• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    豬鏈球菌2型滅活疫苗對小鼠的免疫效果評價(jià)

    2020-04-28 10:43:12段倩倩毛天驕韓業(yè)芹韓雪姣魏建忠
    關(guān)鍵詞:商品化佐劑豬鏈球菌

    段倩倩,毛天驕,韓業(yè)芹,韓雪姣,魏建忠,孫 裴,李 郁

    (安徽農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院,安徽 合肥 230036)

    豬鏈球菌(Streptococcussuis,SS)是一類重要的人獸共患病原菌,不僅可引起豬的關(guān)節(jié)炎、腦膜炎、敗血癥、心肌炎和突發(fā)性死亡,還能感染相關(guān)人員,引起人腦膜炎、感染性休克、甚至死亡,威脅公共衛(wèi)生及食品安全。根據(jù)細(xì)胞壁莢膜多糖抗原特性的不同可將其分為35個(gè)血清型(1-34型和1/2型),其中1、2、7、9型為致病型,且以豬鏈球菌2型(Streptococcussuisserotype 2,SS2)的致病性最強(qiáng),在我國的流行范圍最廣,且易與其他細(xì)菌或病毒混合感染,嚴(yán)重影響?zhàn)B豬業(yè)的發(fā)展,造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1]。

    豬鏈球菌的防治主要依靠疫苗接種[2]。臨床上常用的豬鏈球菌病疫苗包括滅活疫苗、弱毒疫苗和基因工程亞單位疫苗。弱毒疫苗免疫效果強(qiáng)且持久,但是運(yùn)輸、保存條件要求高,毒力易返祖,安全性差;基因工程亞單位疫苗抗原性差。滅活疫苗具有安全性強(qiáng)、研制周期短、易于保存和運(yùn)輸?shù)葍?yōu)點(diǎn),在實(shí)際生產(chǎn)中被廣泛使用[3]。本研究在前期篩選出2株毒力強(qiáng)、抗原性好、遺傳穩(wěn)定的SS2疫苗菌株(HF2、HF3株)并分別制成滅活疫苗(采用ISA 201 VG礦物油佐劑)的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步與商品化滅活疫苗(HA9801株,鋁膠佐劑)同步免疫小鼠,進(jìn)行免疫效果評價(jià),從而為豬鏈球菌病的防控和聯(lián)合疫苗的研制提供科學(xué)依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 疫苗

    豬鏈球菌2型滅活疫苗(HF2、HF3疫苗)由安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物傳染病實(shí)驗(yàn)室制備。疫苗所用菌株是由本實(shí)驗(yàn)室自臨床病例分離鑒定并通過致病性、抗原性、穩(wěn)定性試驗(yàn)篩選出的2株毒力強(qiáng)、抗原性好、遺傳穩(wěn)定的SS2菌株(HF2、HF3株),佐劑為ISA 201 VG礦物油佐劑。HF2株對昆明鼠和斑馬魚的半數(shù)致死量(median lethal dose,LD50)分別為5.01×108、0.6×102CFU·mL-1,HF3株對昆明鼠和斑馬魚的LD50分別為3.24×108、2.34×103CFU·mL-1[4]。商品化豬鏈球菌2型滅活疫苗(HA9801株,鋁膠佐劑)購自廣東永順生物制藥股份有限公司(生產(chǎn)批號:2018003)。

    1.1.2 攻毒菌株

    BZ1株由本實(shí)驗(yàn)室分離自臨床患急性敗血癥病豬,經(jīng)鑒定為SS2強(qiáng)毒株,對昆明鼠和斑馬魚的LD50分別為3.31×108、0.9×102CFU·mL-1。國內(nèi)強(qiáng)毒參考株HA9801、ZY05719對斑馬魚的LD50分別為3.42×105、3.58×105CFU·mL-1[5]。

    1.1.3 試驗(yàn)動(dòng)物

    體質(zhì)量18~22 g SPF級雌性昆明鼠購于安徽醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。

    1.1.4 主要試劑

    TMB顯色液、脫脂奶粉購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體購自美國博士德生物工程有限公司;細(xì)胞因子ELISA檢測試劑盒(IL-4、IL-10、IFN-γ、TFN-β、MCP-1)購自美國RB公司;流式細(xì)胞抗體試劑盒購自美國BD公司;胰酪胨大豆酵母浸膏瓊脂(TSA-YE)、純化瓊脂粉均購自紹興天恒生物科技有限公司;甲醛溶液購自上海蘇懿化學(xué)試劑有限公司。

    1.2 方法

    1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

    取200只小鼠隨機(jī)分為4組(編號為A、B、C、D),試驗(yàn)組(A-C)各40只,對照組(D)80只。A、B、C組分別頸部皮下注射HF2、HF3滅活疫苗和HA9801商品化滅活疫苗,每只注射0.2 mL,D組注射等體積生理鹽水。免疫2次,間隔14 d。

    1.2.2 血清中IgG抗體水平和細(xì)胞因子測定

    小鼠一免14 d和二免7 d后,采集各組小鼠血清,參考文獻(xiàn)[6]方法測定血清中IgG抗體水平,使用試劑盒檢測小鼠血清中細(xì)胞因子(IL-4、IL-10、IFN-γ、TNF-β、MCP-1)含量。

