漢族、哈薩克族濕熱痹阻證類風濕關(guān)節(jié)炎患者Wnt信號通路的研究

陳慕芝 王璞玉 照日格圖

【摘 要】目的：檢測漢族、哈薩克族濕熱痹阻證類風濕關(guān)節(jié)炎患者Wnt信號通路基因，以期發(fā)現(xiàn)不同民族類風濕關(guān)節(jié)炎患者在Wnt信號通路上的表現(xiàn)機制是否存在差異，為進一步研究類風濕關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機制及臨床治療提供理論依據(jù)。方法：運用PCR Array技術(shù)對4例哈薩克族和4例漢族濕熱痹阻證類風濕關(guān)節(jié)炎患者的Wnt基因進行檢測，篩選出表達差異有統(tǒng)計學意義且與類風濕關(guān)節(jié)炎發(fā)病相關(guān)的基因，再選取哈薩克族（試驗組）與漢族（對照組）濕熱痹阻證類風濕關(guān)節(jié)炎患者，每組30例，應用實時熒光定量PCR技術(shù)對其外周血進行檢測，進一步驗證所篩選出的Wnt基因表達差異。結(jié)果：試驗組與對照組相比，有21個Wnt基因表達差異有統(tǒng)計學意義（差異倍數(shù) > 2，P < 0.05）。從中選出FZD9、MMP7、Wnt8A、Wnt1和Axin2基因，用實時熒光定量PCR技術(shù)進一步驗證，發(fā)現(xiàn)這5個基因在試驗組中均呈現(xiàn)高表達，2組間Wnt8A、Axin2和Wnt1比較，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）。結(jié)論：哈薩克族與漢族濕熱痹阻證類風濕關(guān)節(jié)炎患者相比，Wnt8A、Axin2和Wnt1基因存在顯著差異，且呈正向倍數(shù)變化，這些基因的異常表達可能與哈薩克族類風濕關(guān)節(jié)炎患者發(fā)病特點有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】 關(guān)節(jié)炎，類風濕;濕熱痹阻證;Wnt信號通路;漢族;哈薩克族

【ABSTRACT】Objective：To detect Wnt signaling pathway gene in patients with rheumatoid arthritis of dampness-heat-bi-obstruction syndrome among the Han and Kazak nationalities，in order to find out whether there are differences in theexpression mechanism of Wnt signaling pathway among different nationalities，and provide theoretical basis for further research onthepathogenesis and clinical treatment of rheumatoid arthritis.Methods：PCR Array technology was used to detect the Wnt geneof four Kazak patients and four Han patients with rheumatoid arthritis of dampness-heat-bi-obstruction syndrome .Another sixty patients（thirty of each nationality）were selected as the experiment group（Kazak）and the control group（Han），and their peripheral blood was detected by real-time fluorescence quantitative PCR to further verify the expression difference of the screened Wnt gene.Results：Compared with the control group，the expression of twenty-one Wnt genes in the experiment group was significantly different（difference multiple > 2，P < 0.05）.Five genes，i.e.FZD9，MMP7，WNT8A，WNT1 and AXIN2 were selected and further verified by real-time fluorescence quantitative PCR.It was found that these five genes were highly expressed in the experiment group.There were statistically significant differences between the two groups in WNT8A，AXIN2and WNT1（P < 0.05）.Conclusion：There are signifi-cant differences in WNT8A，AXIN2and WNT1 genes between Kazak and Han patients with rheumatoid arthritis of dampness-heat-bi-obstruction syndrome，and the abnormal expression of these genes may be related to the pathogenesis of Kazak patients with rheumatoid arthritis.

【Keywords】arthritis，rheumatoid;dampness-heat-bi-obstruction syndrome;Wnt signaling pathway;Han nationnality;Kazak

類風濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種慢性自身免疫性疾病，主要侵犯全身多關(guān)節(jié)，臨床表現(xiàn)為慢性、對稱性多關(guān)節(jié)的腫脹、疼痛，嚴重者可導致關(guān)節(jié)畸形以及功能的喪失[1]。其基本病理改變?yōu)殛P(guān)節(jié)的滑膜炎、血管翳的形成，進而導致關(guān)節(jié)骨及軟骨的破壞，嚴重影響患者正常生活[2]。我國RA發(fā)病率約為0.4%，發(fā)病年齡20～45歲，女性更為常見[3]。RA屬中醫(yī)學“痹證”范疇，課題組前期對新疆哈薩克族RA患者臨床資料分析發(fā)現(xiàn)，與漢族相比，哈薩克族RA患者中醫(yī)證型以濕熱痹阻證多見，且疾病活動度較高，病情表現(xiàn)較重，更易出現(xiàn)免疫功能紊亂[4]。

