靈芝孢子粉總?cè)频奶崛?yōu)化及其體外生物活性

溫慧萍，雷偉敏，柯樂(lè)芹，陳雨薇，侯 景，肖建中

(麗水學(xué)院 生態(tài)學(xué)院，浙江 麗水 323000)

靈芝孢子粉為靈芝在生長(zhǎng)成熟期從靈芝菌蓋中彈射出來(lái)的極其微小的卵形生殖細(xì)胞，有研究表明，其能治療阿爾茨海默病[1]，抗肝纖維化[2]，且具有較好的抗腫瘤活性[3-7]；因此，靈芝孢子粉逐漸發(fā)展成為重要的靈芝類(lèi)保健食品。但是，此類(lèi)商品品種繁多，質(zhì)量參差不齊，價(jià)格差異較大，且并未有統(tǒng)一的有效成分含量標(biāo)志，也缺少統(tǒng)一的國(guó)家質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。大多數(shù)文獻(xiàn)資料認(rèn)為，靈芝類(lèi)產(chǎn)品的主要功效物質(zhì)為多糖和三萜化合物[8-12]。目前，相關(guān)研究多集中在靈芝子實(shí)體三萜的提取方面[13-15]，且均以齊墩果酸為對(duì)照品，而關(guān)于靈芝孢子粉三萜含量?jī)?yōu)化提取的研究較少[16-17]。此外，靈芝孢子粉總?cè)频钠渌麊误w成分也還需進(jìn)一步研究明確。由于提取過(guò)程溶劑與固體的比例、提取時(shí)間、溶劑組成和超聲功率等因素都可能影響產(chǎn)品的提取效率和提取產(chǎn)量[18-19]；因此，有必要對(duì)靈芝孢子粉的提取參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，以獲得較高含量的三萜類(lèi)化合物。本研究擬選取市場(chǎng)上常見(jiàn)的破壁靈芝孢子粉，對(duì)其主要功效成分靈芝孢子粉總?cè)七M(jìn)行優(yōu)化提取，并測(cè)定靈芝孢子粉總?cè)频捏w外抗氧化活性，同時(shí)采用CCK-8法檢測(cè)不同品牌靈芝孢子粉對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG-2增殖的影響，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)靈芝孢子粉提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

R210步琦旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，瑞士步琦有限公司；UV2550紫外分光光度計(jì)，日本島津公司；KQ-700VDV雙頻數(shù)控超聲儀，昆山市超聲儀器有限公司；DHG-9240A精宏電熱鼓風(fēng)干燥箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)室設(shè)備有限公司；MIR-214 SANYO恒溫培養(yǎng)箱，日本三洋公司；HERAcell 240i CO2恒溫培養(yǎng)箱，美國(guó)Thermo公司。

靈芝酸A(LZS)標(biāo)準(zhǔn)品(批號(hào)18032603)，成都普菲德生物技術(shù)有限公司；齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品(批號(hào)C1723001)，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；高氯酸、冰醋酸均為分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；ABTS試劑，Sigma-Aldrich公司；DPPH(批號(hào)E1910039)，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；RPMI-1640培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基、青霉素、鏈霉素、胎牛血清，美國(guó)Life Technology公司；CCK-8試劑盒，同仁化學(xué)研究所；人肝癌HepG-2細(xì)胞系，本實(shí)驗(yàn)室常規(guī)培養(yǎng)、保存。

供試品包括：修正破壁靈芝孢子粉(XZ)、和成恒破壁靈芝孢子粉(HCH)、唐巢破壁靈芝孢子粉(TC)、萬(wàn)世堂破壁靈芝孢子粉(WST)、康益新破壁靈芝孢子粉(KYX)、北芝堂破壁靈芝孢子粉(BZT)、林島靈芝孢子粉(LD)。以上產(chǎn)品通過(guò)實(shí)體藥店，以及天貓、京東等網(wǎng)上購(gòu)物平臺(tái)購(gòu)買(mǎi)，所有樣品均為國(guó)食健字號(hào)產(chǎn)品。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.1 單因素試驗(yàn)

以WST為樣本，以靈芝孢子粉總?cè)频寐蕿樵u(píng)價(jià)指標(biāo)，分別進(jìn)行乙醇體積分?jǐn)?shù)、固液比(質(zhì)量體積比)、提取時(shí)間、提取溫度、超聲功率的單因素試驗(yàn)。

