不同青苔發(fā)病程度下柑橘葉片營養(yǎng)及葉際生物特征分析

楊 蕾，張云貴，楊海健，李勛蘭，洪 林

(重慶市農(nóng)業(yè)科學(xué)院 果樹研究所，重慶401329)

青苔在柑橘樹體上通常表現(xiàn)為葉面、果面、樹干上出現(xiàn)的綠色斑塊，是長江上游柑橘產(chǎn)區(qū)發(fā)生普遍的橘園生產(chǎn)問題。柑橘青苔不僅直接影響果實外觀，而且嚴(yán)重阻礙柑橘樹體的光合作用，破壞柑橘的生理代謝過程，進(jìn)而影響果實品質(zhì)，導(dǎo)致柑橘樹勢衰退[1-2]。青苔發(fā)生已給果農(nóng)帶來了巨大的損失，成為制約柑橘產(chǎn)業(yè)提質(zhì)增效的主要影響因素之一。前期研究表明，柑橘青苔的主要病原為unculturedApatococcus等綠藻和病原真菌。柑橘青苔的發(fā)生主要受環(huán)境中溫度、濕度及果園管理水平等多種因素控制，發(fā)生機(jī)制較為復(fù)雜?，F(xiàn)階段對柑橘青苔的防治多選擇一些化學(xué)農(nóng)藥，如乙蒜素、代森銨、可殺得叁仟等[3-4]，此外套袋等農(nóng)業(yè)措施也在一定程度上起到對柑橘果實表面青苔的防控作用[5]。目前對柑橘青苔的防治缺少環(huán)境友好型的方法，化學(xué)藥劑防治效果差、成本高，且易對環(huán)境造成諸多負(fù)面影響，農(nóng)業(yè)防治效果持續(xù)性差、局限性強(qiáng)。因此，開辟一條新的病害防治途徑，對于避免病原物抗藥性的增強(qiáng)和提高農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全具有重要意義。

礦質(zhì)營養(yǎng)元素是植物正常生長發(fā)育所必需的，主要包括大量元素氮(N)、磷(P)、鉀(K)，中量元素鈣(Ca)、鎂(Mg)、硫(S)和微量元素鐵(Fe)、錳(Mn)、銅(Cu)、鋅(Zn)、硼(B)、鉬(Mo)、氯(Cl)等。這些元素一方面可以作為植物組織的構(gòu)成成分或直接參與新陳代謝而起作用，另外還可以改變植物的生長方式、形態(tài)和解剖學(xué)特性等，影響植物的抗病性[6]。礦質(zhì)營養(yǎng)元素可以通過生物化學(xué)特性的改變，如產(chǎn)生大量的抑制性或抗性物質(zhì)，增強(qiáng)或減弱植物對病蟲害的抵抗力[7]，影響植物的生長和產(chǎn)量。因此，可以通過調(diào)節(jié)礦質(zhì)營養(yǎng)這個重要的環(huán)境因子，改變寄主植物的形態(tài)結(jié)構(gòu)和生理生化特征，從而達(dá)到增強(qiáng)寄主抗性、抑制病害發(fā)生的目的。病害的發(fā)生與植物營養(yǎng)有著密切的關(guān)系。N/Ca、K/Ca失調(diào)及缺鈣會引起庫爾勒香梨萼端黑斑病的發(fā)生并導(dǎo)致果實品質(zhì)下降[8]。鄭宏兵等[9]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)山核桃樹皮中N、K、Mg的含量低而P、Fe的含量高時，山核桃易感病。適宜的B、Ca、Mo濃度降低蠶豆巧克力斑點病的發(fā)生率[10]。

礦質(zhì)營養(yǎng)元素對柑橘各生理指標(biāo)的變化有重要的作用，營養(yǎng)元素的豐缺顯著影響柑橘產(chǎn)量和品質(zhì)[11]。但目前礦質(zhì)營養(yǎng)元素含量是否影響柑橘葉表青苔的發(fā)病程度未見報道，不同青苔發(fā)病程度下葉際生物群落結(jié)構(gòu)的變化規(guī)律尚未明確，礦質(zhì)營養(yǎng)元素-葉際生物-柑橘青苔發(fā)病程度間的相互關(guān)系缺少研究。本研究以晚熟柑橘品種W·默科特為試驗材料，分析在柑橘青苔不同發(fā)病程度下葉片礦質(zhì)營養(yǎng)元素含量和葉際生物群落結(jié)構(gòu)的變化特征，旨在找到發(fā)病程度與礦質(zhì)營養(yǎng)元素間的響應(yīng)特征及關(guān)鍵元素的變化規(guī)律，探索性分析主要病原與礦質(zhì)營養(yǎng)元素間的互作機(jī)制，為從養(yǎng)分水平調(diào)節(jié)控制柑橘青苔的發(fā)生提供理論依據(jù)，為柑橘青苔綠色防控提供新途徑和參考。