RA的病因較復雜，一般認為是在遺傳易感性的基礎(chǔ)上，受性激素、環(huán)境、社會、生理、心理等因素相互作用，機體免疫功能紊亂，而引起的慢性炎癥[5]。成纖維樣滑膜細胞（FLS）、細胞因子、趨化因子和生長因子的分泌增加在其發(fā)病中起重要作用[6]。研究表明，Wnt信號轉(zhuǎn)導途徑不恰當激活與RA的發(fā)病密切相關(guān)[7]。因此，對Wnt信號通路的深入研究，不僅有助于進一步了解RA的發(fā)病機制，還能為研究治療RA的藥物提供新的思路。在此基礎(chǔ)上，筆者運用PCR Array技術(shù)檢測漢族、哈薩克族濕熱痹阻證RA患者Wnt信號通路基因，以期發(fā)現(xiàn)不同民族RA患者在Wnt信號通路上的表現(xiàn)機制是否存在差異，為進一步研究RA的發(fā)病機制及臨床治療提供理論依據(jù)。

1 臨床資料

1.1 一般資料 選取2017年6月至2018年6月在新疆醫(yī)科大學附屬中醫(yī)醫(yī)院風濕科住院的患者。首先選取4例哈薩克族（男2例、女2例）和4例漢族（男2例、女2例）濕熱痹阻證RA患者，用PCR Array技術(shù)對Wnt基因進行檢測，篩選出表達差異有統(tǒng)計學意義且與RA發(fā)病相關(guān)的基因，再選取哈薩克族與漢族濕熱痹阻證RA患者各30例，用實時熒光定量PCR對其外周血進行檢測，進一步驗證所篩選出的Wnt基因表達差異。30例哈薩克族濕熱痹阻證RA患者設定為試驗組，男10例，女20例;年齡22～75歲，平均（48.80±11.21）歲。30例漢族濕熱痹阻證RA患者設定為對照組，男6例，女24例;年齡30～75歲，平均（53.97±12.25）歲。2組患者在性別、年齡等方面比較，差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05），具有可比性。本研究經(jīng)新疆醫(yī)科大學附屬中醫(yī)醫(yī)院倫理委員會審批（批號2016XE0129-1）。

1.2 診斷標準

1.2.1 西醫(yī)診斷標準 按照2010年美國風濕病學會（ACR）/歐洲抗風濕病聯(lián)盟（EULAR）制定的RA分類標準[8]。

1.2.2 中醫(yī)證型標準 按照《實用中醫(yī)風濕病學》[9]中濕熱痹阻證的診斷標準。

1.3 納入標準 ①符合上述西醫(yī)診斷標準和中醫(yī)證型標準;②年齡18～75歲;③患者知情同意。

1.4 排除標準 ①重疊其他風濕病者;②重度心肺功能不全者;③肝、腎、造血系統(tǒng)等嚴重原發(fā)性疾病者;④妊娠或哺乳期婦女;⑤精神病患者。

2 方 法

2.1 觀察項目 ①臨床癥狀及體征：關(guān)節(jié)疼痛視覺模擬評分法（VAS）評分、晨僵時間、疾病活動度評分（DAS28）、關(guān)節(jié)功能分級。②實驗室檢查指標：白細胞（WBC）、紅細胞（RBC）、血小板計數(shù)（PLT）、血紅蛋白（Hb）、球蛋白（GLB）、白蛋白（ALB）、堿性磷酸酶（ALP）、C-反應蛋白（CRP）、免疫球蛋白（IgA、IgG、IgM）、補體（C3、C4）、紅細胞沉降率（ESR）、抗環(huán)瓜氨酸肽抗體（抗CCP抗體）、抗角蛋白抗體（AKA）、類風濕因子（RF）、纖維蛋白原、D-二聚體（DD）、凝血酶原時間等。實驗室檢查項目均由本院檢驗科完成。