(1)乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)得率的影響。精密稱取6份樣品(每份約1.0 g)，分別加入30 mL體積分?jǐn)?shù)為40%、50%、60%、70%、80%、90%的乙醇，提取30 min，在提取溫度40 ℃、超聲功率700 W的條件下進(jìn)行靈芝孢子粉總?cè)频奶崛　?/p>

(2)固液比對(duì)得率的影響。按照固液比1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50的比例加入體積分?jǐn)?shù)80%的乙醇，提取30 min，在提取溫度40 ℃、超聲功率700 W的條件下進(jìn)行靈芝孢子粉總?cè)频奶崛　?/p>

(3)提取時(shí)間對(duì)得率的影響。在固液比1∶20、提取溫度40 ℃、超聲功率700 W、乙醇體積分?jǐn)?shù)80%的條件下，分別提取30、45、60、75、90 min。

(4)提取溫度對(duì)得率的影響。在固液比1∶20、乙醇體積分?jǐn)?shù)80%、提取時(shí)間60 min、超聲功率700 W的條件下，分別在30、35、40、45、50 ℃提取靈芝孢子粉總?cè)啤?/p>

(5)超聲功率對(duì)得率的影響。在固液比1∶20、乙醇體積分?jǐn)?shù)80%、提取時(shí)間30 min、提取溫度40 ℃的條件下，分別在350、420、490、560、630、700 W提取靈芝孢子粉總?cè)啤?/p>

1.2.2 Plackett-Burman(PB)試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以靈芝孢子粉總?cè)频寐蕿轫憫?yīng)值，對(duì)提取溫度、固液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲功率和提取時(shí)間5個(gè)因素進(jìn)行評(píng)價(jià)。采用Minitab17軟件設(shè)計(jì)試驗(yàn)，并篩選出主效應(yīng)因子，每個(gè)因素取最低(-1)和最高(+1)2個(gè)水平，共12組試驗(yàn)(表1)。

1.2.3 響應(yīng)面設(shè)計(jì)

在PB試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取乙醇體積分?jǐn)?shù)(A)、固液比(B)、超聲功率(C)為自變量，以靈芝孢子粉總?cè)频寐?Y)為響應(yīng)量，利用Design-Expert 8.0.6進(jìn)行3因素3水平的試驗(yàn)設(shè)計(jì)(表2)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 靈芝孢子粉總?cè)频牡寐蕼y(cè)定

靈芝孢子粉總?cè)频牡寐蕼y(cè)定采用香草醛-冰醋酸-高氯酸法[20]。配置0.35 mg·mL-1的齊墩果酸對(duì)照品，分別量取0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mL，水浴揮干，加入0.4 mL的5%(體積分?jǐn)?shù))香草醛-冰醋酸溶液和1 mL高氯酸，于60 ℃恒溫水浴15 min，冰水冷卻至室溫，加入5 mL冰醋酸搖勻，在548 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，每個(gè)樣本重復(fù)3次，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果顯示，所構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=1.719 8x-0.014 1，決定系數(shù)(R2)為0.998 9，線性關(guān)系良好。根據(jù)得到的靈芝孢子粉總?cè)瀑|(zhì)量與原料質(zhì)量，計(jì)算靈芝孢子粉總?cè)频牡寐省?/p>

1.3.2 靈芝孢子粉總?cè)茖?duì)DPPH自由基的清除活性測(cè)定[21]

表1 PB試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素和水平

Table 1 PB design factors and levels

因素Factor編碼Code低水平Low level(-1) 高水平High level(+1)乙醇體積分?jǐn)?shù)X17090Ethanol volume fraction/%固液比Solid to liquid ratioX21∶101∶30提取時(shí)間Extract time/minX34575提取溫度Extract temperature/℃X43545超聲功率Ultrasonic power/W X5420560

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

Table 2 Response surface test design

因素Factor編碼水平編號(hào)Code level of variable-11+1A. 乙醇體積分?jǐn)?shù)708090Ethanol volume fraction/%B. 固液比Solid to liquid ratio1∶101∶201∶30C. 超聲功率Ultrasonic power/W420490560

