分子生物學(xué)方法在結(jié)核分枝桿菌及其耐藥性檢測中的價值

陳妍汶，楊 勇，陳俊莉，羅 軍，莊利東

結(jié)核病是全球范圍內(nèi)普遍關(guān)注的疾病和健康問題，據(jù)最新的世界防治結(jié)核病日統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，結(jié)核病已成為最致命的傳染疾病，全世界范圍內(nèi)每年新增結(jié)核病病人約800萬，自2016年以來因該病死亡病人約170萬[1-2]。近年來，受傳播途徑未得到有效遏制、結(jié)核菌抗體產(chǎn)生等原因?qū)е掳l(fā)病率有回升態(tài)勢，準(zhǔn)確、快速診斷結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)感染，明確其耐藥情況對病人病情控制意義重大。Xpert MTB/RIF法和基因芯片法是近年來出現(xiàn)的以核酸為靶標(biāo)的分子生物學(xué)診斷方法，兩種方法均具有檢測時間短的優(yōu)點，但存在費用較高及假陽性等不足。LEE等[3-4]國內(nèi)外學(xué)者均證實這兩種方法在鑒別MTB及其耐藥性中具有很高的特異度和敏感度。但分子生物學(xué)檢測與改良羅氏培養(yǎng)法、比例法等檢測方法在MTB鑒別、耐藥性分析中是否存在明顯優(yōu)勢目前尚無明確定論，本文對幾種檢測方法的優(yōu)劣性進(jìn)行比較。

1 材料與方法

1.1 菌株 MTB標(biāo)準(zhǔn)菌株H37Rν(ATCC27294)、已知耐藥譜的MTB臨床分離株均由國家結(jié)核病防控中心實驗室提供。

1.2 儀器和試劑 晶芯?結(jié)核分枝桿菌菌種鑒定、耐藥性基因檢測試劑盒購于北京博奧生物有限公司；Xpert MTB/RIF分子檢測試劑盒購于美國Cepheid公司；比例法藥敏培養(yǎng)基、中性羅氏培養(yǎng)基均為自制。SorvallTMLYNX 高速離心機(jī)和GeneXpert實時熒光檢測儀(美國Thermo Fisher Scientific公司)；博奧生物L(fēng)uxScan 10K-B微陣列芯片掃描儀、恒溫雜交箱(北京博奧生物有限公司)；Bioer TC-XP PCR擴(kuò)增儀(杭州博日科技公司)；TwinCubator 雜交儀(法國Mérieux公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 菌株擴(kuò)增 分別從生物樣本庫中取標(biāo)準(zhǔn)菌株H37Rν、敏感、耐鏈霉素菌株、耐多藥(multi-drug resistance，MDR)的MTB凍存菌液接種于中性培養(yǎng)基中，在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4周。

1.3.2 實驗標(biāo)本準(zhǔn)備 使用無菌接種環(huán)分別刮取培養(yǎng)基斜面上的MDR、耐鏈霉素、敏感和標(biāo)準(zhǔn)菌株H37Rν，盡量刮取多處的菌落置于含有玻璃珠的磨菌瓶中，擰緊瓶蓋并在渦旋振蕩器上混旋30～60 s，加入密封的PBS緩沖液，使其渾濁度和標(biāo)準(zhǔn)麥?zhǔn)瞎芤恢?，獲得1 mg/mL的菌液(即1個麥?zhǔn)蠞岫?。再將菌液稀釋1倍(近似濃度為3×108cfu/mL)、102倍(3×106cfu/mL)、104倍(3×104cfu/mL)、106倍(3×102cfu/mL)、108倍(3×100cfu/mL)，不含菌落的PBS(菌濃度=0)為陰性對照組，然后進(jìn)行以下實驗，每組實驗均重復(fù)4次。

1.3.3 羅氏固體培養(yǎng) 嚴(yán)格參照《結(jié)核病診斷細(xì)菌學(xué)檢驗規(guī)程》[5]中的標(biāo)準(zhǔn)和步驟開展比例法藥敏實驗和改良羅氏培養(yǎng)檢測。(1)比例法：將標(biāo)準(zhǔn)菌株H37Rν、敏感等4類MTB的5個濃度梯度菌懸液，使用22SWG標(biāo)準(zhǔn)接種環(huán)蘸取1環(huán)(0.01 mL)菌液，分別接種到硝基苯甲酸培養(yǎng)基(PNB)和噻吩-2-羧酸肼培養(yǎng)基(TCH)表面，菌液盡量均勻分在在培養(yǎng)基斜面，使用恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)5周，每間隔3 d記錄每個培養(yǎng)基中菌落生長情況，詳細(xì)記錄時間。(2)改良羅氏培養(yǎng)法，除TCH更換為中性羅氏培養(yǎng)基外，其他同比例法。

1.3.4 基因芯片法 樣品制備：經(jīng)處理好的上述4種菌類樣品置于核酸提取儀中提取核酸，將其進(jìn)行PCR擴(kuò)增；獲得的基因擴(kuò)增產(chǎn)物置于基因檢測試劑盒進(jìn)行芯片反應(yīng)，再將雜交芯片洗干；將其置于芯片掃描儀中對基因耐藥性進(jìn)行判讀。

1.3.5 Xpert MTB/RIF法 取1 mL上述4種菌類樣本，按1∶2的體積比加入約2 mL樣品處理液，充分振蕩20 s，室溫放置15 min，抽取2 mL處理好的樣品進(jìn)行檢測。

2 結(jié)果

2.1 4種檢測方法的檢測周期 Xpert MTB/RIF法檢測周期最短(1.6～2 h)，基因芯片法次之(6～8 h)，改良羅氏培養(yǎng)法和比例法檢測周期相近(分別為35～40 d和32～45 d)。