2.2 Wnt信號通路基因檢測

2.2.1 PCR Array實驗步驟 RNA的提取、反轉(zhuǎn)錄、PCR Array步驟均按照說明書進行，用核酸蛋白定量儀檢測RNA濃度、A260/A280，瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性。

2.2.2 熒光定量實驗（RT-PCR）步驟 提取RNA，進行純度檢測，用質(zhì)量分數(shù)為1.8%的瓊脂糖凝膠電泳，150 V，14 min，電泳完畢后使用凝膠成像儀觀察結(jié)果，RNA檢測均合格。熒光定量引物信息參照表1，PCR熱循環(huán)參數(shù)：95 ℃2 min，95 ℃ 5 s（40個循環(huán)），60 ℃30 s（40個循環(huán)），60 ℃延伸30 s。

2.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以表示，符合正態(tài)分布采用t檢驗，不符合正態(tài)分布采用秩和檢驗。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié) 果

3.1 Wnt信號通路差異基因結(jié)果

3.1.1 Wnt信號通路PCR Array結(jié)果 僅選取差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）的基因，結(jié)果見表2。

3.1.2 RT-PCR檢測結(jié)果 應用RT-PCR檢測PCR Array結(jié)果中篩選出的5個差異基因（FZD9、MMP-7、Wnt8A、Axin2、Wnt1）mRNA水平分析，結(jié)果表明，5個差異基因都呈現(xiàn)正向倍數(shù)變化;其中，2組間Wnt8A、Axin2、Wnt1比較，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）。見表3。

3.2 2組患者一般資料、臨床癥狀及體征比較2組患者在病程、VAS評分、關(guān)節(jié)晨僵時間、DAS28評分、關(guān)節(jié)功能分級等方面比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P > 0.05）。見表4。

3.3 2組患者實驗室指標比較 2組患者血常規(guī)中RBC、PLT、Hb水平比較，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）;2組ESR水平比較，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）;其余生化指標、免疫球蛋白水平、補體水平、凝血測定各項指標、CRP、抗CCP抗體，及AKA、RF陽性率比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P > 0.05）。見表5、表6。

4 討 論

本研究發(fā)現(xiàn)，2組患者RBC、PLT、Hb、ESR? 水平比較差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）。有研究表明，RA患者的RBC水平降低與炎癥、免疫等指標的升高具有相關(guān)性，WBC水平升高可作為RBC值降低的危險因素，參與RA的發(fā)病及病情活動[10]。PLT與RA患者晨僵時間、DAS28評分、VAS評分、ESR等指標均呈顯著正相關(guān)，PLT可作為RA疾病活動度的靈敏指標之一[11]。本研究結(jié)果提示，哈薩克族與漢族RA患者在病情活動性方面存在差異。

本研究發(fā)現(xiàn)，哈薩克族濕熱痹阻證RA組與漢族濕熱痹阻證RA組相比，F(xiàn)ZD9、MMP7、Wnt8A、Axin2、Wnt1這5個差異基因均呈現(xiàn)正向倍數(shù)變化，其中，Wnt8A、Axin2、Wnt1這3個基因差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05），且在哈薩克族濕熱痹阻證RA組中呈高表達。

Wnt信號通路由Wnt配體蛋白、細胞膜上相應的受體、胞內(nèi)信號傳導部分和細胞核內(nèi)的核轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子構(gòu)成，可分為依賴β-連環(huán)蛋白（β-caternin）的經(jīng)典Wnt信號途徑和不依賴β-caternin的非經(jīng)典Wnt信號途徑。Wnt配體蛋白家族可以分為Wnt1類和Wnt5a類，Wnt1類蛋白包括Wnt1、Wnt3、Wnt3a、Wnt7a、Wnt8a、Wnt8b;Wnt5a類蛋白有Wnt2、Wnt4、Wnt5a、Wnt5b、Wnt7b和Wnt11[12]。其中，Wnt1、Wnt8a/b和Wnt10a等能激活經(jīng)典途徑[13]。研究發(fā)現(xiàn)，Wnt信號通路的激活有助于RA中FLS的活化，增加的Wnt1等可誘導白細胞介素（IL）-1、IL-6和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等促炎細胞因子和MMP3的產(chǎn)生，導致炎癥的發(fā)生[14]。