1 材料與方法

1.1 樣地設(shè)置

本實驗采樣地點為重慶市江津區(qū)白沙鎮(zhèn)(簡寫為B)和李市鎮(zhèn)(簡寫為L)。在兩地各選1片栽植面積6.7 hm2左右、樹齡為6 a、栽植密度為3 m×4 m、土壤類型為紫色土的W·默科特柑橘園為樣地，調(diào)查其柑橘青苔病的發(fā)生情況。兩地土壤養(yǎng)分基本情況如下：白沙鎮(zhèn)樣地有機(jī)質(zhì)含量20.36 g·kg-1、全氮0.96 g·kg-1、堿解氮94.75 mg·kg-1、速效鉀103.83 mg·kg-1、速效鈣0.61 g·kg-1、速效鎂0.09 g·kg-1、速效銅2.78 mg·kg-1、速效鐵191.80 mg·kg-1、速效錳9.67 mg·kg-1、速效鋅3.47 mg·kg-1、有效硼1.05 mg·kg-1；李市樣地有機(jī)質(zhì)含量13.25 g·kg-1、全氮0.84 g·kg-1、堿解氮75.96 mg·kg-1、速效鉀181.47 mg·kg-1、速效鈣1.92 g·kg-1、速效鎂0.35 g·kg-1、速效銅1.47 mg·kg-1、速效鐵122.00 mg·kg-1、速效錳52.95 mg·kg-1、速效鋅3.47 mg·kg-1、有效硼1.08 mg·kg-1。

1.2 發(fā)病率及病情指數(shù)調(diào)查計算方法

2018年2月，在選好的樣地中進(jìn)行柑橘青苔病發(fā)生情況調(diào)查。在每個樣地中劃定3個調(diào)查區(qū)域，每個區(qū)域中柑橘青苔病的發(fā)生情況采用五點法進(jìn)行調(diào)查取樣，每一點選取5株樹，每株樹分為上下2層在東南西北4個方位各隨機(jī)調(diào)查老熟葉片各25片，每株樣樹調(diào)查葉片200片，每個樣地共調(diào)查15 000片柑橘葉片，分級記載所調(diào)查的葉片的數(shù)量，計算發(fā)病率及病情指數(shù)。

柑橘葉片青苔病分級方法如下(0級屬于正常葉片)：

S=青苔面積/葉片總面積×100%

0級(G0)，S=0，健葉；1級(G1)，0

發(fā)病率(%)=(發(fā)病的葉片數(shù)/調(diào)查的葉片總數(shù))×100。

病情指數(shù)=∑(病葉數(shù)×該病級代表數(shù)值)/(調(diào)查葉數(shù)×發(fā)病最高一級代表值)×100。

1.3 葉片礦質(zhì)營養(yǎng)元素測定

葉樣采集方法為：在1.2節(jié)中選定的每株樣樹上按東南西北4個方位上下2層隨機(jī)剪取帶葉枝條各3枝，每枝葉片數(shù)量>100片，將樣枝帶回實驗室后收集全部老熟樣葉。將所采集的兩樣地柑橘混合葉樣按青苔病發(fā)病程度進(jìn)行分組并編號，將不同組別葉樣分別進(jìn)行清洗、殺青和干燥預(yù)處理后，測定各病情等級下葉片中N、P、K、Ca、Mg、Zn、Cu、Fe、Mn、B這10種礦質(zhì)營養(yǎng)元素含量[12]。將每組葉樣分成3份測定礦質(zhì)營養(yǎng)元素含量，每份葉片數(shù)>200片，每份葉樣中每種元素含量測定時讀取3個數(shù)值。采用硫酸-雙氧水消解，半微量凱氏定氮法測定葉片N含量；采用鉬銻抗比色法測定葉片全P含量；采用火焰光度計法測定葉片全K含量；采用硝酸-雙氧水消解，ICP-aes/ms測定Ca、Mg、Zn、Cu、Fe、Mn、B含量。

1.4 葉表生物真核生物多樣性測定

利用Illumina Miseq高通量測序技術(shù)探索各級葉片葉際真核生物的群落組成、豐度、差異及其與元素之間的關(guān)系，使用R語言工具制作相關(guān)圖表，用SPSS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同樣地柑橘青苔病發(fā)病情況特征

通過調(diào)查發(fā)現(xiàn)，實驗中選定的2個W·默科特果園青苔病的發(fā)生情況均較為嚴(yán)重，李市和白沙果園青苔發(fā)病率分別為84.60%和71.30%，病情指數(shù)分別為58.58和48.48(表1)。李市柑橘園青苔病的發(fā)病率和病情指數(shù)均高于白沙柑橘園。從具體病情指數(shù)特征來看，位于下層的柑橘葉片較上層而言發(fā)病程度更重；北面的柑橘葉片青苔發(fā)生最重，東面的柑橘葉片青苔病病情指數(shù)相對較低；兩樣地的柑橘青苔發(fā)病程度和病情特征較為一致。