    1.2.3 外周血中T淋巴細(xì)胞亞群含量測定

    于一免14 d和二免7 d后,經(jīng)斷尾處理采集小鼠外周血液,吸取100 μL抗凝血至2 mL無菌離心管,加入1.8 mL紅細(xì)胞裂解液,充分混勻,在4 ℃冰箱中靜置30 min,1 400 r·min-1離心5 min,去上清,加入1.8 mL PBS緩沖液(pH=7.2)反復(fù)吹洗,1 400 r·min-1離心10 s,棄去多余液體,保留約200~300 μL液體和沉淀于管底,吹打混勻,添加熒光標(biāo)記的抗鼠CD3+、CD4+、CD8+T細(xì)胞單克隆抗體,將樣品混勻后置4 ℃冰箱避光孵育30 min,用無菌PBS緩沖液(pH 7.2)洗滌孵育后的樣品,2 500 r·min-1離心5 min,棄上清液,加入200~300 μL無菌PBS緩沖液(pH=7.2),吹打混勻。將各組細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至流式管,使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。

    1.2.4 小鼠攻毒試驗(yàn)

    小鼠二免7 d后,A、B、C組各選10只小鼠作為試驗(yàn)組;D組隨機(jī)抽取20只,平均分為2組,分別是攻毒對照組(D1組)和陰性對照組(D2組)。用BZ1株對試驗(yàn)組和攻毒對照組小鼠進(jìn)行腹腔攻毒,攻毒劑量為4.29×109CFU.mL-1;陰性對照組注射等體積生理鹽水。攻毒后,觀察各組小鼠的精神狀態(tài)、食欲及死亡情況,計(jì)算各組小鼠免疫保護(hù)率。攻毒7 d后,采集小鼠肺、肝、脾和腎臟樣品,置于1.5 mL離心管中,按比例加無菌PBS緩沖液研磨。將組織懸液稀釋至100、10-1、10-2后,分別取100 μL均勻涂布于TSA-YE固體培養(yǎng)基,37 ℃培養(yǎng)18 h,統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)。攻毒7 d后,采集小鼠肺、肝、脾和腎臟樣品置于福爾馬林中進(jìn)行固定和保存,送至安徽醫(yī)科大學(xué)制作病理組織切片。

    1.2.8 數(shù)據(jù)處理

    使用SPSS 20.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析,采用Graphpad Prime 7.0軟件繪圖。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 血清中IgG抗體水平

    由表1可知,一免14 d后,各試驗(yàn)組小鼠血清中IgG抗體效價(jià)分別為1∶6 400、1∶6 400、1∶12 800,A組和B組IgG抗體水平最高;二免7 d后,A、B、C組IgG抗體效價(jià)均有不同程度的上升,分別為1∶25 600、1∶12 800、1∶25 600,A組和C組IgG抗體水平最高。

    2.2 血清中細(xì)胞因子含量

    由圖1可知,二免7 d后,各試驗(yàn)組小鼠血清中細(xì)胞因子含量均顯著(P<0.05)高于對照組。HF2滅活疫苗免疫組(A組)小鼠血清中IL-4、IL-10含量顯著(P<0.05)高于HF3滅活疫苗免疫組(B組)和HA9801商品化滅活疫苗免疫組(C組),且B組和C組間差異顯著(P<0.05)。A組IFN-γ含量顯著(P<0.05)高于B組,但與C組差異不顯著(P>0.05)。C組TNF-β含量顯著(P<0.05)高于A、B組,且A組和B組差異顯著(P<0.05)。B組MCP-1含量顯著(P<0.05)高于A、C組,但A組和C組差異不顯著(P>0.05)。結(jié)果顯示,各疫苗組均可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生較高水平的細(xì)胞因子,其中HF2滅活疫苗誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生細(xì)胞因子(IL-4、IL-10、IFN-γ、TNF-β)的能力優(yōu)于HF3滅活疫苗。

    2.3 外周血中T淋巴細(xì)胞亞群含量

    表1 小鼠血清中IgG抗體水平

    Table 1 Detection of serum IgG antibody in mice

    組別一免14 d后二免7 d后Group14 days after the firstimmunization 7 days after the secondimmunizationA1∶64001∶25600B1∶64001∶12800C1∶128001∶25600

    不同柱上無相同小寫字母的表示差異顯著(P<0.05)。下同。 Bars marked without the same letters indicated significant (P<0.05) difference. The same as below.圖1 小鼠血清中細(xì)胞因子含量Fig.1 Determination of serum cytokine levels after immunization of mice

    由圖2可知,一免14 d后,各試驗(yàn)組CD4+/CD3+、CD8+/CD3+均顯著(P<0.05)高于對照組。二免7 d后,各試驗(yàn)組CD8+/CD3+呈上升趨勢。其中,HA9801商品化滅活疫苗免疫組(C組)小鼠外周血中CD4+/CD3+顯著(P<0.05)高于HF2滅活細(xì)胞免疫組(A組)和HF3滅活疫苗免疫組(B組),但A組和B組差異不顯著(P>0.05);各試驗(yàn)組CD8+/CD3+呈上升趨勢,但組間差異不顯著(P>0.05)。

