人參皂苷 Rb2 體內(nèi)抑制破骨細(xì)胞的作用及其機(jī)制研究

柳嘉偉 蘇柯 黃鑫 王春梅 袁志

骨質(zhì)疏松癥是世界常見(jiàn)病、多發(fā)病，在慢性病中已躍居第 3 位，僅次于心血管疾病、糖尿病。在我國(guó)，50 歲以上中老年人骨質(zhì)疏松患病率為 15.7% ( 約 7000 萬(wàn) )。2010 年，我國(guó)骨質(zhì)疏松相關(guān)骨折患者達(dá) 233 萬(wàn)例次，為此醫(yī)療支出 94.5 億美元[1]。預(yù)計(jì)到 2050 年我國(guó)骨質(zhì)疏松或骨密度低的患者將達(dá) 2.12 億[2]。隨著人口老齡化社會(huì)的到來(lái)，骨質(zhì)疏松越發(fā)嚴(yán)重地影響著中老年人的身心健康，已經(jīng)成為嚴(yán)重的醫(yī)學(xué)甚至社會(huì)問(wèn)題。

目前治療骨質(zhì)疏松一線用藥為雙膦酸鹽類，抑制破骨細(xì)胞活化，降低骨轉(zhuǎn)換率，但有研究表明雙膦酸鹽可能導(dǎo)致骨壞死、股骨非典型骨折等[3-4]。其它用藥包括甲狀旁腺激素類似物 ( 特立帕肽 )、RANKL 抗體 ( 德尼單抗 ) 等，也存在導(dǎo)致骨肉瘤、鈣穩(wěn)態(tài)失衡等不良反應(yīng)，其費(fèi)用、安全性也有待檢驗(yàn)[5-6]。因此，高生物活性、少副作用、能夠長(zhǎng)期服用的天然物質(zhì)或許是治療骨質(zhì)疏松的選擇之一。

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，人參皂苷 Rb2 能夠抑制小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞凋亡，并能夠促進(jìn)成骨前體細(xì)胞系的增殖，提高堿性磷酸酶的表達(dá)水平[7]。同時(shí)體外研究表明，Rb2 能夠通過(guò)自噬抑制破骨細(xì)胞，但其在體內(nèi)對(duì)破骨細(xì)胞是否發(fā)揮作用及其機(jī)制尚不清楚[8-9]。本實(shí)驗(yàn)以 balb / c 小鼠為研究對(duì)象，通過(guò)建立去勢(shì)骨質(zhì)疏松模型，觀察 Rb2 在體內(nèi)對(duì)破骨細(xì)胞的作用，并研究其相關(guān)機(jī)制，進(jìn)一步完善人參皂苷 Rb2 預(yù)防和治療骨質(zhì)疏松的理論 基礎(chǔ)。

材料與方法

一、小鼠

7 周齡 balb / c 小鼠 ( 來(lái)源于空軍軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物中心 )。

二、藥物與試劑

人參皂苷 Rb2 購(gòu)自上海同田生物技術(shù)股份有限公司；mi cro-CT 分析儀；抗酒石酸酸性磷酸酶 ( tartrate-resistant factor acid phosphatase，TRAP )、I 型膠原 C 端肽 ( C-terminal telopeptide-I，CTX-1 ) Elisa 試劑盒 ( 上海聯(lián)碩公司 )；α-MEM 培養(yǎng)基、胎牛血清、青鏈霉素 ( 美國(guó) Gibco 公司 )；細(xì)胞因子核因子 κB 受體活化因子配體 ( receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL ) ( 美國(guó) Peprotech 公司 )；核蛋白提取試劑盒 ( 上海碧云天公司 )；TRAP、P65、自噬標(biāo)志輕鏈 3 ( autophagy marker light chain 3，LC3 )、哺乳動(dòng)物雷帕霉素蛋白 ( mammalian t ar get of r apamyci nm，TOR )、5’-磷酸腺苷活化蛋白激酶 ( adenosine 5’-monophosphate -activated protein kinase，AMPK )、磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶 ( phosphorylated adenosine monophosphate activated protein kinasep，AMPK ) 抗體 ( 英國(guó) Abcam 公司 )。