2.2 不同發(fā)病程度下葉片營養(yǎng)特征

2.2.1 柑橘樹體營養(yǎng)狀況總體評估

本研究中兩采樣點之間柑橘葉片的N、P、K、Ca、Mg、Fe、Mn、Zn、Cu、B這10種礦質(zhì)營養(yǎng)元素含量均存在明顯的差異(表2)，特別是李市點葉片中Cu元素含量幾乎為白沙點葉片中2倍。李市點僅P、Mg和B三種元素含量要低于白沙點，其他7種元素含量均高于白沙點。以《柑橘營養(yǎng)診斷配方施肥技術(shù)規(guī)程》(DB50/T487—2012)為礦質(zhì)營養(yǎng)水平評價標(biāo)準(zhǔn)[13]，李市點柑橘葉片10種元素中僅Fe含量處于偏高水平；N、P、Mn、Cu等4種元素含量處于適宜水平；Ca、Mg、B含量偏低；K、Zn 2種元素含量低，處于極缺水平狀態(tài)。白沙點柑橘葉片中Fe含量稍偏高于適宜水平高值，N、P含量適宜；Ca、Mg、B含量偏低；而K、Mn、Zn、Cu 4種元素含量極缺。

2.2.2 柑橘青苔病不同病情等級下葉片礦質(zhì)營養(yǎng)差異分析

分別對李市和白沙樣地不同病情等級下葉片礦質(zhì)營養(yǎng)元素含量進(jìn)行方差分析，結(jié)果表明：處于不同病情等級下的不同樣地中柑橘葉片中的10種礦質(zhì)營養(yǎng)元素含量均存在極顯著差異(P=0.000) (表3)。B含量變化幅度最大，其次為Fe、Cu含量，而N含量變化幅度最小。白沙3級葉片中B含量是白沙0級葉片中B含量的3.66倍，李市3級葉片中Fe含量是李市0級葉片中Fe含量的2.59倍，李市3級葉片中Cu含量是白沙3級葉片中Cu含量的2.54倍。

通過相關(guān)性檢驗和回歸分析發(fā)現(xiàn)(表4)，除李市Mn和白沙Mg、Zn、B含量與病情等級間不存在相關(guān)性外，葉片病情等級與礦質(zhì)營養(yǎng)元素含量間存在顯著的相關(guān)性。2塊樣地中除N和Cu之外，其他葉片元素含量與病情等級的相關(guān)關(guān)系較為一致。其中Ca含量與病情等級存在極顯著正相關(guān)關(guān)系，P含量與病情等級存在極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系。此外，白沙葉片中的K含量、李市葉片的Ca含量與病情等級的正相關(guān)性很強(qiáng)，李市葉片的Mg含量與病情等級的負(fù)相關(guān)性很強(qiáng)。

2.3 不同發(fā)病程度下葉表生物多樣性特征

2.3.1 柑橘青苔病葉葉表群落基本組成和結(jié)構(gòu)

通過計算不同分類水平上鑒定出來的種系型，在所有樣品中共鑒定到真核生物的163個門、159個綱、146個目、124個科、153個屬和181個種(表5)。在屬的水平上，除柑橘外占優(yōu)勢的屬是Heterochlorella、Symmetrospora、Cladosporium、Sporidiobolus、Microsporomyces、Heveochlorella，它們在不同的病情等級上具有不同的相對豐度(圖1)，分別對應(yīng)的相對豐度為0.26%～15.13%、0.26%～10.48%、0.38%～8.93%、0.03%～13.29%、0.03%～3.92%、0.06%～2.29%。

表1 樣地柑橘青苔病病情指數(shù)統(tǒng)計

Table 1 The disease index of citrus moss disease in different sample plots

樣地Simpleplot發(fā)病率/%Incidencerate病情指數(shù)Disease index樣點平均Average東上Eastupside南上Southupside西上Westupside北上Northupside東下Eastbottom南下Southbottom西下Westbottom北下Northbottom東East南South西West北North上Upside下Bottom白沙71.3048.4818.4032.8025.2834.4048.4872.6476.0079.8433.4452.7250.6457.1227.7269.24李市84.6058.3832.8076.4823.6862.2460.0063.5267.5282.4046.4070.0045.6072.3248.8068.36

表2 兩樣地柑橘葉片10種礦質(zhì)營養(yǎng)元素含量

Table 2 The content of 10 kinds of mineral nutrient elements in citrus leaves in two sample plots

