抑制miR-31表達對人角質(zhì)形成細胞增殖、凋亡的影響研究

石 嫻，石 年

尖銳濕疣作為人乳頭狀瘤病毒(HPV)感染所致的皮膚黏膜增殖性疾病，主要發(fā)生在生殖器部位，嚴重威脅人類健康，尤其是高危型HPV引起的尖銳濕疣，會導致病人皮損角質(zhì)形成細胞的過度增殖，極大增加了進展為基底細胞癌或皮膚鱗癌的風險[1-2]。研究[3]表明，尖銳濕疣是一個多基因調(diào)控的復雜的發(fā)生及進展過程。微小RNA(micro RNA，miR)作為廣泛存在于生物體內(nèi)的高度保守短小RNA，在細胞增殖、分化、凋亡、免疫反應等多種生物學功能中發(fā)揮重要作用[4]。有研究[5]指出，尖銳濕疣病人皮損組織中miR-31表達異常，可能參與了其發(fā)生、進展過程。本研究擬利用反義寡核苷酸技術(shù)(antisense oligonueleotide，ASO)特異性抑制miR-31表達，觀察其對人角質(zhì)形成細胞系HaCaT細胞增殖、凋亡的影響，以期為臨床實踐提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器 人角質(zhì)形成細胞系HaCaT細胞購自江蘇凱基生物公司，RPMI-1640培養(yǎng)液(含10%胎牛血清)購自美國Gibico公司，青鏈霉素混合液購自碧云天生物公司，LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑購自美國Invitrogen公司，miR-31基因序列、miR-31 ASO和對照ASO、內(nèi)參引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司設(shè)計合成，Trizol總RNA提取試劑盒購自美國Invitrogen公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及PCR試劑盒購自寶生物公司，四甲基偶氮唑藍(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)均購自美國Sigma公司，Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒購自上海高創(chuàng)化學科技有限公司，Transwell小室和基底膠均購自美國Corning公司，BCA蛋白檢測試劑盒購自碧云天生物研究所，兔抗Rho相關(guān)結(jié)構(gòu)域BTB蛋白質(zhì)1(RhoBTB1)抗體購自江萊生物公司，ABI實時熒光定量PCR儀購自美國ABI公司，全自動酶標儀購自美國Bio-Rad公司，流式細胞儀購自美國BD公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 將HaCaT細胞培養(yǎng)于RPMI-1640培養(yǎng)液(含10%胎牛血清)中，于37 ℃、5%CO2條件下恒溫培養(yǎng)。細胞處理前24 h，將細胞接種于6孔板中，于細胞匯合度達到60%左右時，利用LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒對不同組細胞分別進行轉(zhuǎn)染。ASO組：轉(zhuǎn)染miR-31 ASO，序列：5′-AGC UAU GCC AGC AUC UUG CCU-3′；對照ASO組：轉(zhuǎn)染對照ASO，序列：5′-UUC UCC GAA CGU GUC ACG UTT-3′；空白對照組：轉(zhuǎn)染空白質(zhì)粒。

1.2.2 實時熒光定量PCR檢測不同轉(zhuǎn)染組細胞中miR-31表達 取轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48 h細胞，用細胞裂解液進行裂解后，用Trizol總RNA提取試劑盒提取細胞中總RNA，利用紫外分光光度計檢測樣品純度，取A260/A280≥1.80的合格樣本完成后續(xù)實驗。利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為單鏈cDNA，以模板鏈cDNA作為模板，利用PCR試劑盒進行PCR操作。miR-31及內(nèi)參引物分別為，miR-31引物：上游5′-CAT CTT CAA AAG CGG ACA CTC T-3′，下游5′-ACA ATA CAT AGC AGG ACA GGA AG-3′；U6引物：上游5′-TGC GGG TGC TCG CTT CGG CAG C-3′，下游5′-CCA GTG CAG GGT CCG AGG T-3′。PCR反應條件：94 ℃ 60 s，92 ℃ 45 s，56 ℃ 30 s，74 ℃ 30 s，36個循環(huán)。每個樣品均設(shè)置3個平行反應復孔。以U6為參照，用2-△△Ct法獲得不同組細胞中miR-31相對表達量。