    2.4 小鼠存活率

    攻毒對照組(D1組)小鼠均死亡,陰性對照組(D2組)小鼠均存活。各試驗(yàn)組中,A、B、C組的免疫保護(hù)率均為100%。結(jié)果表明,HF2、HF3滅活疫苗和HA9801商品化滅活疫苗免疫小鼠均能產(chǎn)生良好的免疫保護(hù)力。

    2.5 內(nèi)臟組織荷菌數(shù)測定結(jié)果

    由圖3可知,各試驗(yàn)組小鼠組織器官的細(xì)菌定植量均顯著(P<0.05)低于攻毒對照組(D1組)。HF2滅活疫苗免疫組(A組)小鼠肺臟的細(xì)菌定植量顯著(P<0.05)低于HF3滅活疫苗免疫組(B組)和HA9801商品化滅活疫苗免疫組(C組)。各試驗(yàn)組肝臟、腎臟的細(xì)菌定植量差異不顯著(P>0.05)。A、C組脾臟的細(xì)菌定植量均顯著(P<0.05)低于B組。結(jié)果表明,滅活疫苗免疫組小鼠均能有效清除SS2在體內(nèi)的定植。

    圖2 小鼠外周血中CD4+、CD8+細(xì)胞亞群在總T細(xì)胞中所占百分比Fig.2 The percentage of CD4+, CD8+ T subsets in CD3+ T cells in peripheral blood of mice

    2.6 病理組織學(xué)觀察結(jié)果

    各處理組小鼠組織病理學(xué)觀察結(jié)果見圖4-7。攻毒對照組(D1組)病變最為顯著,表現(xiàn)為:肺臟充血,肺泡壁增厚,可見明顯的炎癥細(xì)胞浸潤;肝臟整體結(jié)構(gòu)異常,肝細(xì)胞排列紊亂,固縮壞死,肝竇間隙輕微增大;脾臟整體結(jié)構(gòu)異常,紅髓白髓分界不清,玻璃樣變;腎小管上皮細(xì)胞脫落水腫,組織間輕微瘀血,大量炎癥細(xì)胞浸潤。陰性對照組(D2組)無明顯病理變化。

    圖3 攻毒小鼠各組織器官中的含菌量Fig.3 Bacterial survival in mouse blood and organs after infection

    圖4 各組小鼠肺臟病理組織學(xué)變化(HE染色,10×20)Fig.4 Pathological changes of lung in mice of each group (HE staining, 10×20)

    各試驗(yàn)組中,A、B、C組的肺、肝、脾、腎臟均有不同程度的病變。其中,A組肺、肝臟均有輕微充血,肝、脾、腎臟均可見少量炎癥細(xì)胞浸潤;B組肺、肝、脾、腎臟均可見不同程度的炎癥細(xì)胞浸潤,肺臟輕微充血且肺泡壁輕微增厚,腎臟組織間輕微瘀血;C組肺、肝臟均輕微充血且有少量炎癥細(xì)胞浸潤,肺泡壁輕微增厚,肝臟竇間隙輕微增寬,脾臟可見明顯中性粒細(xì)胞浸潤,腎臟組織間質(zhì)明顯瘀血,少量腎小管上皮細(xì)胞脫落水腫。

    3 討論

    豬鏈球菌病是一種重要的人畜共患病,而豬鏈球菌(SS)是引起該病最主要的病原。在SS的35個(gè)血清型中,SS2最為常見,流行最廣且致病性最強(qiáng)。疫苗免疫接種是預(yù)防和控制豬鏈球菌病傳播的有效措施。滅活疫苗具有研制周期短、安全可靠、易于保存等優(yōu)點(diǎn),因此在生產(chǎn)實(shí)際中使用最為廣泛。

    圖5 各組小鼠肝臟病理組織學(xué)變化(HE染色,10×20)Fig.5 Pathological changes of liver in mice in each group (HE staining, 10×20)

    圖6 各組小鼠脾臟病理組織學(xué)變化(HE染色,10×20)Fig.6 Pathological changes of spleen in mice of each group (HE staining, 10×20)

    圖7 各組小鼠腎臟病理組織學(xué)變化(HE染色,10×20)Fig.7 Pathological changes of kidney in mice of each group (HE staining, 10×20)

    滅活疫苗的免疫效果與其制苗菌株的免疫學(xué)特性密切相關(guān)。同一血清型的不同SS菌株生物學(xué)特性和致病力存在差異[7],因此用其制備的滅活疫苗免疫效果也存在差異,從而導(dǎo)致生產(chǎn)實(shí)際中免疫失敗或免疫不確實(shí)。除此之外,滅活疫苗的免疫效果還與滅活佐劑類型有關(guān)[8]。本實(shí)驗(yàn)室自臨床病例分離鑒定43株SS2,通過毒力因子鑒定、溶血性測定、昆明鼠及斑馬魚致病性試驗(yàn)篩選出6株強(qiáng)毒株,進(jìn)一步通過菌株致病性試驗(yàn)、抗原性試驗(yàn)和穩(wěn)定性試驗(yàn),篩選出2株毒力強(qiáng)、抗原性好、遺傳學(xué)上相對穩(wěn)定的疫苗菌株(HF2、HF3),并對其培養(yǎng)條件進(jìn)行了優(yōu)化。為提高和保障制備的SS2滅活疫苗的良好抗原性,對疫苗菌株甲醛滅活條件和免疫佐劑進(jìn)行優(yōu)化、篩選,最終采用ISA 201 VG礦物油佐劑分別將其制備成滅活疫苗。為確定所研制的SS2滅活疫苗(HF2、HF3株,ISA 201 VG礦物油佐劑)的免疫效果,本研究將其與HA9801商品化滅活疫苗(HA9801株,鋁膠佐劑)同步免疫小鼠,進(jìn)行免疫效果評價(jià)。