樣地Sample plotN/(g·kg-1)P/(g·kg-1)K/(g·kg-1)Ca/(g·kg-1)Mg/(g·kg-1)Fe/(mg·kg-1)Mn/(mg·kg-1)Zn/(mg·kg-1)Cu/(mg·kg-1)B/(mg·kg-1)李市 L26.22±1.051.20±0.113.79±0.4927.34±3.042.23±0.26138.04±41.4925.54±1.9111.82±1.996.09±0.8328.61±5.31 b白沙 B24.97±1.131.44±0.183.59±0.3025.48±2.012.50±0.12121.22±20.7216.49±1.0910.12±0.943.43±0.6130.69±5.90 a

數(shù)據(jù)表示為均值±標(biāo)準(zhǔn)差。同一列數(shù)據(jù)后沒有相同字母表示差異顯著(P<0.05)。下同。

Data were expressed as the mean ± SE. The different lowercase letters within the same row indicate significant difference(P<0.05). The same as below.

表3 不同青苔病病情等級下葉片元素含量

Table 3 Mineral nutrient element contents in citrus leaves under different moss disease levels

樣地Sampleplot病情等級DiseaselevelN/(g·kg-1)P/(g·kg-1)K/(g·kg-1)Ca/(g·kg-1)Mg/(g·kg-1)Fe/(mg·kg-1)Mn/(mg·kg-1)Zn/(mg·kg-1)Cu/(mg·kg-1)B/(mg·kg-1)李市L026.52±1.23 b1.37±0.23 c2.80±0.34 d23.16±2.15 f2.48±0.27 b85.21±7.62 e26.16±1.99 a11.02±0.96 cd4.48±0.51 c18.09±1.62 e127.37±1.73 a1.23±0.12 d3.76±0.47 b25.40±2.01 e2.57±0.19 a123.87±18.54 d25.60±2.03 a10.97±1.05 d5.60±0.64 bc28.46±2.45 c226.73±1.06 b1.30±0.12 cd4.03±0.58 a26.72±2.86 c2.38±0.20 c125.06±19.02 d24.81±2.14 a10.27±1.32 e6.52±0.82 b28.51±2.51 c326.94±0.87 a1.08±0.18 e4.41±0.25 a26.80±2.56 c2.07±0.17 e220.67±21.47 a25.67±1.58 a11.53±1.47 b7.01±0.61 a29.98±3.07 c425.53±1.59 c1.10±0.09 e3.83±0.36 b29.09±3.14 ab1.97±0.12 e123.70±19.36 c22.27±1.78 b10.93±0.83 d6.57±0.58 b30.87±3.15 c524.23±1.47 d1.10±0.11 e3.93±0.48 ab32.87±3.89 a1.89±0.19 e149.70±18.20 b28.74±2.22 a16.18±1.25 a6.36±0.81 b35.78±3.32 b白沙B023.23±1.02 d1.72±0.14 a3.30±0.29 cd21.71±1.78 f2.38±0.25 c101.46±18.45 cd14.92±0.69 d11.35±1.00 bc4.18±0.55 c17.81±1.25 e124.79±2.01 d1.65±0.13 a3.25±0.34 d24.47±2.32 e2.59±0.23 a110.09±21.32 c16.12±0.87 d9.60±1.09 ef4.34±0.47 c22.73±2.02 d224.93±1.23 c1.45±0.08 b3.46±0.41 c25.60±2.15 e2.59±0.28 a104.30±23.24 cd15.38±0.83 d9.08±0.65 f3.18±0.50 d21.14±1.88 d327.00±1.08 a1.35±0.14 c3.70±0.25 b26.96±2.20 c2.56±0.18 a122.21±20.57 c17.52±1.25 c8.96±0.71 f2.76±0.41 e65.15±5.47 a424.45±1.78 d1.27±0.10 cd3.68±0.68 b27.98±3.26 b2.56±0.21 a163.04±26.15 a17.14±1.04 cd10.81±0.86 d2.86±0.36 e28.60±2.09 c525.43±1.06 c1.23±0.11 d4.13±0.31 a26.15±2.78 d2.30±0.24 c126.23±15.02 c17.84±1.58 c10.93±0.98 d3.23±0.33 d28.73±2.56 c

表4 不同樣地葉片礦質(zhì)營養(yǎng)元素含量與病情等級相關(guān)性

Table 4 The correlation between mineral nutrient elements contents and the disease level