按優(yōu)化流程提取各供試靈芝孢子粉的總?cè)?，用無(wú)水乙醇配置成質(zhì)量濃度為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mg·mL-1的溶液，取1 mL樣品液加入1 mL 0.04 mmoL·L-1的DPPH甲醇溶液，混勻，室溫避光反應(yīng)30 min后，于517 nm處測(cè)定其吸光度。以抗壞血酸為陽(yáng)性對(duì)照，按式(1)計(jì)算DPPH自由基清除率(R1)：

R1=1-(A1-A2)/A0。

(1)

式(1)中：A1為1 mL樣品提取液+1 mL DPPH溶液的吸光度，A2為1 mL無(wú)水乙醇+1 mL提取物溶液的吸光度，A0是1 mL無(wú)水乙醇+1 mL DPPH溶液的吸光度。

1.3.3 靈芝孢子粉總?cè)茖?duì)ABTS+自由基的清除活性測(cè)定

取100 μL質(zhì)量濃度0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mg·mL-1的待測(cè)樣品，加入300 μL ABTS+工作液(7.4 mmoL·L-1ABST+儲(chǔ)備液與2.6 mmoL·L-1K2S2O8以1∶1的體積比混合，避光反應(yīng)12 h后，用甲醇稀釋至吸光度0.70±0.02，在室溫下避光反應(yīng)6 min[22]，于734 nm處測(cè)定其吸光度，以抗壞血酸作為陽(yáng)性對(duì)照。按式(2)計(jì)算ABTS+自由基清除率(R2)：

R2=1-(A3-A4)/A5。

(2)

式(2)中：A3為100 μL樣品提取液+300 μL ABTS+溶液的吸光度，A4為300 μL甲醇+100 μL提取物溶液的吸光度，A5是100 μL甲醇+300 μL ABTS+溶液的吸光度。

1.3.4 CCK-8法測(cè)定靈芝孢子粉總?cè)茖?duì)人肝癌細(xì)胞HepG-2的影響

采用CCK-8法[23]，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG-2細(xì)胞，0.25%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))胰蛋白酶消化后計(jì)數(shù)。用RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)液將細(xì)胞濃度調(diào)整為1×105mL-1，取100 μL接種于96孔板，設(shè)置對(duì)照組、空白組和給藥組，其中，給藥組加入100 μL質(zhì)量濃度為 0.02 mg·mL-1的靈芝孢子粉總?cè)铺崛∫?，?duì)照組不加藥，空白組只加培養(yǎng)液，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。放入CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育24 h，棄上清，每孔加入100 μL 10%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))CCK-8溶液，孵育0.5 h后，于450 nm處測(cè)定其吸光度，重復(fù)3次。按式(3)計(jì)算細(xì)胞存活率(S)：

S=(A6-A8)/(A7-A8)。

(3)

式(3)中：A6、A7、A8分別是給藥組、對(duì)照組、空白組的吸光度。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用Minitab 17軟件進(jìn)行Plackett-Burman設(shè)計(jì)分析，利用Design Expert 8.0.5軟件進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)和相關(guān)分析。用SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，用Origin 8.0軟件做圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)得率的影響

如圖1-A所示，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)低于70%時(shí)，靈芝孢子粉總?cè)频牡寐孰S著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加而較快增加；當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)增大到80%時(shí)，得率最大；隨后，得率逐漸降低。因此，最適宜的乙醇體積分?jǐn)?shù)在70%～90%。

2.1.2 固液比對(duì)得率的影響

如圖1-B所示，靈芝孢子粉總?cè)频牡寐试诠桃罕葹?∶20時(shí)最大。因此，固液比以1∶10～1∶30為宜。

2.1.3 提取時(shí)間對(duì)得率的影響

如圖1-C所示，適當(dāng)延長(zhǎng)提取時(shí)間能夠提高靈芝孢子粉總?cè)频牡寐?，?dāng)提取時(shí)間為60 min時(shí)，得率最大(5.82 mg·g-1)，繼續(xù)延長(zhǎng)提取時(shí)間，得率趨于穩(wěn)定。因此，提取時(shí)間應(yīng)當(dāng)在45～75 min。

2.1.4 提取溫度對(duì)得率的影響

如圖1-D所示，當(dāng)提取溫度為40 ℃時(shí)，靈芝孢子粉總?cè)频牡寐蔬_(dá)到峰值(5.98 mg·g-1)，進(jìn)一步升高提取溫度，得率反而下降。因此，提取溫度宜在35～45 ℃。