    體液免疫應(yīng)答是清除細(xì)胞外病原體的有效機(jī)制之一,也是評價(jià)疫苗免疫效果的一個(gè)重要指標(biāo)。IgG抗體是介導(dǎo)體液免疫的主要抗體,在機(jī)體抗感染過程中發(fā)揮主力作用[9-10]。本研究中,HF2滅活疫苗和HA9801商品化滅活疫苗免疫小鼠后產(chǎn)生的IgG抗體效價(jià)均為1∶25 600,顯著高于HF3滅活疫苗,表明HF2滅活疫苗通過誘導(dǎo)IgG抗體來介導(dǎo)體液免疫的能力與HA9801商品化滅活疫苗相同,且優(yōu)于HF3滅活疫苗。

    細(xì)胞因子是一類具有多功能的蛋白分子,主要介導(dǎo)和調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答及炎癥反應(yīng),因此細(xì)胞因子水平可反映機(jī)體的免疫功能狀態(tài)[11]。Th細(xì)胞是產(chǎn)生細(xì)胞因子的重要細(xì)胞,根據(jù)其分泌性質(zhì)及功能的差異,分為Th1和Th2細(xì)胞。Th1細(xì)胞可通過分泌IFN-γ、TNF-β等,介導(dǎo)細(xì)胞毒性T細(xì)胞、遲發(fā)型超敏反應(yīng)T細(xì)胞的增殖分化,從而促進(jìn)細(xì)胞免疫應(yīng)答。Th2細(xì)胞分泌的IL-4、IL-10等細(xì)胞因子與B細(xì)胞增殖、分化及抗體生成有關(guān),因此可增強(qiáng)機(jī)體體液免疫應(yīng)答[12-14]。MCP-1可趨化單核巨噬細(xì)胞,既能介導(dǎo)體液免疫應(yīng)答,也能促進(jìn)細(xì)胞免疫應(yīng)答[15]。本研究中,二免7 d后HF2滅活疫苗組的IL-4、IL-10含量均顯著高于HA9801商品化滅活疫苗組,TNF-β含量顯著低于HA9801商品化滅活疫苗組。此外,HF2滅活疫苗組的IL-4、IL-10、IFN-γ、TNF-β細(xì)胞因子水平均顯著高于HF3滅活疫苗組,而MCP-1細(xì)胞因子水平顯著低于HF3滅活疫苗組。結(jié)果表明,HF2、HF3滅活疫苗和HA9801商品化滅活疫苗在通過誘導(dǎo)不同細(xì)胞因子來介導(dǎo)機(jī)體免疫應(yīng)答方面各有優(yōu)勢,單就HF2和HF3滅活疫苗而言,HF2滅活疫苗誘導(dǎo)Th1、Th2型免疫反應(yīng)的能力優(yōu)于HF3滅活疫苗。

    T細(xì)胞是機(jī)體免疫應(yīng)答的核心細(xì)胞,基于其白細(xì)胞分化抗原的不同分為CD4+和CD8+兩大亞群[16]。CD4+T細(xì)胞可促進(jìn)速發(fā)型變態(tài)反應(yīng),誘導(dǎo)輔助性T細(xì)胞和抑制性T細(xì)胞成熟,釋放多種淋巴因子誘發(fā)炎癥,排除抗原。CD8+T細(xì)胞可抑制B細(xì)胞產(chǎn)生抗體和其他T細(xì)胞分化增殖,從而調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答,也可在免疫效應(yīng)階段識(shí)別并溶解靶細(xì)胞[3]。有研究表明,CD4+、CD8+T細(xì)胞與細(xì)胞免疫水平呈正相關(guān)。本研究中,HF2和HF3滅活疫苗組的CD4+T細(xì)胞比率均顯著低于HA9801商品化滅活疫苗組,而HF2與HF3滅活疫苗組間無顯著性差異,且HF2、HF3滅活疫苗組和HA9801商品化滅活疫苗組的CD8+T細(xì)胞比率無顯著性差異。結(jié)果表明,HA9801商品化滅活疫苗誘導(dǎo)速發(fā)型變態(tài)反應(yīng)的能力優(yōu)于HF2和HF3滅活疫苗,而HF2滅活疫苗與HF3滅活疫苗誘導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答的能力相同。

