上海市寶山區(qū)HPV基因分型的特征分析

劉靈燕，郭竹英，胡傳璽，耿朝暉，梅 虹，鐘政榮

宮頸癌是最常見的婦科惡性腫瘤，發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，且發(fā)病年齡逐漸年輕化。90%以上的宮頸癌病人都伴有高危人乳頭瘤病毒(human papilloma virus，HPV)持續(xù)感染。HPV是一類具有嚴(yán)格宿主范圍和組織特異性的病毒，主要感染人的皮膚或黏膜上皮細(xì)胞，引起感染部位發(fā)生病變。目前已知的HPV基因型有100多種，其中約40種與生殖道感染有關(guān)，且不同HPV亞型對(duì)宮頸上皮的致病性不同。根據(jù)HPV型別與宮頸癌發(fā)生危險(xiǎn)性的高低分為高危型HPV和低危型HPV。高危型HPV與宮頸癌及子宮上皮內(nèi)瘤變(CIN)相關(guān)，低危型HPV常引起生殖道疣等良性病變。本文采用流式熒光雜交法檢測(cè)7 709例女性宮頸脫落細(xì)胞HPV基因型，分析HPV感染的陽(yáng)性率和年齡段的關(guān)系及HPV亞型感染分布特點(diǎn)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2016年1月至2018年6月到我院婦科就診及體檢的女性7 709例為研究對(duì)象，年齡16～92歲。

1.2 儀器與試劑 HPV基因分型檢測(cè)試劑盒(流式熒光雜交法)由上海透景生命科技股份有限公司提供，本試劑盒可檢測(cè)27種HPV亞型，其中高危型包括HPV16、18、26、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68和82，低危型包括HPV6、11、40、42、43、44、55、61、81和83。Bioer Lift Express基因擴(kuò)增儀由杭州博日科技有限公司提供。Luminex 200型基因分析儀由美國(guó)路明克斯貿(mào)易有限公司提供。

1.3 研究方法

1.3.1 樣本采集 先用窺陰器暴露宮頸，再用配套宮頸刷輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)4～5圈，采集足量的上皮細(xì)胞樣本，然后放入專用細(xì)胞保存液中，貼好標(biāo)簽，送至檢驗(yàn)科檢測(cè)。

1.3.2 樣本處理 將樣品保存管在漩渦振蕩器上振蕩30 s，確保脫落細(xì)胞均勻懸浮，取200 μL樣品于1.5 mL離心管中，14 000 rpm離心3 min，小心吸棄上清。每管加入200 μL核酸提取試劑，振蕩混勻。瞬時(shí)離心后置于100 ℃金屬恒溫浴中15 min。然后14 000 rpm離心6 min，留取上清液備用。

1.3.3 PCR擴(kuò)增 按每個(gè)樣本引物混合液5 μL，PCR預(yù)混液10 μL和Taq酶0.8 μL將試劑分裝于PCR反應(yīng)管內(nèi)，然后加入5 μL核酸模板。將PCR反應(yīng)管置于基因擴(kuò)增儀中擴(kuò)增。擴(kuò)增條件為95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，5個(gè)循環(huán)；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 3 min。

1.3.4 基因雜交 先將22 μL微球雜交液加入微孔雜交板，然后加入3 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，并抽吸幾次加以混勻，封膜后，在PCR儀中95 ℃變性5 min，48 ℃ 30 min雜交，使探針-擴(kuò)增產(chǎn)物結(jié)合。每孔加入75 μL鏈霉親和素標(biāo)記的藻紅蛋白，吹打混勻，再次封膜，48 ℃孵育15 min。將微孔雜交板置Luminex 200多功能流式分析儀上進(jìn)行檢測(cè)。感染率=陽(yáng)性數(shù)/總調(diào)查例數(shù)×100%，檢出率=陽(yáng)性數(shù)/調(diào)查數(shù)×100%。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 HPV總體感染情況 7 709例送檢樣本中檢出陽(yáng)性1 237例，總陽(yáng)性率為16.05%，以高危型感染為主(見表1)。

表1 上海市寶山區(qū)HPV感染情況

2.2 HPV各亞型感染分布特征 感染率大于1%的亞型依次為HPV52、16、53、58、39、61，其中高危型主要是HPV52、16、53、58、39，前5位低危型主要是HPV61、43、55、81、6(見表2、3)。

表2 高危型HPV分布情況

表3 低危型HPV分布情況

2.3 各年齡段HPV亞型感染情況 HPV感染人群主要分布在41～50歲和31～40歲年齡組，各年齡組感染率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=24.24，P<0.01)(見表4)。

2.4 HPV單基因型和混合基因型感染情況 在1 237例HPV陽(yáng)性標(biāo)本中，以單基因型感染為主，雙重感染次之，少數(shù)人群存在多重感染(見表5)。

表4 各年齡組HPV感染情況

表5 HPV感染類型

3 討論

宮頸癌是一種由感染引起的惡性疾病，其發(fā)病與HPV感染的型別有關(guān)，持續(xù)性高危型HPV感染是主要危險(xiǎn)因素，也是引起宮頸癌前病變和宮頸癌的主要誘因[1]。因此，對(duì)女性群體進(jìn)行HPV篩查具有重要意義。