2.1.5 超聲功率對(duì)得率的影響

如圖1-E所示，當(dāng)超聲功率為350～490 W，靈芝孢子粉總?cè)频牡寐孰S著功率的提升而迅速提高，在490 W時(shí)達(dá)到最大得率(4.90 mg·g-1)，而在490～700 W，靈芝孢子粉總?cè)频牡寐孰S著功率的提升略有下降。這可能是因?yàn)?，適宜的超聲功率有助于快速促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)三萜化合物的滲出，但過(guò)高的超聲功率可能會(huì)導(dǎo)致三萜化合物結(jié)構(gòu)破壞；因此，超聲功率宜選擇在420～560 W。

2.2 PB試驗(yàn)結(jié)果

PB試驗(yàn)的結(jié)果如表3所示。采用Minitab 17軟件對(duì)表1中的數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸分析，得到以靈芝孢子粉總?cè)频寐蕿轫憫?yīng)值的最優(yōu)方程：Y=4.997 4+0.763 4X1+0.706 9X2-0.125 1X3+0.067 1X4+0.705 4X5。各因素的效應(yīng)評(píng)價(jià)結(jié)果見(jiàn)表4。

圖1 不同提取因素對(duì)靈芝孢子粉總?cè)频寐实挠绊慒ig.1 Effects of extraction factors on total triterpenoid yield

表3 PB試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

Table 3 PB experimental design and results

編號(hào)No.因素FactorX1X2X3X4X5得率Yield/(mg·g-1)11-1-1-115.2892-11-1-1-14.171311-1116.89341-11-1-13.6145-111-116.3026-1-1-1114.356711-11-16.8328111-117.0129-1-1-1-1-13.19410-1111-13.016111-111-14.92512-1-11114.365

由表4可知，乙醇體積分?jǐn)?shù)、固液比、超聲功率的效應(yīng)達(dá)到顯著性水平(P<0.05)，可作為進(jìn)一步優(yōu)化的因素，而提取時(shí)間與提取溫度的效應(yīng)不顯著。

2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)PB試驗(yàn)結(jié)果，選取超聲功率、固液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)進(jìn)行3因素3水平的Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，試驗(yàn)方案與結(jié)果見(jiàn)表5。對(duì)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)的結(jié)果建立數(shù)學(xué)回歸模型并進(jìn)行方差分析(ANOVA)，結(jié)果見(jiàn)表6。經(jīng)過(guò)擬合得到的回歸方程為Y=4.95+2.66A+1.22B+1.42C-0.38AB-0.64AC+0.27BC-0.082A2-2.04B2-0.89C2，R2=0.980 8，模型的P值<0.000 1，失擬項(xiàng)>0.05，表明模型可信，擬合結(jié)果真實(shí)可靠。方差分析結(jié)果顯示，各單因素均達(dá)到顯著水平(P<

表4 PB試驗(yàn)設(shè)計(jì)各因素的效應(yīng)評(píng)價(jià)

Table 4 Effect evaluations of each factor under PB test design

因素Factors效應(yīng)Effect系數(shù)Coefficient系數(shù)標(biāo)準(zhǔn)誤Standard errorTP常量Cconstant—4.997 40.241 320.71<0.001乙醇體積分?jǐn)?shù)Ethanol volume fraction1.526 80.763 40.241 33.160.019固液比Solid to liquid ratio1.413 80.706 90.241 32.930.026提取時(shí)間Extract time-0.250 2-0.125 10.241 3-0.520.623提取溫度 Extract temperature0.134 20.067 10.241 30.290.790超聲功率Ultrasonic power1.410 80.705 40.241 32.920.027

表5 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

Table 5 Design and results of Box-Behnken tests

試驗(yàn)序號(hào)No.A/%BC/W得率Yield/(mg·g-1)1701∶304904.307 2801∶304203.425 3901∶205606.191 4701∶204202.694 5701∶104901.857 6801∶204906.926 7801∶305605.980 8801∶104202.285 9901∶104904.332 10901∶304905.254 11901∶204206.378 12701∶205605.081 13801∶204906.479 14801∶204907.067 15801∶204906.906 16801∶204906.556 17801∶105603.767