Axin2是經(jīng)典Wnt信號通路的負調(diào)節(jié)因子，通過與APC、CKIα、GSK-3β結(jié)合形成的復合物，使β-caternin磷酸化被降解，從而抑制Wnt信號通路。在正常細胞中β-catenin處于較低的水平，以保證關(guān)節(jié)軟骨細胞正常增殖、分化和凋亡[15]。若β-catenin水平過高，會促進軟骨細胞過度增殖分化，引起骨贅的形成;β-catenin水平過低，會抑制軟骨細胞的增殖分化，導致骨質(zhì)疏松的發(fā)生，因此，調(diào)控Axin水平可以間接控制軟骨細胞的生長水平[16]。

Wnt信號通過卷曲蛋白（frizzled，F(xiàn)rz）家族轉(zhuǎn)導，F(xiàn)rizzled家族包括10個跨膜受體和單跨膜共受體啟動典型和非典型信號級聯(lián)[17-18]。FZD蛋白家族是含有7次跨膜結(jié)構(gòu)域的Wnt信號通路受體，負責識別和固定Wnt蛋白，并將信息傳遞到細胞膜內(nèi)[19]。研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ZD9能通過非經(jīng)典Wnt信號途徑正向調(diào)節(jié)骨重塑，在骨折愈合期能正向調(diào)節(jié)骨修復[20]。

基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）家族是一類依賴金屬鋅離子的蛋白水解酶家族，對細胞外基質(zhì)（ECM）的降解、組織重建以及細胞內(nèi)多種可溶性因子的調(diào)控起重要作用。在正常生理狀態(tài)下，MMP與組織金屬蛋白酶抑制劑（TIMP）共同調(diào)控ECM的更新，維持細胞的穩(wěn)定性。MMP-7是Wnt信號通路的下游靶基因之一，參與細胞增生與凋亡等過程。MMP廣泛存在于結(jié)締組織中，對ECM的生理病理作用起調(diào)節(jié)作用。正常生理情況下，軟骨細胞產(chǎn)生的MMP和金屬蛋白酶組織抑制劑（TIMPs）保持相對平衡，維持了關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)的合成降解平衡，保證了關(guān)節(jié)軟骨的正常[21]。當滑膜發(fā)生炎癥時，MMP的量或者活性增加，MMP能直接參與骨與軟骨的降解，促進血管的生成，微血管基底膜及間質(zhì)成分降解，最終導致關(guān)節(jié)軟骨的破壞。

非經(jīng)典Wnt信號途徑能誘導產(chǎn)生炎性因子，促進骨質(zhì)破壞，Wnt5通過活化FLS促使RA患者體內(nèi)產(chǎn)生更多的炎癥趨化因子[22]。移除關(guān)節(jié)滑液中的Wnt7B時，IL-6、TNF-α等炎性因子表達減少，導入Wnt7B時，相關(guān)炎性因子表達增多，進而加重RA病情[23]。李里等[24]通過Wnt信號通路對RA大鼠炎性因子的影響研究發(fā)現(xiàn)，炎性因子在RA發(fā)病中呈高表達，阻斷Wnt信號通路可顯著抑制炎性因子。Wnt信號通路的異常激活可能導致炎性因子高表達，進而加重RA病情。

綜上所述，漢族、哈薩克族濕熱痹阻證RA患者外周血Wnt信號通路中差異表達基因主要有FZD9、MMP7、Wnt8A、Axin2、Wnt15種，其中Wnt8A、Axin2和Wnt1基因存在顯著性差異，且在哈薩克族RA組中均呈高表達，考慮這些基因的異常表達可能與哈薩克族濕熱痹阻證RA患者疾病特點有關(guān)。與漢族RA患者相比，哈薩克族RA患者可能由于Wnt基因過表達，更易導致Wnt信號通路的異常激活，誘導多種炎癥細胞因子的產(chǎn)生，加重了哈薩克族RA患者炎癥表現(xiàn)，使MMP表達量增高，促進血管翳的生成，進而加重關(guān)節(jié)軟骨的破壞，加重患者病情。

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收稿日期：2019-11-12;修回日期：2020-01-17