    SS2是一種常見的豬呼吸道疾病病原體,常定植于扁桃體而不致病。當(dāng)機(jī)體抵抗力下降時(shí),SS2從扁桃體向周圍淋巴組織擴(kuò)散,進(jìn)入血液,侵襲不同組織器官,進(jìn)而引起炎癥,使機(jī)體相應(yīng)部位發(fā)生病變,造成損失或死亡。本研究對二免14 d后小鼠進(jìn)行腹腔攻毒,通過測定攻毒保護(hù)率、組織荷菌數(shù)及分析病理組織學(xué)變化,評價(jià)SS2滅活疫苗的免疫保護(hù)效果。研究發(fā)現(xiàn),HF2、HF3滅活疫苗和HA9801商品化滅活疫苗均能產(chǎn)生良好的免疫保護(hù)力。攻毒后,HF2滅活疫苗免疫組小鼠肺臟的細(xì)菌定植量顯著低于HA9801商品化滅活疫苗免疫組,且肺、脾、腎臟的病理變化均較HA9801商品化滅活疫苗組輕微。此外,HF2滅活疫苗組小鼠肺、脾臟的組織荷菌數(shù)均顯著低于HF3滅活疫苗組,且HF3滅活疫苗組小鼠的肺、肝、脾臟均有不同程度的炎癥細(xì)胞浸潤,腎臟組織輕微瘀血,較HF2滅活疫苗組的病理變化更明顯。結(jié)果表明,HF2滅活疫苗清除肺臟SS2定植且保護(hù)各臟器不受侵害的能力優(yōu)于HA9801商品化滅活疫苗和HF3滅活疫苗。

    綜合上述,由SS2(HF2株)制備的ISA 201 VG佐劑滅活疫苗免疫小鼠后不僅可產(chǎn)生較強(qiáng)的免疫應(yīng)答,還可完全抵抗強(qiáng)毒株的攻擊。本研究為豬鏈球菌病滅活疫苗的優(yōu)化篩選及多聯(lián)、多價(jià)疫苗的研制奠定了基礎(chǔ)。