元素Nutrient element樣地Sample plot斜率SlopeR2方程EquationFtP值P-valueNL-0.47890.6056y=-0.4798x+27.924.558-4.9560.000B0.34270.2687y=0.3427x+23.7715.93743.1910.027PL-0.05650.7490y=-0.0565x+1.395745.607-6.7530.000B-0.10480.9564y=-0.1048x+1.8102344.49382.0020.000KL0.17930.3896y=0.1793x+3.166610.0243.1660.006B0.16280.8767y=0.1628x+3.016109.34210.4570.000CaL1.70570.9163y=1.7057x+21.37175.57742.6270.000B0.97440.6886y=0.9744x+22.06835.2535.9370.000MgL-0.1450.8958y=-0.145x+2.7334134.326-11.5900.000B-0.01580.0547y=-0.0158x+2.55270.837-.09150.374FeL11.930.2411y=11.93x+96.2825.0842.2550.039B8.58990.5013y=8.5899x+91.15516.0784.0100.001MnL0.1080.0093y=0.108x+25.1630.1500.3870.704B0.56620.7860y=0.5662x+14.50758.2197.6300.000ZnL1.10840.5359y=1.1084x+8.650312.4893.5340.003B0.04310.0570y=0.4381x+8.5650.0860.2920.774GuL0.36590.5626y=0.3659x+4.810320.5064.5280.000B-0.27280.5813y=-0.2728x+4.381222.280-4.7200.000BL2.77630.7974y=2.7763x+18.89762.9577.9350.000B3.31990.1272y=3.3199x+19.0732.3331.5270.146

表5 不同分類水平下的物種注釋表

Table 5 The classified phylotypes detected at different taxonomical levels

分類TaxonB0B1B2B3B4B5L0L1L2L3L4L5界Superkingdom162181117165148148108152110180153180門Phylum14716310214712913799135101149130159綱Class1421561011381291319513695153132159目Order131146901321181159012585142124146科Family1051227811497987010267121104124屬Genus135151951371231259513193150131153種Species162181117165148148108152110180153180

圖1 屬水平下優(yōu)勢物種豐度Fig.1 The relative abundance of dominant species at genus level

2.3.2 柑橘青苔病不同病情等級下真核生物群落組成與多樣性差異

在屬水平上(圖2)，病情等級1下優(yōu)勢屬是Heterochlorella、Sporidiobolus和Cladosporium，病情等級2下優(yōu)勢屬是Heterochlorella、Symmetrospora和Microsporomyces，病情等級3下優(yōu)勢屬是Heterochlorella、Cladosporium和Sporidiobolus，病情等級4下優(yōu)勢屬是Heterochlorella、Cladosporium和Heveochlorella，病情等級5下優(yōu)勢屬是Heterochlorella、Cladosporium和Microsporomyces。隨著病情等級提高，Microsporomyces、Heterochlorella和Cladosporium的相對豐度與病情等級呈正相關(guān)關(guān)系。

在種水平上，屬于Trebouxiophyceae(共球藻綱)的unculturedApatococcus、Heterochlorellaluteoviridis和Heveochlorellahainangensis的豐度與病情指數(shù)等級呈極顯著的正相關(guān)關(guān)系(表6)，而前期研究表明，這3種藻類是引發(fā)柑橘青苔的主要病原物，即病情等級會隨著主要病原物的相對豐度的增加而升高。

對2個樣地中處于6個病情等級的12份樣品的葉表真核生物的α多樣性指標(biāo)進(jìn)行檢測計算，結(jié)果見表7，方差分析表明12個樣品的α多樣性指標(biāo)存在顯著差異(P<0.05)。12組數(shù)據(jù)α多樣性指標(biāo)均在病情等級為2級時最低，在病情等級為1級或是3級時最高；隨著病情等級的提高，α多樣性呈現(xiàn)先升后降再升再降的趨勢。

圖2 樣品在屬水平上的相對豐度Fig.2 The relative abundance of different samples at genus level

表6 不同病情等級下3種藻類的相對豐度變化

Table 6 Relative abundances of species unculturedApatococcus，Heterochlorellaluteoviridis，Heveochlorellahainangensisfrom samples with different disease levels

樣品編號SampleunculturedApatococcus/%Heterochlorellaluteoviridis/%Heveochlorellahainangensis/%B02.931.810.14B13.603.510.48B29.313.380.33B315.784.530.23B418.619.601.21B542.9619.331.71L00.400.260.06L117.833.640.32L221.513.280.48L328.404.500.54L430.594.551.16L538.6715.132.29

2.4 柑橘青苔主要病原物與葉片礦質(zhì)營養(yǎng)元素間的關(guān)系

2.4.1 物種與礦質(zhì)營養(yǎng)元素相關(guān)性分析

基于Pearson相關(guān)性分析各物種與礦質(zhì)營養(yǎng)元素間的相關(guān)性，以相關(guān)系數(shù)|cor|>0.3且P<0.05作為顯著性篩選閾值，篩選與各元素顯著相關(guān)的物種。本研究重點關(guān)注了幾種柑橘青苔病原物與礦質(zhì)營養(yǎng)元素間的相關(guān)性。結(jié)果顯示(表8)，最主要的病原物unculturedApatococcus與P呈極顯著負(fù)相關(guān)，與K、Ca呈極顯著正相關(guān)，與Mg呈顯著負(fù)相關(guān)；Heveochlorellahainangensis與Fe呈極顯著正相關(guān)，與K呈顯著正相關(guān)；可能的病原物Occultifurexternus、Coniochaetalessp. GMG C4分別與Fe、B呈極顯著正相關(guān)。