1.2.3 MTT法檢測不同轉(zhuǎn)染組細胞增殖情況 將各組轉(zhuǎn)染后處于對數(shù)生長期細胞接種于96孔板，細胞數(shù)約為5×103/孔，分別于培養(yǎng)0、24、48、72、96 h時，每孔加入MTT液20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，去除孔中培養(yǎng)液后，將DMSO加入，室溫條件下振蕩8 min，用全自動酶標儀取490 nm波長處，對各孔吸光度(A)值進行測量，以A值代表細胞增殖能力。

1.2.4 Annexin V-FITC/PI雙染色檢測不同轉(zhuǎn)染組細胞凋亡情況 取各組轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48 h細胞，用胰蛋白酶對細胞進行消化后收集細胞，用PBS液洗滌3次，于2 000 r/min離心5 min，收集細胞，加入緩沖液重新懸浮，使細胞濃度調(diào)整為1×105個/mL，取細胞懸液100 μL，放置于流式管中，分別將Annexin V-FITC和PI加入，于避光條件下，振動搖勻10 min，利用流式細胞儀對細胞凋亡情況進行檢測。

1.2.5 PI單染色法檢測不同轉(zhuǎn)染組細胞周期 取轉(zhuǎn)染后48 h細胞，胰酶消化后收集細胞，用預冷PBS液洗滌，加入70%乙醇固定，于4 ℃下過夜孵育。加入RNaseA，于37 ℃條件下孵育40 min，取出后放置于冰上以終止RNaseA作用，將PI加入，于4 ℃條件下避光反應30 min，用流式細胞儀檢測細胞周期變化。

1.2.6 Western blotting檢測不同轉(zhuǎn)染組細胞中RhoBTB1蛋白表達 取各組轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48 h細胞，加入細胞裂解液裂解，用總蛋白提取試劑盒對總蛋白進行提取，并用BCA蛋白檢測試劑盒進行檢測。取總蛋白，用SDS-PAGE進行凝膠電泳，電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，用5%脫脂奶粉進行封閉60 min，用PBST進行洗膜。滴加兔抗RhoBTB1抗體(1∶1 000稀釋)，4 ℃下過夜孵育。PBST洗膜3次，將山羊抗兔二抗IgG加入，孵育120 min，PBST洗膜3次，ECL電化學發(fā)光反應后，拍照并用Image J圖像分析軟件進行分析，以GAPDH為內(nèi)參，獲得目的蛋白相對表達量。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用方差分析和q檢驗。

2 結(jié)果

2.1 不同轉(zhuǎn)染組細胞中miR-31表達量比較 ASO組細胞中miR-31表達量為(0.37±0.09)，明顯低于對照ASO組(0.91±0.11)和空白對照組(0.89±0.13)(P<0.01)，而對照ASO組和空白對照組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

2.2 不同轉(zhuǎn)染組細胞增殖情況比較 ASO組細胞在24、48、72、96 h時A值均低于對照ASO組和空白對照組(P<0.05～P<0.01)，而對照ASO組和空白對照組細胞不同時點A值差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。3組細胞隨著時間推移，A值均較之前有所逐漸增加(P<0.01)(見表1)。

表1 不同轉(zhuǎn)染組在不同時點細胞增殖情況比較(A值；

q檢驗：與AOS組比較*P<0.05，**P<0.01；與0 h比較△P<0.05，△△P<0.01；與24 h比較#P<0.05，##P<0.01；與48 h比較+P<0.05，++P<0.01；與72 h比較-P<0.05，--P<0.01

2.3 不同轉(zhuǎn)染組細胞凋亡情況比較 3組細胞凋亡率差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，ASO組細胞凋亡率明顯高于對照ASO組和空白對照組(P<0.01)，而對照ASO組和空白對照組細胞凋亡率差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(見表2、圖1)。