0.05)，其影響力由大到小依次為乙醇體積分?jǐn)?shù)>超聲功率>固液比。

響應(yīng)面法優(yōu)化得到3因素的三維圖(圖2)。由圖2可知，固液比與超聲功率之間具有較強(qiáng)的影響，實(shí)際值較大的固液比和超聲功率具有使靈芝孢子粉總?cè)频寐蕼p小的傾向。這可能是由于超聲功率大使得靈芝孢子粉中的其他雜質(zhì)溶出。此外，乙醇體積分?jǐn)?shù)和固液比的交互作用亦較強(qiáng)，較大的固液比與乙醇體積分?jǐn)?shù)下，靈芝孢子粉總?cè)频寐史炊鴾p小。這可能是因?yàn)橐掖俭w積分?jǐn)?shù)加大，導(dǎo)致其他非三萜類(lèi)醇溶性物質(zhì)溶出，從而影響了靈芝孢子粉總?cè)频牡寐?。靈芝孢子粉總?cè)铺崛〉睦碚撟顑?yōu)條件是：乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比(固液比的倒數(shù))、超聲功率分別為79.93%、22.48、523.64 W，理論得率為7.068 mg·g-1。結(jié)合實(shí)際，靈芝孢子粉總?cè)频淖顑?yōu)提取條件被確定為乙醇體積分?jǐn)?shù)80%，固液比1∶23，超聲功率540 W，40 ℃超聲提取60 min。在最佳條件下進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)，實(shí)際得率分別為6.970、7.025、7.167 mg·g-1，平均值為7.054 mg·g-1，驗(yàn)證結(jié)果與理論值接近，表明所得結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

表6 響應(yīng)面方差分析結(jié)果

Table 6 ANOVA results of response surface

來(lái)源Source平方和Sum of square自由度Degree of freedom均方根Mean squareFP模型Model47.1595.2439.82<0.000 1A6.5616.5649.880.000 2B3.9813.9830.240.000 9C5.4015.4041.060.000 4AB0.5810.584.380.074 7BC1.6611.6612.590.009 4AC0.2910.292.190.182 6A22.8012.8021.260.002 5B217.47117.47132.79<0.000 1C23.3013.3025.110.001 5參差Variance 0.9070.13——交互Interaction0.6630.223.390.134 7純誤差Pure error0.2640.063——總離差Total departure48.0716———

圖2 響應(yīng)面三維圖Fig.2 Three dimensional map of response surface

2.4 靈芝孢子粉總?cè)频捏w外抗氧化活性

將從不同樣品中提取的靈芝孢子粉總?cè)婆涑刹煌|(zhì)量濃度的溶液，分別測(cè)定其清除DPPH、ABTS+自由基的活性。如圖3所示，靈芝孢子粉總?cè)凭哂幸欢ǖ目寡趸钚?，其清除ABTS+的活性強(qiáng)于清除DPPH，且清除ABTS+的能力隨著靈芝孢子粉總?cè)瀑|(zhì)量濃度的增大而提高，最大清除率可達(dá)94.7%，但其清除DPPH的能力較弱，清除率小于50.0%，當(dāng)質(zhì)量濃度超過(guò)1.0 mg·mL-1后，其對(duì)DPPH的清除率增加趨于平緩。

如表7所示，靈芝孢子粉總?cè)坪吭礁叩臉悠?，其清除自由基的活性越?qiáng)：TC的靈芝孢子粉總?cè)坪扛哌_(dá)18.495 mg·g-1，對(duì)DPPH、ABTS+均表現(xiàn)出最強(qiáng)的清除能力，半抑制濃度(IC50)分別為2.495、0.452 mg·g-1。但并不是所有供試的靈芝孢子粉都呈現(xiàn)出良好的劑量-效應(yīng)關(guān)系，其中，HCH清除DPPH的能力較弱，但其清除ABTS+自由基的活性較強(qiáng)，IC50達(dá)到了0.584 mg·g-1。

2.5 靈芝孢子粉總?cè)茖?duì)HepG-2肝癌細(xì)胞增殖的影響

由圖4可知，與對(duì)照組(Con)相比，從不同品牌的供試樣品中提取的靈芝孢子粉總?cè)茖?duì)HepG-2肝癌細(xì)胞均表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制作用。其中，TC的靈芝孢子粉總?cè)坪孔罡?，但其抑制HepG-2肝癌細(xì)胞的能力并不突出，細(xì)胞存活率高達(dá)67.5%；KYX、HCH對(duì)HepG-2肝癌細(xì)胞具有較好的抑制作用，2組細(xì)胞的存活率分別為44.7%、48.8%，均低于50.0%；LD對(duì)HepG-2肝癌細(xì)胞的抑制作用相對(duì)較弱，細(xì)胞存活率高達(dá)85.1%。