HPV基因型分布存在地區(qū)差異。在我國(guó)，北京地區(qū)主要以HPV52、58、16亞型為主[2]，天津地區(qū)主要以HPV16、56、58亞型為主[3]，武漢地區(qū)主要以HPV16、52、58亞型為主[4]，浙江地區(qū)則以HPV16、11、58和6亞型為主[5]，上海奉賢地區(qū)主HPV16、52、58亞型為主[6]。本研究結(jié)果顯示，受檢7 709例樣本中，感染率居前5位的是 HPV52、16、53、58、39亞型，與國(guó)內(nèi)報(bào)道的大部分區(qū)域基本相同[7-8]，同時(shí)也基本符合東亞地區(qū)HPV感染型別[9]。近年研究[10]發(fā)現(xiàn)，HPV基因型別分布也在隨時(shí)間而改變，HPV18從感染優(yōu)勢(shì)基因逐漸下降，可能與疫苗的接種有關(guān)，也可能與HPV18的較強(qiáng)致死性相關(guān)。有研究[11]表明，HPV18主要感染鱗柱交界處的柱狀上皮，因此較少發(fā)展為CINⅡ、Ⅲ，但具有發(fā)展為子宮頸腺癌和鱗狀細(xì)胞癌的雙向潛能。HPV18雖不常見，但致瘤性強(qiáng)，且HPV18感染疾病進(jìn)展快，轉(zhuǎn)移早，預(yù)后差[12]。有研究[13]表明，HPV18陽(yáng)性的子宮頸癌病人較HPV16陽(yáng)性者預(yù)后差。這就提示HPV疫苗的研發(fā)也要根據(jù)感染優(yōu)勢(shì)基因分布情況同步推進(jìn)。

本研究發(fā)現(xiàn)，在1 237例陽(yáng)性標(biāo)本中，HPV多為單基因型感染，占感染人數(shù)的77.44%，且以單一高危型為主，常見高危型依次為HPV52、16、53、58、39亞型；雙重感染者占感染人數(shù)的16.01%，多重感染者占感染人數(shù)的6.55%，最多檢測(cè)到6重感染。在二重及多重感染中，最常見HPV52型合并的感染，其次為HPV16或HPV53型。施啟豐等[14]研究發(fā)現(xiàn)，深圳地區(qū)二重及多重感染中，最常見HPV16型合并的感染，其次為HPV58和HPV52型，說明HPV混合基因型也存在地區(qū)差異。研究[15]表明，多重感染尤其是多重高危型感染會(huì)大大增加宮頸癌變風(fēng)險(xiǎn)，提示臨床上應(yīng)重視多重感染者，建議積極治療并嚴(yán)密追蹤隨訪，降低宮頸癌的發(fā)生。

各年齡段的HPV感染率有明顯差異，提示HPV的感染率與年齡有關(guān)。本研究中，HPV感染的高峰年齡段為41～50歲，這與鐘偉明[16]和方莉等[17]的研究結(jié)果一致，而李小歡等[18]則認(rèn)為21～25歲為HPV感染高峰期，可能由于選取的調(diào)查對(duì)象和區(qū)域不同等原因造成。另外，HPV感染受多種因素影響，過早性生活、多個(gè)性伴侶、多產(chǎn)、密產(chǎn)、早年分娩、流產(chǎn)等可增加病毒感染機(jī)會(huì)；生殖道其他微生物的感染(如單純皰疹病毒、淋菌等)導(dǎo)致生殖道黏膜受損，也會(huì)增加病毒感染機(jī)會(huì)；長(zhǎng)期口服激素類避孕藥、吸煙、飲酒等也會(huì)增加病毒侵襲機(jī)會(huì)。41～50歲年齡段正處于圍絕經(jīng)期，此時(shí)由于機(jī)體內(nèi)分泌紊亂而引起各器官尤其是卵巢功能失調(diào)、雌激素水平開始下降，機(jī)體對(duì)外界有害因素的抵抗力減低，從而易感染HPV。而21～25歲可能由于這一年齡段女性性生活比較活躍，在生理衛(wèi)生方面未給予充分重視等因素也會(huì)造成HPV感染率增高。提示我們應(yīng)加強(qiáng)圍絕經(jīng)期和年輕婦女的HPV篩查力度。

接種HPV疫苗是預(yù)防宮頸癌的有效手段，目前已經(jīng)上市的HPV預(yù)防性疫苗有2價(jià)、4價(jià)和9價(jià)疫苗，2價(jià)疫苗主要針對(duì)HPV16、18亞型，4價(jià)疫苗主要針對(duì)HPV16、18、6、11亞型，9價(jià)疫苗在4價(jià)疫苗基礎(chǔ)上增加了HPV31、33、45、52、58五種亞型。本研究發(fā)現(xiàn)，上海市寶山區(qū)感染率居前5位的高危型是HPV52、16、53、58、39，前5位低危型是HPV61、43、55、81、6，后期還需多地區(qū)大樣本研究來驗(yàn)證HPV感染的高危型別，為HPV疫苗的研發(fā)提供有力依據(jù)，以達(dá)到更好的預(yù)防效果。