    猜你喜歡
    商品化佐劑豬鏈球菌
    豬鏈球菌病的分析、診斷和防治
    DC-Chol陽離子脂質(zhì)體佐劑對流感疫苗免疫效果的影響
    克痹寧凝膠對佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠的緩解作用
    中成藥(2018年10期)2018-10-26 03:40:48
    明清時(shí)期陜西果樹商品化趨勢及殖民采掠初探
    日本商品化權(quán)的歷史演變與理論探析
    SD大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎模型的建立與評估
    豬鏈球菌病的診治與預(yù)防
    豬鏈球菌病的發(fā)生及防治
    鋁佐劑的作用機(jī)制研究進(jìn)展
    豬鏈球菌病的診斷與治療
    另类精品久久| 黄色配什么色好看| 日韩av在线免费看完整版不卡| 七月丁香在线播放| 一区二区三区乱码不卡18| 免费看av在线观看网站| 欧美人与善性xxx| 三级国产精品欧美在线观看| 色吧在线观看| 最后的刺客免费高清国语| 久久久久久久国产电影| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 永久免费av网站大全| 日韩制服骚丝袜av| 18禁在线无遮挡免费观看视频| 国产精品久久久久久精品古装| 热99久久久久精品小说推荐| 交换朋友夫妻互换小说| √禁漫天堂资源中文www| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃 | 亚洲第一区二区三区不卡| av免费观看日本| 中国国产av一级| 欧美日韩av久久| 亚洲欧美色中文字幕在线| 亚洲成色77777| 亚洲精品日韩av片在线观看| 亚洲精品久久午夜乱码| 婷婷成人精品国产| 免费看光身美女| 欧美精品一区二区免费开放| 免费大片18禁| 狂野欧美激情性bbbbbb| 热99久久久久精品小说推荐| 日本av免费视频播放| 男女高潮啪啪啪动态图| 国产视频内射| 日本黄色日本黄色录像| 一区在线观看完整版| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图 | 99re6热这里在线精品视频| 亚洲av国产av综合av卡| 一级毛片电影观看| 97精品久久久久久久久久精品| 在线观看一区二区三区激情| 高清午夜精品一区二区三区| 色婷婷av一区二区三区视频| 国精品久久久久久国模美| 秋霞在线观看毛片| 纯流量卡能插随身wifi吗| 亚洲精品一区蜜桃| 伊人久久国产一区二区| 久热这里只有精品99| 日本黄色日本黄色录像| 亚洲久久久国产精品| 亚洲在久久综合| 伦精品一区二区三区| av有码第一页| 欧美三级亚洲精品| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 视频区图区小说| 七月丁香在线播放| 国产亚洲欧美精品永久| 9色porny在线观看| 一区二区三区四区激情视频| 国产精品熟女久久久久浪| 97精品久久久久久久久久精品| 91精品国产九色| 涩涩av久久男人的天堂| 国产伦理片在线播放av一区| 亚洲精品aⅴ在线观看| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 亚洲国产精品一区三区| 自线自在国产av| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 日韩伦理黄色片| 一二三四中文在线观看免费高清| 乱码一卡2卡4卡精品| 在线天堂最新版资源| av免费在线看不卡| 丝袜脚勾引网站| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 免费av中文字幕在线| 狂野欧美激情性bbbbbb| www.av在线官网国产| 国产极品粉嫩免费观看在线 | 免费人成在线观看视频色| 91久久精品电影网| 久久影院123| 日本黄色片子视频| 老司机影院毛片| 女人精品久久久久毛片| 精品人妻熟女av久视频| 91精品三级在线观看| 哪个播放器可以免费观看大片| 成人影院久久| 91精品国产九色| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 亚洲怡红院男人天堂| 一级毛片我不卡| 欧美精品高潮呻吟av久久| 久久久久久久久久久免费av| 99国产综合亚洲精品| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 亚洲av综合色区一区| 国产成人午夜福利电影在线观看| 狠狠婷婷综合久久久久久88av| 热99久久久久精品小说推荐| 国产色婷婷99| av专区在线播放| 大香蕉久久网| 国产熟女欧美一区二区| 亚洲精品,欧美精品| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 精品久久国产蜜桃| 久久国产亚洲av麻豆专区| 国产黄色视频一区二区在线观看| 黑人欧美特级aaaaaa片| 久久精品久久精品一区二区三区| 精品久久久久久久久av| 婷婷色综合大香蕉| 精品午夜福利在线看| 日本与韩国留学比较| 亚洲国产av影院在线观看| a级毛片免费高清观看在线播放| 91精品国产国语对白视频| videossex国产| 天堂俺去俺来也www色官网| 一个人免费看片子| h视频一区二区三区| 九九爱精品视频在线观看| 男女无遮挡免费网站观看| 免费看不卡的av| 狠狠婷婷综合久久久久久88av| 国产国语露脸激情在线看| 亚洲综合色惰| 免费大片18禁| 韩国av在线不卡| 在线观看免费视频网站a站| 久久热精品热| 欧美最新免费一区二区三区| 伦精品一区二区三区| 熟女电影av网| www.色视频.com| 亚洲内射少妇av| 亚洲高清免费不卡视频| 久久久精品区二区三区| 日日啪夜夜爽| 大香蕉久久网| av播播在线观看一区| 国产精品人妻久久久影院| 久久精品久久精品一区二区三区| 日韩av免费高清视频| 精品国产国语对白av| 亚洲av免费高清在线观看| 国产色爽女视频免费观看| 人体艺术视频欧美日本| 我的女老师完整版在线观看| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图 | 国产精品久久久久久久久免| 97超碰精品成人国产| 最近中文字幕2019免费版| 欧美人与善性xxx| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区| 精品久久久久久久久av| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 国模一区二区三区四区视频| 久久精品夜色国产| 一级黄片播放器| 亚洲丝袜综合中文字幕| 天堂中文最新版在线下载| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 最黄视频免费看| 99九九线精品视频在线观看视频| 九色亚洲精品在线播放| 晚上一个人看的免费电影| 亚洲丝袜综合中文字幕| 91久久精品电影网| 国产成人免费观看mmmm| 热re99久久国产66热| 另类精品久久| 国产色爽女视频免费观看| 欧美+日韩+精品| 日本-黄色视频高清免费观看| 