三、建立動(dòng)物模型

40 只 7 周齡 balb / c 小鼠，平均體重 ( 19.8± 0.8 ) g，編號(hào)后按隨機(jī)數(shù)表法分成 4 組 ( 假手術(shù)組、去勢(shì)組、低劑量組、高劑量組 )，每組 10 只，分籠飼養(yǎng)于西京醫(yī)院動(dòng)物房，每日光照與黑夜各 12 h，充足食物、飲水供給，適應(yīng)環(huán)境 1 周。在 1.5% 戊巴比妥鈉 ( 40 mg / kg ) 麻醉下取背部雙切口切開(kāi)皮膚，打開(kāi)腹膜，找到并切除雙側(cè)卵巢 ( 其中假手術(shù)組僅找到卵巢，不做切除 )。而后低劑量組、高劑量組分別以 5 mg / ( kg · d )、20 mg / ( kg · d ) 劑量腹腔注射 Rb2 溶液 ( 0.2 ml )，假手術(shù)組、去勢(shì)組腹腔注射等量蒸餾水，常規(guī)飼養(yǎng) 12 周。

四、Elisa 檢測(cè)小鼠血清 TRAP、CTX-1 水平

小鼠麻醉后仰臥于工作臺(tái)上，打開(kāi)胸腔，1 ml 注射器從心尖部進(jìn)針緩慢抽血，注入 EP 管中，按組別做好標(biāo)記，室溫靜置 2 h，3000 rpm 離心 10 min，取上清，再 3000 rpm 離心 5 min，取上清。采用雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) ( enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA )，設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔、空白孔和樣本孔，依次上樣，按照試劑盒使用說(shuō)明書(shū)操作，檢測(cè)血清 TRAP、CTX-1 濃度。

五、股骨 TRAP 染色

取小鼠股骨，4% 多聚甲醛固定，10% EDTA 脫鈣液脫鈣，完成后流水沖洗 4 h，而后依次梯度酒精脫水，石蠟包埋，切片，依次二甲苯-無(wú)水乙醇-高濃度酒精-蒸餾水脫蠟，按試劑說(shuō)明染色，使用 ImageJ 1.8 軟件對(duì)染色結(jié)果進(jìn)行分析。

六、原代破骨細(xì)胞提取及培養(yǎng)

按之前所述步驟取小鼠股骨、脛骨，從兩端干骺端剪斷，放入 α-MEM 培養(yǎng)基中。用 1 ml 注射器吸取培養(yǎng)液，從長(zhǎng)骨近端推入，從遠(yuǎn)端沖出髓腔內(nèi)容物，用無(wú)菌濾器過(guò)濾沖出液體，離心 5 min 取沉淀，加入裂紅液，裂解 15 min，再次離心 5 min 取沉淀，移入含 M-CSF 的 α-MEM 培養(yǎng)基中，按分組做好標(biāo)記，在培養(yǎng)箱培養(yǎng) 24 h。

棄掉培養(yǎng)基，重懸各組細(xì)胞，采用成分為 100 ng / ml RANKL、10% 胎牛血清、50 ng / ml M-CSF、100 U / ml 青鏈霉素的 α-MEM 培養(yǎng)基誘導(dǎo)破骨細(xì)胞分化。接種于 24 孔板及 6 孔板上，約 2×105個(gè)細(xì)胞 / ml 培養(yǎng)基，隔天更換培養(yǎng)基，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 6 天。

七、細(xì)胞 TRAP 染色及計(jì)數(shù)

培養(yǎng)完成后取出 24 孔板，棄去培養(yǎng)基，PBS 沖洗 2 次，4% 多聚甲醛固定，而后去離子水沖洗 3 遍，按照試劑說(shuō)明染色，顯微鏡下觀察，并計(jì)數(shù)染色陽(yáng)性破骨細(xì)胞數(shù)量。