2.4 不同轉(zhuǎn)染組細胞周期情況比較 ASO組G0/G1期細胞比例明顯高于對照ASO組和空白對照組，而S期和G2期細胞比例明顯低于對照ASO組和空白對照組(P<0.01)(見表3、圖2)。

表2 不同轉(zhuǎn)染組細胞凋亡情況比較

q檢驗：與AOS組比較**P<0.01

2.5 不同轉(zhuǎn)染組細胞中RhoBTB1蛋白表達比較 Western blotting檢測結(jié)果顯示，ASO組細胞中RhoBTB1蛋白表達量明顯高于對照ASO組和空白對照組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，而對照ASO組和空白對照組細胞中RhoBTB1蛋白表達量差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(見表4、圖3)。

表3 不同轉(zhuǎn)染組細胞周期的變化

q檢驗：與AOS組比較**P<0.01

表4 不同轉(zhuǎn)染組細胞中RhoBTB1蛋白表達比較

q檢驗：與AOS組比較**P<0.01

3 討論

尖銳濕疣的發(fā)生是涉及多因素、多基因參與的復雜過程，引起尖銳濕疣的HPV感染與生殖器部位惡性腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)[6]，尖銳濕疣病人皮損處角質(zhì)形成細胞的過度增殖增加癌變的風險[7]。miR作為一種高度保守的短小RNA，在細胞增殖、分化、凋亡等過程中發(fā)揮重要作用，且參與了惡性腫瘤發(fā)生及進展過程[8]。研究表明，miR-31在結(jié)腸癌[9]、胃癌[10]等惡性腫瘤中呈高表達，亦有研究[5]指出，miR-31在尖銳濕疣病人皮損中呈高表達。為進一步探討miR-31對HaCaT細胞增殖和凋亡的影響，本研究利用ASO技術(shù)特異性抑制miR-31表達，結(jié)果顯示，ASO組細胞中miR-31表達量明顯低于對照ASO組和空白對照組，說明HaCaT細胞中miR-31被特異性抑制。

本研究顯示，ASO組細胞在24、48、72、96 h時A值均低于對照ASO組和空白對照組，說明在特異性抑制miR-31表達后，細胞增殖被顯著抑制，提示miR-31可能參與了HaCaT細胞增殖過程，在HaCaT細胞大量增殖過程中發(fā)揮重要作用。本研究還顯示，ASO組細胞凋亡率明顯高于對照ASO組和空白對照組，說明特異性抑制miR-31可明顯抑制細胞凋亡的發(fā)生，進一步對細胞周期分析發(fā)現(xiàn)，ASO組G0/G1期細胞比例明顯高于對照ASO組和空白對照組，而S期和G2期細胞比例明顯低于對照ASO組和空白對照組，說明抑制miR-31表達可阻止細胞從G1期向S期進展，從而影響HaCaT細胞增殖過程，同時加速細胞凋亡的發(fā)生。RhoBTB1基因位于人染色體10q21.3區(qū)域，是RhoBTB亞家族重要成員，在細胞轉(zhuǎn)錄、細胞骨架調(diào)控、離子通道裝配、蛋白泛素化等過程中發(fā)揮重要作用[11]，被認為是一種腫瘤抑制因子，在惡性腫瘤組織中呈低表達[12]，多項研究[13-14]表明，RhoBTB1是miR-31作用靶點。本研究顯示，ASO組細胞中RhoBTB1蛋白表達量明顯高于對照ASO組和空白對照組，說明特異性抑制miR-31可促進RhoBTB1蛋白表達，推測miR-31可能通過調(diào)控RhoBTB1蛋白表達而實現(xiàn)對HaCaT細胞增殖和凋亡的影響。

綜上所述，miR-31可能參與了人角質(zhì)形成細胞系HaCaT細胞增殖、凋亡過程，可能通過調(diào)控RhoBTB1蛋白表達而實現(xiàn)這一生物學過程，但具體作用機制尚待進一步研究明確。