欧美三级亚洲精品| 这个男人来自地球电影免费观看 | 亚洲国产精品成人久久小说| 人妻系列 视频| 久久99热6这里只有精品| 国产精品久久久久久精品古装| 97超碰精品成人国产| 日本黄色日本黄色录像| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 中文欧美无线码| 久久午夜综合久久蜜桃| 97精品久久久久久久久久精品| 亚洲精品成人av观看孕妇| 我要看黄色一级片免费的| av国产久精品久网站免费入址| 在线观看www视频免费| 亚洲国产精品国产精品| 亚洲av二区三区四区| 日韩av不卡免费在线播放| 日韩三级伦理在线观看| 一区二区三区免费毛片| 国产成人精品无人区| 日本wwww免费看| 亚洲,一卡二卡三卡| 亚洲成人一二三区av| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 中文天堂在线官网| 七月丁香在线播放| 一级毛片我不卡| 中文字幕制服av| 亚洲国产精品999| 亚洲精品亚洲一区二区| 久久ye,这里只有精品| 国产乱来视频区| 亚洲精华国产精华液的使用体验| 男女边摸边吃奶| 2018国产大陆天天弄谢| 免费黄色在线免费观看| 国产成人freesex在线| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 国产日韩欧美视频二区| 人成视频在线观看免费观看| 国产成人免费无遮挡视频| 久久这里有精品视频免费| 99热国产这里只有精品6| 简卡轻食公司| 欧美三级亚洲精品| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 国产在线视频一区二区| 国产视频首页在线观看| 天天影视国产精品| 久久久久精品久久久久真实原创| 一级黄片播放器| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 免费大片18禁| 18+在线观看网站| 成人国语在线视频| 欧美 日韩 精品 国产| 插逼视频在线观看| 少妇的逼好多水| 能在线免费看毛片的网站| 久久久久久久大尺度免费视频| 丝袜喷水一区| 成年美女黄网站色视频大全免费 | 天美传媒精品一区二区| 综合色丁香网| 国产高清有码在线观看视频| 青青草视频在线视频观看| 搡老乐熟女国产| 日韩 亚洲 欧美在线| 青春草视频在线免费观看| 人成视频在线观看免费观看| 插阴视频在线观看视频| 亚洲国产日韩一区二区| 在线观看美女被高潮喷水网站| 天天影视国产精品| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 国产日韩欧美视频二区| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 精品卡一卡二卡四卡免费| 蜜桃在线观看..| 国产欧美另类精品又又久久亚洲欧美| 老熟女久久久| 又大又黄又爽视频免费| 日韩一区二区三区影片| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 精品少妇内射三级| 国产成人freesex在线| 免费av中文字幕在线| 国产色爽女视频免费观看| 99热国产这里只有精品6| 日韩一区二区三区影片| 中文天堂在线官网| 在线 av 中文字幕| 99视频精品全部免费 在线| 有码 亚洲区| 婷婷色av中文字幕| 人体艺术视频欧美日本| 国精品久久久久久国模美| 久久国产精品男人的天堂亚洲 | 亚洲经典国产精华液单| 我的老师免费观看完整版| 国产一区二区在线观看日韩| 人人妻人人澡人人看| 少妇人妻久久综合中文| 国产一区亚洲一区在线观看| 国产av国产精品国产| 免费观看的影片在线观看| 日韩一区二区三区影片| 中文字幕免费在线视频6| 另类亚洲欧美激情| 久久久亚洲精品成人影院| 欧美另类一区| 亚洲精品456在线播放app| 性高湖久久久久久久久免费观看| 97超视频在线观看视频| 简卡轻食公司| 亚洲在久久综合| 色婷婷av一区二区三区视频| 简卡轻食公司| 十八禁网站网址无遮挡| 国产成人91sexporn| 免费日韩欧美在线观看| 亚洲性久久影院| 色婷婷av一区二区三区视频| 国产成人aa在线观看| 一个人看视频在线观看www免费| 精品久久久久久久久av| av专区在线播放| 亚洲国产欧美在线一区| 精品亚洲成a人片在线观看| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕 | 婷婷成人精品国产| 国产一区二区三区av在线| 成年人午夜在线观看视频| 亚洲,欧美,日韩| 欧美日韩精品成人综合77777| 午夜福利视频精品| 麻豆乱淫一区二区| 国产探花极品一区二区| 色94色欧美一区二区| 日本黄大片高清| av福利片在线| 成人国语在线视频| 视频中文字幕在线观看| 性色av一级| 国产成人freesex在线| 少妇被粗大猛烈的视频| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 人妻 亚洲 视频| 亚洲美女黄色视频免费看| 插阴视频在线观看视频| av视频免费观看在线观看| 26uuu在线亚洲综合色| 中文乱码字字幕精品一区二区三区| 亚洲在久久综合| 久久久久视频综合| a级毛色黄片| 久久国产精品大桥未久av| 国产精品三级大全| 亚洲人成网站在线播| 少妇丰满av| 五月天丁香电影| 高清午夜精品一区二区三区| 国内精品宾馆在线| 我的老师免费观看完整版| 国内精品宾馆在线| 交换朋友夫妻互换小说| 丝袜脚勾引网站| 91久久精品电影网| 午夜激情福利司机影院| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 国产视频内射| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 亚洲精品国产av成人精品| 午夜免费观看性视频| 国产精品成人在线| 成人无遮挡网站| 水蜜桃什么品种好| 高清毛片免费看| 欧美97在线视频| 纵有疾风起免费观看全集完整版| av福利片在线| 97在线视频观看| 一本大道久久a久久精品| 精品人妻一区二区三区麻豆| 日韩一本色道免费dvd| 黄片播放在线免费| 丁香六月天网| 91国产中文字幕| 亚洲四区av| 国产在线免费精品| 国产成人精品婷婷| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 国产永久视频网站| 久久 成人 亚洲| 一区二区日韩欧美中文字幕 | 黑丝袜美女国产一区| 国产综合精华液| 成人综合一区亚洲| 国产一区二区在线观看日韩| 久久精品夜色国产| 在线观看免费日韩欧美大片 | 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃 | 午夜福利影视在线免费观看| 亚洲欧美精品自产自拍| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 亚洲精品视频女| 国产精品一二三区在线看| 免费高清在线观看视频在线观看| 国产亚洲一区二区精品| 边亲边吃奶的免费视频| 美女内射精品一级片tv| 亚洲丝袜综合中文字幕| 哪个播放器可以免费观看大片| 亚洲精品国产色婷婷电影| 