八、Western-blot 技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中核因子 κB ( nuclear factor kappa-B，NF-κB ) p65 蛋白表達(dá)

培養(yǎng)完成后取出 6 孔板，按照蛋白提取試劑盒使用說(shuō)明分別提取細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核蛋白，采用 Western-blot 技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中 NF-κB p65 蛋白水平，使用 Image J 1.8 軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行灰度 分析。

九、Western-blot 技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞 LC3、mTOR、AMPK、pAMPK 表達(dá)水平

培養(yǎng)完成后取出 6 孔板，棄去培養(yǎng)基，PBS 沖洗 2 次，加入 RIPA 裂解液 ( 100 μl / 孔 )，冰上裂解 30 min，12 000 rpm，4 ℃ 離心 5 min，取上清，采用 Western-blot 技術(shù)檢測(cè) LC3、mTOR、AMPK、pAMPK 表達(dá)，使用 ImageJ 1.8 軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行灰度分析。

十、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用 SPSS 23.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以x-±s表示，采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)方差分析 ( ANOVA )，多個(gè)樣本均數(shù)間兩兩比較采用 LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、Rb2 對(duì)血清 TRAP、CTX-1 的影響

去勢(shì)組 ( OVX，ovariectomized group ) 小鼠血清破骨分化特異性指標(biāo) TRAP ( 64.10±1.18 ) pg / ml、CTX-1 ( 70.43±1.71 ) ng / ml 濃度最高 ( 表 1 )，隨著 Rb2 濃度升高，低劑量組 [ OVX＋Rb2 ( 5 ) ]、高劑量組 [ OVX＋Rb2 ( 20 ) ] 血清濃度有不同程度降低，假手術(shù)組 ( Sham，sham operation group ) 血清濃度最低，各組P＜0.01，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 ( 圖 1 )。

二、Rb2 對(duì)破骨細(xì)胞的影響

通過(guò)股骨遠(yuǎn)端 TRAP 染色 ( 圖 2 ) 可以看出，破骨細(xì)胞被染成橘紅色，去勢(shì)組 TRAP 染色陽(yáng)性細(xì)胞最為密集，陽(yáng)性區(qū)域面積最大 ( 圖 2a )，高劑量組陽(yáng)性染色區(qū)域較之減小，染色陽(yáng)性細(xì)胞密度降低 ( 圖 2d )，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05 )。低劑量組則介于兩者中間。原代破骨細(xì)胞 TRAP 染色結(jié)果如圖 3 所示，分化成熟的破骨細(xì)胞含多個(gè)細(xì)胞核，胞質(zhì)呈粉紅色，去勢(shì)組分化成熟破骨細(xì)胞數(shù)量最多 ( 152.00±18.55 / 孔 )，而與之相比，低劑量組 ( 118.40±18.46 / 孔 ) 和高劑量組 ( 99.60±13.89 / 孔 ) 細(xì)胞數(shù)量都有不同程度的減少 (P＜0.01 )，假手術(shù)組染色陽(yáng)性細(xì)胞最少 ( 84.00±15.23 / 孔 )，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.01 ) ( 圖 4 )。

表 1 血清 TRAP 及 CTX-1 濃度Tab.1 Serum TRAP and CTX-1

圖 1 血清 TRAP 及 CTX-1 濃度。與 OVX 相比，**P ＜ 0.01F O i V g.X1 , **S P e ＜ru 0m.0 T 1RAP and CTX-1 concentrations. Compared with the

圖 2 股骨遠(yuǎn)端 TRAP 免疫組織化學(xué)染色 ( × 40 ) a：假手術(shù)組；b：去勢(shì)組；c：低劑量組；d：高劑量組Fig.2 Immunohistochemical staining of TRAP at the distal femur ( × 40 ) a: Sham operation group; b: Ovariectomized group; c: Low-dose group; d: High-dose group

