Th1細胞分化，同時還可以誘導細胞毒性T淋巴細胞(CTL)與NK細胞的毒性并促進其分泌TNF-α、INF-γ等細胞因子[12-13]。本研究結果顯示，與對照組比較，模型組大鼠血清IL-12、TNF-α、INF-γ水平增高，IL-10含量降低，而夏枯草膠囊干預后可以降低大鼠血清IL-12、TNF-α、INF-γ水平，提高IL-10含量。王永清等[14]認為夏枯草可通過有效降低毒性彌漫性甲狀腺炎患者自身抗體水平來調節(jié)機體的異常免疫功能，減輕機體的炎性反應，改善患者甲狀腺功能。由此推測夏枯草膠囊可能通過調節(jié)機體IL-12、TNF-α、INF-γ、IL-10水平來降低自身免疫性甲狀腺炎大鼠機體炎性反應。TNF-α作為促炎因子之一，其與體內多種炎性信號通路活化有關，包括NF-κB信號通路。在免疫性疾病的研究中發(fā)現(xiàn)，TNF-α能夠激活NF-κB信號通路，再反向啟動TNF-α的轉錄，形成正反饋環(huán)[15]。本研究結果顯示，模型組大鼠甲狀腺組織中的NF-κB蛋白水平明顯高于對照組，由此推測，NF-κB信號通路在自身免疫性甲狀腺炎大鼠呈現(xiàn)出活化狀態(tài)。

Cho等[16]研究發(fā)現(xiàn)，夏枯草水性提取物可以通過抑制NF-κB/Snail信號通路以及調節(jié)上皮間質轉化相關蛋白水平抑制腫瘤細胞侵襲、轉移，具有抑制惡性腫瘤轉移的活性。本研究結果顯示，夏枯草膠囊干預治療可以降低自身免疫性甲狀腺炎大鼠NF-κB蛋白水平，由此推測夏枯草膠囊可以抑制自身免疫性甲狀腺炎大鼠NF-κB信號通路激活。激活NF-κB信號通路不僅可以促進TNF-α轉錄，還可以促進其下游凋亡、增殖等相關蛋白表達，參與機體的免疫應答反應、炎性反應以及細胞凋亡等多種生理或病理過程[17]。Bcl-2基因過量表達可以抑制細胞凋亡，Bax基因過量表達會促進細胞凋亡，二者在細胞凋亡進程起著拮抗作用[18-19]。本研究結果顯示，夏枯草可以降低自身免疫性甲狀腺炎大鼠Bax基因表達，促進Bcl-2基因表達。余欣然等[7]研究顯示，夏枯草膠囊可以抑制甲狀腺濾泡細胞的凋亡，從而減輕甲狀腺功能損傷。祁崗等[20]研究顯示，自身免疫性甲狀腺炎小鼠甲狀腺組織中Bcl-2呈現(xiàn)出高表達現(xiàn)象，本研究結果與報道不一致，分析原因為可能還存在其他作用途徑來調控基因表達，還需要進一步研究。

綜上所述，夏枯草膠囊對自身免疫性甲狀腺炎大鼠的甲狀腺功能有一定的改善作用，還能調節(jié)機體自身免疫抗體水平，可能是通過降低IL-12、TNF-α、INF-γ水平，增加IL-10含量來減輕機體的炎性反應，還有可能是通過抑制NF-κB信號通路活化，降低其介導的炎性反應；同時還可以影響凋亡相關基因表達，但其中作用機制還需要更深層次研究。