2.4.2 礦質(zhì)營養(yǎng)元素對葉表真核生物物種組成的影響

冗余分析(redundancy analysis，RDA)是基于線性模型的約束性排序分析，可以解釋環(huán)境因子對于樣本中物種組成的影響。根據(jù)紅色箭頭射線的長短可以看出，對柑橘葉表真核生物類群影響作用由大到小依次為P>Fe>Mn>Cu>Mg>N>K>Zn>Ca>B(圖3)。菌群-虛線中心連線與箭頭之間的夾角代表了樣本/菌群與環(huán)境因子之間的相關(guān)關(guān)系(夾角為銳角時表示呈正相關(guān)關(guān)系，鈍角時呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，直角表示不相關(guān))，結(jié)果顯示，主要病原菌unculturedApatococcus、Cladosporiumherbarum與P、Mg呈負(fù)相關(guān)，與Fe、Mn、Cu、N、K、Zn、Ca、B呈正相關(guān)。

表7 α多樣性指數(shù)統(tǒng)計表

Table 7 The statistical table of α diversity index

樣品編號SamplesObservedChao1ACEShannonInvSimpsonCoverageB0162 d187.50 f192.15 e1.27 i0.45 g0.999664B1181 a216.00 b213.84 a2.21 a0.76 b0.999644B2117 h127.50 l135.26 k0.83 k0.32 i0.999792B3165 c190.20 e199.47 d1.48 g0.57 e0.999644B4148 g190.27 d173.40 f1.49 f0.56 f0.999693B5148 g160.50 i169.58 g1.77 e0.71 d0.999743L0108 j153.09 j151.64 j0.49 l0.18 j0.999683L1152 f161.50 h165.74 i1.96 d0.78 a0.999802L2110 i133.10 k130.74 l1.07 j0.45 h0.999782L3180 b226.75 a212.29 b2.09 b0.73 c0.999664L4153 e169.50 g169.06 h1.43 h0.59 d0.999782L5180 b211.06 c207.03 c2.04 c0.76 b0.999674

表8 柑橘青苔主要病原物與礦質(zhì)營養(yǎng)元素相關(guān)性

Table 8 The correlation between mineral nutrient element contents and the main pathogen

物種Taxon礦質(zhì)營養(yǎng)元素Nutrientelement相關(guān)系數(shù)CorP值P-valueUncultured ApatococcusP-0.770820.0033Uncultured ApatococcusK0.7575180.0043Heveochlorella hainangensisK0.6894830.0131Uncultured ApatococcusCa0.7164350.0088Uncultured ApatococcusMg-0.593040.0421Heveochlorella hainangensisFe0.9273970.0000Occultifur externusFe0.8452090.0005Coniochaetales sp. GMG_C4B0.8996540.0001

圖3 多樣本礦質(zhì)營養(yǎng)元素與樣本/物種 RDA 分析Fig.3 RDA analysis of nutrient element and sample/species

綜合分析柑橘葉片礦質(zhì)營養(yǎng)元素含量、葉表真核生物群落結(jié)構(gòu)與柑橘青苔病病情等級的關(guān)系可以發(fā)現(xiàn)，兩組關(guān)系存在一致性：葉片中P、Mg含量與病情等級、主要病原物相對豐度呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)關(guān)系；葉片中Ca、K含量與病情等級、主要病原物相對豐度呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系。

3 討論

礦質(zhì)營養(yǎng)元素既可以作為植物體的組成成分，又可以參與或調(diào)節(jié)細(xì)胞中重要的代謝過程。其不僅調(diào)控植物的正常生長發(fā)育，而且改變微生物群落結(jié)構(gòu)[14]，影響病原菌和微生物生長，以多種方式直接或間接地影響植物的感病和抗病性，在病害控制中扮演重要角色。青苔是三峽庫區(qū)柑橘果園的重要病害，在低洼、郁閉老果園發(fā)病較重。柑橘健康葉表有許多異形細(xì)胞或油胞破裂而形成的凹陷小坑，附生菌主要分布在葉片的上表皮細(xì)胞內(nèi)和柵欄組織中，亦可寄生在細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞間隙。而寄生藻類生長所需礦質(zhì)營養(yǎng)元素的來源取決于柑橘葉片中破裂的油胞、角質(zhì)膜等特殊結(jié)構(gòu)[15]。本研究結(jié)果顯示，不同柑橘青苔病發(fā)病程度下的葉片礦質(zhì)營養(yǎng)元素含量和葉際生物群落結(jié)構(gòu)差異顯著。P和青苔發(fā)生之間的關(guān)系最顯著，Ca和K含量與青苔的發(fā)生關(guān)系密切，F(xiàn)e、Mg與青苔的發(fā)病程度有一定的相關(guān)性但貢獻(xiàn)率較P和Ca小。