亚洲国产色片| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 国产又色又爽无遮挡免| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线| 视频区图区小说| 久久久久网色| 国产一区二区三区综合在线观看 | 午夜激情久久久久久久| 纯流量卡能插随身wifi吗| 男女啪啪激烈高潮av片| 精品久久久精品久久久| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 欧美成人精品欧美一级黄| 亚洲精品aⅴ在线观看| videossex国产| 在线精品无人区一区二区三| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 高清毛片免费看| 免费观看a级毛片全部| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 大话2 男鬼变身卡| 亚洲国产最新在线播放| 久久人妻熟女aⅴ| 丝袜脚勾引网站| 18在线观看网站| 国产乱来视频区| 欧美人与性动交α欧美精品济南到 | 成人亚洲精品一区在线观看| 中文字幕精品免费在线观看视频 | 超色免费av| 99九九在线精品视频| 热99久久久久精品小说推荐| 一级,二级,三级黄色视频| 亚洲高清免费不卡视频| 亚洲精品456在线播放app| 国产av一区二区精品久久| 最黄视频免费看| 国产成人免费无遮挡视频| 99热这里只有精品一区| 国产男女超爽视频在线观看| 国产视频首页在线观看| 国产精品蜜桃在线观看| 人成视频在线观看免费观看| 亚洲色图综合在线观看| 亚洲精品一二三| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 欧美成人午夜免费资源| 欧美日韩在线观看h| 一级黄片播放器| 人成视频在线观看免费观看| 女人精品久久久久毛片| 特大巨黑吊av在线直播| 91国产中文字幕| 久热久热在线精品观看| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 精品一品国产午夜福利视频| 日本av手机在线免费观看| 久久女婷五月综合色啪小说| 亚洲国产色片| 欧美日韩视频精品一区| 日日啪夜夜爽| 色哟哟·www| 亚洲在久久综合| av国产久精品久网站免费入址| 熟女电影av网| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 久久精品国产亚洲av涩爱| 在线观看三级黄色| 亚洲国产精品国产精品| 人妻夜夜爽99麻豆av| 日日爽夜夜爽网站| 男女无遮挡免费网站观看| 亚洲精品日韩av片在线观看| 我要看黄色一级片免费的| 一本一本久久a久久精品综合妖精 国产伦在线观看视频一区 | 日韩av免费高清视频| 免费看av在线观看网站| 天天操日日干夜夜撸| 亚洲国产最新在线播放| 岛国毛片在线播放| 久久综合国产亚洲精品| 免费看不卡的av| 激情五月婷婷亚洲| 午夜免费观看性视频| 九色成人免费人妻av| 天天影视国产精品| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 精品人妻一区二区三区麻豆| 日韩制服骚丝袜av| 久久精品国产亚洲av天美| 一区二区av电影网| 一本一本久久a久久精品综合妖精 国产伦在线观看视频一区 | 久久精品久久久久久久性| 久久久午夜欧美精品| 亚洲五月色婷婷综合| 国产永久视频网站| 中文字幕制服av| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 久久av网站| 能在线免费看毛片的网站| 日韩av在线免费看完整版不卡| 亚洲精品国产av蜜桃| 亚洲精品色激情综合| 色5月婷婷丁香| 亚洲国产最新在线播放| 久久免费观看电影| 内地一区二区视频在线| 多毛熟女@视频| 国产精品一区二区三区四区免费观看| 久久国产亚洲av麻豆专区| 免费高清在线观看日韩| 毛片一级片免费看久久久久| 考比视频在线观看| 女人精品久久久久毛片| 超碰97精品在线观看| 国产免费福利视频在线观看| 一二三四中文在线观看免费高清| 亚洲欧美成人精品一区二区| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 亚洲av综合色区一区| 母亲3免费完整高清在线观看 | 九九爱精品视频在线观看| 亚洲精品亚洲一区二区| 精品一区二区三区视频在线| 日本免费在线观看一区| 一区二区三区免费毛片| 99国产综合亚洲精品| 亚洲国产最新在线播放| 免费高清在线观看日韩| 能在线免费看毛片的网站| 高清午夜精品一区二区三区| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 成人毛片60女人毛片免费| 亚洲国产色片| 亚洲精品乱码久久久久久按摩| 少妇熟女欧美另类| 街头女战士在线观看网站| 亚洲精品456在线播放app| 久久久久精品久久久久真实原创| 99久久人妻综合| 亚州av有码| 亚洲精品久久成人aⅴ小说 | 少妇人妻精品综合一区二区| 大香蕉久久成人网| 91精品国产九色| 亚洲av成人精品一二三区| 涩涩av久久男人的天堂| 精品午夜福利在线看| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 制服人妻中文乱码| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 毛片一级片免费看久久久久| 亚洲精品视频女| 国产日韩欧美亚洲二区| 天堂8中文在线网| 日本黄大片高清| 亚洲国产成人一精品久久久| √禁漫天堂资源中文www| 国产精品一区二区在线观看99| 久久人人爽人人片av| 99久久中文字幕三级久久日本| 一本一本久久a久久精品综合妖精 国产伦在线观看视频一区 | 久久久久国产网址| xxxhd国产人妻xxx| 黄色一级大片看看| 亚洲国产最新在线播放| 老司机影院毛片| 国模一区二区三区四区视频| 国产在线免费精品| 中文字幕av电影在线播放| 中国美白少妇内射xxxbb| 久久ye,这里只有精品| 少妇的逼水好多| 精品久久国产蜜桃| 国产色婷婷99| 国产成人精品婷婷| 欧美精品高潮呻吟av久久| www.色视频.com| 丁香六月天网| av又黄又爽大尺度在线免费看| 男人添女人高潮全过程视频| √禁漫天堂资源中文www| 色5月婷婷丁香| 亚洲成人手机| 欧美三级亚洲精品| 亚洲人与动物交配视频| 如日韩欧美国产精品一区二区三区 | 99热这里只有是精品在线观看| 五月伊人婷婷丁香| 精品亚洲成国产av| 男女边吃奶边做爰视频| 色5月婷婷丁香| 丝袜美足系列| 人妻夜夜爽99麻豆av| 韩国高清视频一区二区三区| 日韩精品有码人妻一区| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 国产片内射在线| 黄色一级大片看看| 国产精品久久久久成人av| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 国产一级毛片在线| 成人国产av品久久久| 欧美另类一区| av.在线天堂| 久久久久久人妻| 国产精品女同一区二区软件| 国产免费一级a男人的天堂| 国产在线一区二区三区精| 久久综合国产亚洲精品|