圖 3 原代破骨細(xì)胞 TRAP 免疫組織化學(xué)染色 ( × 40 ) a：假手術(shù)組；b：去勢(shì)組；c：低劑量組；d：高劑量組Fig.3 Immunohistochemical staining of TRAP of primary osteoclasts ( × 40 ) a: Sham operation group; b: Ovariectomized group; c: Low-dose group; d: High-dose group

三、Rb2 對(duì) NF-κB 的影響

Western-blot 檢測(cè)原代破骨細(xì)胞 NF-κB 表達(dá)，細(xì)胞質(zhì)蛋白以 β-actin 為標(biāo)準(zhǔn)化內(nèi)參，細(xì)胞核蛋白以 Lamin B 為標(biāo)準(zhǔn)化內(nèi)參?？梢?jiàn)與去勢(shì)組相比，隨著 Rb2 劑量增加，細(xì)胞質(zhì)中 NF-κB p65 蛋白增加 (P＜0.05 ) ( 圖 5a、b )，而細(xì)胞核中 NF-κB p65 蛋白減少 (P＜0.01 ) ( 圖 6a、b )，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

四、Rb2 對(duì) LC3 及 mTOR 信號(hào)分子的影響

Western-blot 檢測(cè)原代破骨細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白表達(dá)水平，以 β-actin 為標(biāo)準(zhǔn)化內(nèi)參，可見(jiàn)與去勢(shì)組相比，隨著 Rb2 濃度增加，mTOR 蛋白其表達(dá)逐漸減少，P＜0.01；AMPK，pAMPK 表達(dá)增加 ( 圖 7a、b )，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05 )；隨著 Rb2 濃度增加，LC3 II / LC3 I 比值增大 ( 圖 8a、b )，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05 )。

圖 4 TRAP 陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)。與 OVX 相比，**P ＜ 0.01Fig.4 TRAP positive staining count. Compared with the OVX, **P ＜ 0.01

圖 5 各組細(xì)胞質(zhì) NF-κB 的 Western-blot 結(jié)果。與 OVX 相比， **P ＜ 0.01Fig.5 Western-blot results of cytoplasmic NF-κB of each group. Compared with the OVX, **P ＜ 0.01

討 論

在正常人體中，成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞保持動(dòng)態(tài)平衡，而對(duì)于骨質(zhì)疏松的患者這種平衡被打破，成骨減弱或正常，破骨增殖分化活躍，進(jìn)而導(dǎo)致骨質(zhì)吸收和破壞[10]。因此，抑制破骨細(xì)胞的增殖可能成為骨質(zhì)疏松預(yù)防和治療的一個(gè)靶點(diǎn)。

圖 6 各組細(xì)胞核 NF-κB 的 Western-blot 結(jié)果。與 OVX 相比， **P ＜ 0.01Fi g.6 West ern-bl ot resul t s of nucl ear NF-κB of each group. Compared with the OVX, **P ＜ 0.01

圖 7 各組 mTOR 的 Western-blot 結(jié)果。與 OVX 相比，**P ＜ 0.01Fig.7 Western-blot results of mTOR of each group. Compared with the OVX, **P ＜ 0.01

姚曼等[11]、方秀統(tǒng)等[12]發(fā)現(xiàn)，人參皂苷能夠促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖分化，促進(jìn)骨形成。Cheng 等[13]研究表明，人參皂苷 Rb1 能夠通過(guò)調(diào)控 NF-κB 抑制破骨細(xì)胞活化。尹利明等[14]研究發(fā)現(xiàn)，人參皂苷可通過(guò)提高 RUNX2 蛋白表達(dá)水平來(lái)促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化。而人參皂苷 Rb2 是人參中發(fā)現(xiàn)的最大量皂苷成分，本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，人參皂苷 Rb2 能夠保護(hù)成骨細(xì)胞和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，促進(jìn)成骨，在體外也能通過(guò)自噬抑制破骨細(xì)胞活動(dòng)，但其在體內(nèi)是否能同樣發(fā)揮抑制破骨細(xì)胞的作用仍有待研究。本試驗(yàn)通過(guò)建立小鼠去卵巢骨質(zhì)疏松模型發(fā)現(xiàn)，人參皂苷 Rb2 可以降低血清破骨分化標(biāo)志物 TRAP、CTX-1 水平，同時(shí)骨組織 TRAP 免疫組織化學(xué)染色和原代破骨細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果表明，隨著 Rb2 濃度增加，破骨細(xì)胞數(shù)量減少，說(shuō)明 Rb2 能夠在體內(nèi)抑制破骨細(xì)胞。