圖3 靈芝孢子粉總?cè)茖?duì)抗DPPH(A)和ABTS+(B)的清除能力Fig.3 Antioxidant activities of different concentrations of total triterpenoid against DPPH (A) and ABTS+ (B)

表7 供試靈芝孢子粉總?cè)频暮考捌淇寡趸钚?IC50)

Table 7 Contents of total triterpenoids extracted formGanodermalucidumspore powder and their antioxidant activities (IC50)

樣品Sample總?cè)坪縏otal triterpenoidscontent/(mg·g-1)IC50DPPHABTS+LD5.5393.6430.689HCH5.7594.1740.584XZ6.7292.8070.946WST6.9672.5552.002BZT4.9973.7281.053TC18.4952.4950.452KYX7.6372.5551.114

**表示與對(duì)照組相比差異極顯著(P<0.01)。 ** indicated significant difference at P<0.01 as compared with the control group.圖4 不同供試品牌樣品的靈芝孢子粉總?cè)茖?duì)人肝癌細(xì)胞HepG-2存活率的影響Fig.4 Effect of total triterpenoids extracted from Ganoderma lucidum spore powder on survivability of HepG-2 cells

3 結(jié)論與討論

Plackett-Burman設(shè)計(jì)可在減少試驗(yàn)次數(shù)的條件下快速找到顯著因素；Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)能夠進(jìn)行相關(guān)數(shù)據(jù)的擬合，建立因素與響應(yīng)值之間的模型并篩選出最佳工藝。綜合采用上述設(shè)計(jì)方案，本試驗(yàn)充分考慮了各影響因素的交互作用，可提高試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確度和精確度。

本試驗(yàn)考查了靈芝孢子粉總?cè)祁?lèi)化合物的體外抗氧化活性，及對(duì)HepG-2肝癌細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果顯示，其清除ABTS+自由基的活性較強(qiáng)，且對(duì)HepG-2肝癌細(xì)胞有一定的抑制作用，但靈芝孢子粉總?cè)坪枯^高的樣品雖具有更強(qiáng)的抗氧化能力，但并未表現(xiàn)出更突出的抑制HepG-2肝癌細(xì)胞增殖的效果。這可能是因?yàn)殪`芝孢子粉總?cè)浦休祁?lèi)物質(zhì)的種類(lèi)和含量存在較大差異，且并非所有三萜都具有抗腫瘤活性[24]。各品牌的靈芝孢子粉來(lái)源地不同，生長(zhǎng)環(huán)境、采集季節(jié)亦有差異，均可導(dǎo)致其總?cè)平M成存在差異，故其抗氧化活性與抑制HepG-2肝癌細(xì)胞的能力并未表現(xiàn)出較明顯的劑量效應(yīng)相關(guān)性。

此外，本課題組利用高效液相色譜(HPLC)對(duì)經(jīng)優(yōu)化方法從不同供試樣品中提取的靈芝孢子粉總?cè)七M(jìn)行靈芝酸A含量測(cè)定，結(jié)果顯示，靈芝孢子粉中靈芝酸A含量極低(數(shù)據(jù)未展示)。雖然所采用的色譜方法和樣品處理方式與范蕾等[25]文獻(xiàn)報(bào)告有差異，但色譜圖高度一致。推測(cè)總?cè)浦徐`芝酸A含量較少，且其并非靈芝孢子粉總?cè)频闹饕M成成分，因此并不能確立其為質(zhì)量參考標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。

靈芝中的三萜類(lèi)化合物具有較好的治療癌癥、抗氧化、保護(hù)肝臟等藥用潛力，但目前對(duì)靈芝孢子粉中三萜類(lèi)化合物的研究較少，缺少成熟的分離提取和有效純化單體的技術(shù)，且其藥效作用基礎(chǔ)物質(zhì)不明確，因此有必要深入研究，明確相關(guān)的藥效活性成分及其藥理作用機(jī)制，并制定統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)來(lái)規(guī)范靈芝孢子粉的產(chǎn)品質(zhì)量，從而為靈芝孢子粉的開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。