本研究中，unculturedApatococcus、Heterochlorellaluteoviridis和Heveochlorellahainangensis三種主要病原物豐度與發(fā)病程度極顯著正相關(guān)，P、Ca與unculturedApatococcus豐度均呈極顯著負(fù)正相關(guān)關(guān)系，其他如K、Fe、Mg等元素與主要病原物豐度之間僅表現(xiàn)出一定的相關(guān)關(guān)系，說明P和Ca可能是青苔滋生并侵染柑橘葉片過程中最為重要的影響因子。目前人們普遍認(rèn)為P有利于植物生長發(fā)育，但也有少量研究表明P會增強(qiáng)病原物對植物的侵染[16-17]。P是藻類生長最主要的礦質(zhì)營養(yǎng)元素之一，是藻細(xì)胞核酸和膜的主要成分，也是三磷酸腺苷(ATP)的主要元素。在營養(yǎng)液培養(yǎng)環(huán)境條件下，添加N和P可促進(jìn)綠藻相對豐度顯著增加[18]，且中、高P水平條件下藻類生物量要明顯高于低P水平[19]，高P水平的環(huán)境條件下藻類生長速率更快，單位葉綠素光合效率更高，低N/P更有利于藻細(xì)胞的生長[20]。近年來，我們也發(fā)現(xiàn)柑橘栽培過程中過多使用KH2PO4等含P葉面肥會加重青苔的發(fā)病程度，進(jìn)一步表明青苔病原藻類的生長繁殖與P關(guān)系密切，柑橘葉片可能為青苔病原藻類的生長繁殖提供場所和P源。隨著青苔病情等級提高，主要病原unculturedApatococcus豐度明顯增加，而葉片P含量下降，兩者之間呈極顯著負(fù)相關(guān)，分析其原因可能是unculturedApatococcus生長繁殖需要從葉片中吸收P元素作為主要營養(yǎng)來源。Ca在植物體內(nèi)可參與調(diào)控防御反應(yīng)，提高寄主植物對外部病原微生物的抵抗能力[21-22]。在黃龍病侵染紐荷爾臍橙的研究中發(fā)現(xiàn)，黃龍病侵染后植株葉片中Mg、Mn、Fe和Zn等與葉綠素合成及光合系統(tǒng)相關(guān)的礦質(zhì)營養(yǎng)元素顯著減少，而葉片Ca含量隨著黃龍病侵染時間的延長而增加[23]。而在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)隨著病情等級的增加，青苔主要病原物的相對豐度不斷升高，葉片Ca含量也逐漸增加，并顯著高于未發(fā)病葉片中Ca的含量，與黃龍病侵染臍橙的研究結(jié)果一致。相關(guān)性分析表明，主要病原物unculturedApatococcus的相對豐度與Ca含量呈極顯著正相關(guān)，說明Ca含量的上升可能是植物細(xì)胞增強(qiáng)其對病原物侵染耐受性的一種方式，推測青苔滋生可能刺激葉片Ca元素的吸收、轉(zhuǎn)運和積累，激發(fā)了植物體Ca2+信號調(diào)控的病害防御反應(yīng)途徑，或與鈣調(diào)蛋白(CaM)相結(jié)合后可直接調(diào)節(jié)植物抗病相關(guān)基因的表達(dá)[24]。有研究表明，植物細(xì)胞質(zhì)中游離Ca2+濃度過高時可與磷酸鹽形成沉淀，干擾與P代謝相關(guān)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，進(jìn)而影響植株的正常生長[25]；反之，P逐漸累積，Ca有效性降低，同時影響Fe、Zn等微量元素積累，造成植株養(yǎng)分吸收極不均衡[26]。本研究發(fā)現(xiàn)，伴隨青苔病病情等級增加，柑橘葉片中Ca含量和P含量恰好呈相反的變化趨勢，但這是否表明P的減少是由藻類生長消耗所致或是Ca的拮抗作用仍不清楚，需進(jìn)一步深入探討。K被廣泛認(rèn)為可通過改變寄主植物的化學(xué)和物理結(jié)構(gòu)來增強(qiáng)病原物和害蟲的抵抗力[27]。試驗發(fā)現(xiàn)unculturedApatococcus和Heveochlorellahainangensis兩種藻類豐度分別與葉片K含量呈極顯著和顯著正相關(guān)，推測這兩種藻類侵染可能作為環(huán)境脅迫因子激活葉片免疫防御反應(yīng)，植物體通過在葉片中積累更多的K，來獲得更高的抗病能力。Fe在植物細(xì)胞氧化還原系統(tǒng)和多種酶中扮演重要角色，最近的研究認(rèn)為Fe也是影響藻類生長的主要限制因素[28]，低光照強(qiáng)度下藻細(xì)胞的生長率較低，但是藻細(xì)胞卻需要吸收更多的P和Fe[29]。本試驗中，不同發(fā)病等級的葉片F(xiàn)e含量要顯著高于健康葉片，Heveochlorellahainangensis和Occultifurexternus兩種病原物的豐度與Fe呈極顯著正相關(guān)，說明Fe和病原物的生長關(guān)系密切，且Fe對上述兩種病原的生長可能起到一定的促進(jìn)作用。Mg在植物中作為其他物質(zhì)的親和配體，是葉綠素和蛋白合成的重要元素，在很多酶發(fā)揮功能中起重要作用。Mg、S等元素削弱植物的抗病性，而提高了植物的發(fā)病率，比如增施鎂肥反而促進(jìn)了立枯病對豇豆幼苗的侵染[30]。而本研究中，unculturedApatococcus與Mg呈顯著負(fù)相關(guān)，即unculturedApatococcus豐度增加時，葉片中Mg含量降低，并且病情等級越高，含量越低，其原因有待進(jìn)一步研究。有研究認(rèn)為，植物體內(nèi)Ca和K兩種元素的吸收之間存在拮抗作用[31]，Mg與Ca間也有類似效應(yīng)[32]，此外Mg也會影響作物對N、P、K的吸收和利用率[33]。試驗發(fā)現(xiàn)不同發(fā)病等級下李市采樣點葉片中Ca含量增加，Mg含量降低，與上述拮抗效應(yīng)的表現(xiàn)相符。另外，光合作用是藻類生長繁殖的關(guān)鍵生理代謝過程，Mg又是作為葉綠素的重要組成元素。因此，Mg含量與病原物豐度之間的消長關(guān)系也有可能是青苔病原物快速生長的過程中吸收葉片中的Mg所引起的。