圖 8 各組 LC3 的 Western-blot 結(jié)果。與 OVX 相比，**P ＜ 0.01Fig.8 Western-blot results of LC3 of each group. Compared with the OVX, **P ＜ 0.01

NF-κB 是細(xì)胞內(nèi)最重要的核轉(zhuǎn)錄因子，在調(diào)控破骨細(xì)胞分化中具有重要作用[15]，也是抑制破骨分化的治療靶點(diǎn)[16]。在靜息細(xì)胞中，NF-κB 二聚體與其抑制蛋白 lκB 結(jié)合分散在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，而激活后的 NF-κB 進(jìn)入細(xì)胞核，與 DNA 模塊上的特異蛋白結(jié)合，誘導(dǎo)特異 mRNA 的產(chǎn)生，最后轉(zhuǎn)錄、生成和釋放各種細(xì)胞因子[17]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)提取原代破骨細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中的蛋白進(jìn)行 Western-blot 檢測(cè)，可以看出，與去勢(shì)組相比，Rb2 干預(yù)組和假手術(shù)組細(xì)胞質(zhì)中的 NF-κB 蛋白逐漸增加，而細(xì)胞核中逐漸減少，說(shuō)明 Rb2 是 NF-κB 的抑制劑，并且其在體內(nèi)抑制破骨細(xì)胞分化與下調(diào) NF-κB 活性相關(guān)。

有研究表明自噬能夠調(diào)節(jié)破骨、成骨細(xì)胞功能，進(jìn)而影響骨量平衡[18-19]。當(dāng)自噬激活時(shí)，LC3 II作為自噬泡膜的組成部分大量生成，而 LC3 II 是由 LC3 I 轉(zhuǎn)化而來(lái)，因此 LC3 II / LC3 I 比值是自噬活化較為直觀的體現(xiàn)。通過(guò)提取原代破骨細(xì)胞蛋白，行 Western-blot 檢測(cè)可以看出，LC3 II / LC3 I 比值隨著 Rb2 濃度增加而升高，說(shuō)明經(jīng)過(guò) Rb2 干預(yù)，破骨細(xì)胞自噬增強(qiáng)，數(shù)量減少，表明 Rb2 通過(guò)調(diào)節(jié)自噬抑制其分化。而 AMPK-mTOR 途徑調(diào)控細(xì)胞能量與細(xì)胞自噬關(guān)系密切，在自噬調(diào)控中發(fā)揮著重要作 用[20]。S1P ( 1-磷酸鞘氨酸 ) 通過(guò)破骨細(xì)胞上的 S1PR ( 1-磷酸鞘氨酸受體 )，調(diào)節(jié) mTOR 表達(dá)，m TOR 進(jìn)而負(fù)性調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞凋亡[21]。本實(shí)驗(yàn)中通過(guò) Western-blot 檢測(cè)原代破骨細(xì)胞 mTOR 表達(dá)，隨著 Rb2 濃度增加 mTOR 蛋白表達(dá)減少，說(shuō)明 Rb2 通過(guò)抑制 mTOR 信號(hào)通路，激活破骨細(xì)胞自噬。

綜上所述，人參皂苷 Rb2 在體內(nèi)可能通過(guò)下調(diào) NF-κB 活性以及通過(guò)抑制 mTOR 信號(hào)通路激活自噬，從而抑制破骨細(xì)胞，調(diào)節(jié)其活動(dòng)。但通過(guò) NF-κB 具體調(diào)控細(xì)節(jié)以及自噬通路是否為 Rb2 體內(nèi)抑制破骨細(xì)胞的主要機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。