2.2 改良羅氏培養(yǎng)檢測MTB菌落數(shù) 4種菌在3×102cfu/mL或以上濃度菌懸液在中性羅氏菌培養(yǎng)基、TCH均有菌落生長，但中性羅氏培養(yǎng)基菌落數(shù)量明顯多于TCH，說明羅氏培養(yǎng)基最低檢出限為3×102cfu/mL。中性羅氏培養(yǎng)基菌落數(shù)量與稀釋濃度的增加呈增多趨勢(見表1)，其與培養(yǎng)時間的關(guān)系見圖1。

表1 改良羅氏培養(yǎng)檢測MTB菌落數(shù)(cfu)

2.3 基因芯片法檢測結(jié)果 3×104cfu/mL濃度以下未檢測出MTB，≥3×104cfu/mL菌濃度基因芯片均檢出MTB，并且可檢出異煙肼(INH)、利福平(RFP)的耐藥性(見表2)。

2.4 Xpert MTB/RIF法檢測結(jié)果 該方法能依據(jù)Ct值確定樣本帶菌數(shù)量，在3×102、3×104、3×106、3×108cfu/mL濃度菌含量的檢測結(jié)果依次為“極低”“低”“中”“中”。該結(jié)果與相應(yīng)濃度菌懸液含菌數(shù)量完全一致。在3×102cfu濃度時Xpert MTB/RIF法檢測RFP耐藥性時有假陽性現(xiàn)象(見表3)。

3 討論

結(jié)核病是由MTB引起的一種常見傳染病，自上世紀(jì)90年代以來，多重耐藥性結(jié)核病在全世界范圍內(nèi)多次爆發(fā)，引起了人們的普遍關(guān)注[6-8]。結(jié)核病具有治療周期長、治愈難度大且死亡率高的特點，目前已成為全世界公共衛(wèi)生難題。在結(jié)核病的治療中明確MTB的耐藥情況可提升用藥的準(zhǔn)確性，近幾年國內(nèi)外大量學(xué)者[9-10]從遺傳學(xué)領(lǐng)域嘗試闡明MTB耐藥性產(chǎn)生的機(jī)制，取得了突破性進(jìn)展。分子生物學(xué)技術(shù)是近年來用來檢測鑒別MTB及其耐藥性的主要手段，DNA直接測序法、DNA微陣列芯片法、Xpert MTB/RIF法等都是基于基因型的檢測手段，具有檢測時間短、操作簡單等優(yōu)勢，而培養(yǎng)法和藥敏實驗平均檢測周期在34 d左右，在時效性方面不能滿足臨床需求。

表2 基因芯片法對MTB及其耐藥性檢測結(jié)果

Y示可鑒別出MTB；y示耐INH和RFP；N示不耐INH、RFP

表3 Xpert MTB/RIF法鑒別MTB和RFP耐藥性結(jié)果

N示不耐RFP；Y示有耐藥性

本文比較了基因芯片法、Xpert MTB/RIF法兩種分子生物學(xué)方法和改良羅氏培養(yǎng)法、比例法兩種傳統(tǒng)培養(yǎng)法在鑒別MTB和RFP、INH耐藥性情況。在檢測周期方面，Xpert MTB/RIF法耗時最短，基因芯片法次之，改良羅氏培養(yǎng)法和比例法最長，時間跨度在5～8周[11]。在MTB鑒別方面，Xpert MTB/RIF法和改良羅氏培養(yǎng)法的MTB最低檢出限均為3×102cfu/mL，較基因芯片法(3×104cfu/mL)更優(yōu)，提示Xpert MTB/RIF法對MTB檢測的敏感度高于基因芯片法。MTB耐藥性檢測是結(jié)核病病人治療前的重要步驟，也是指導(dǎo)醫(yī)師臨床用藥的關(guān)鍵。雖然Xpert MTB/RIF法較改良羅氏培養(yǎng)法能更快獲得結(jié)果，較其他分子生物學(xué)技術(shù)檢出限更寬，但國外有學(xué)者[12]發(fā)現(xiàn)其在結(jié)核病常用藥RFP耐藥性檢測中有假陽性情況，其假陽性率高達(dá)33.3%。張瑞雪[13]對結(jié)核性腦膜炎病人進(jìn)行GeneXpert MTB/RIF耐藥性檢測中發(fā)現(xiàn)1例假陽性情況。本研究中Xpert MTB/RIF法在3×102cfu/mL時RFP耐藥性檢測中也有假陽性情況，而濃度在3×104cfu/mL及以上RFP耐藥性無假陽性出現(xiàn)。提示當(dāng)MTB含量在3×104cfu/mL以下時其鑒別和耐藥性檢測結(jié)果沒有可信度，必須結(jié)合其他檢測手段綜合判斷，從而為臨床治療提供指導(dǎo)。Xpert MTB/RIF法的缺點是無法檢測INH的耐藥性，這與黃少君[14-15]等研究結(jié)果吻合。

分子生物學(xué)技術(shù)在MTB鑒別和耐藥性檢測方面有明顯的優(yōu)勢，相信隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷成熟其在結(jié)核病診治方面會取得關(guān)鍵性突破。本研究中，相較于傳統(tǒng)的培養(yǎng)法和比例法，基因芯片法有檢出限窄的劣勢，在RFP等常用抗結(jié)核菌耐藥性檢測方面Xpert MTB/RIF法存在假陽性的情況，但是分子生物學(xué)技術(shù)檢測周期較短，能夠為危重結(jié)核病病人治療提供指導(dǎo)。