葉片作為植物光合作用的主要場所，為葉際生物的定殖提供了良好的生活環(huán)境。近年來，高通量測序技術(shù)不斷發(fā)展，大大促進(jìn)了植物葉際微生物組成和結(jié)構(gòu)方面的深入研究。微生物中致病菌不僅影響植物健康，也影響植物相關(guān)微生物的組成和結(jié)構(gòu)[34]。本研究發(fā)現(xiàn)，主要病原物的豐度隨著病情等級的升高而增加；而柑橘葉表真核生物α多樣性隨著病情等級的提高呈現(xiàn)先升后降再升再降的趨勢，即α 多樣性指標(biāo)在病情等級為2級時最低，在病情等級為1級或是3級時最高。本研究結(jié)果顯示，葉片十分健康或嚴(yán)重發(fā)病的情況下，葉際生物多樣性均較低。這種規(guī)律與對山核桃干腐病[35]、黃瓜枯萎病[36]等的研究結(jié)果基本相同，而與Rosenzweig等[37]發(fā)現(xiàn)健康葉片上的微生物多樣性大于發(fā)病植株這一結(jié)論不完全一致。產(chǎn)生本試驗結(jié)果的原因可以推測為：單個病原物或有益微生物的豐度變化都可能導(dǎo)致整個微生物組成的改變，且在發(fā)病程度不斷加重的過程中葉際生物群落結(jié)構(gòu)因各物種之間復(fù)雜的相互作用而使得平衡關(guān)系不斷調(diào)整，呈現(xiàn)出交替變化的趨勢。在健康植株中可能存在優(yōu)勢拮抗生物種群，其代謝產(chǎn)物可以抑制或是殺死其它病原菌群[38]，使得生物多樣性較低；當(dāng)有少量病原物入侵后，增加了新的物種，多樣性指標(biāo)隨之增高；而當(dāng)病原物豐度較高，成為優(yōu)勢種群后，可能會通過產(chǎn)生毒素等有害物質(zhì)抑制其他種群數(shù)量[39]，多樣性由此而降低。

根據(jù)此研究結(jié)果可以明確柑橘樹體中礦質(zhì)營養(yǎng)元素與青苔病的發(fā)生間存在聯(lián)系，但礦質(zhì)營養(yǎng)元素與病原物的群落特征間存在著復(fù)雜的相互作用，目前尚缺乏有效的方法來分析、解釋、驗證它們之間的關(guān)系，故需要進(jìn)一步研究各礦質(zhì)營養(yǎng)元素與病害間的關(guān)系，特別是其對樹體微生態(tài)、病原物侵染、發(fā)育的影響機(jī)理，探索一條基于礦質(zhì)營養(yǎng)水平調(diào)控的柑橘青苔病綠色防控新路徑。