N-乙酰半胱氨酸對(duì)乙醇誘導(dǎo)張氏肝細(xì)胞損傷的保護(hù)作用

陳 蘇，謝麗麗，崔慧嫻，趙文紅

酒精性肝病(alcoholic liver disease，ALD)，又稱酒精性肝損傷。ALD是由于長(zhǎng)期過量攝入乙醇導(dǎo)致的一種慢性疾病，其危害極大。由于長(zhǎng)期過量飲酒后，超過肝臟代償能力，從而導(dǎo)致肝臟的脂肪變、纖維變甚至最后造成的肝硬化，是現(xiàn)代世界范圍嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題之一。據(jù)統(tǒng)計(jì)，由于飲酒導(dǎo)致的肝硬化居我國(guó)肝硬化病因的次位[1]。眾所周知，現(xiàn)嗜酒者數(shù)量迅速增加，ALD的患病率現(xiàn)在也是急劇上升，ALD的患病率的增加給國(guó)家社會(huì)和家庭各方面都帶來嚴(yán)重負(fù)擔(dān)[2]。然而目前對(duì)于ALD并沒有特別有效的防治方法，因此探索發(fā)現(xiàn)有效并且機(jī)制明確的防治ALD的物質(zhì)迫在眉睫。

N-乙酰半胱氨酸(NAC)是還原型谷胱甘肽的前體物質(zhì)，是一種含有硫基的具有抗氧化性的乙?；苌?，廣泛存在于真核生物體內(nèi)[3]，我們?cè)谌粘ｏ嬍持屑纯裳a(bǔ)充，特別是洋蔥類[4]這種富含有機(jī)硫化物的食物中含量比較豐富。NAC在臨床上在呼吸系統(tǒng)和肝臟解毒方面已有應(yīng)用，隨著近年來大量的研究證明，NAC由于具有抗氧化性等廣泛的生物活性，且在非酒精性脂肪肝[5]、阻塞性肺疾病(COPD)[6]及精神類疾病[7]治療方面均有較好效果。

本研究對(duì)象人張氏肝細(xì)胞是來源于人體非惡性肝組織的一類細(xì)胞株，細(xì)胞株?duì)顟B(tài)相對(duì)穩(wěn)定，已經(jīng)在很多實(shí)驗(yàn)中得到了廣泛應(yīng)用[9-11]。體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)一方面具有成本低、周期短等優(yōu)點(diǎn)，另一方面，在無法進(jìn)行人體實(shí)驗(yàn)以及尊重實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的原則之下，可以選擇來源于人的正常肝細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)獲得相關(guān)資料?，F(xiàn)階段并沒有關(guān)于在細(xì)胞水平上探究NAC對(duì)乙醇誘導(dǎo)肝細(xì)胞損傷保護(hù)作用的研究，因此選取此細(xì)胞株探究NAC對(duì)于乙醇誘導(dǎo)人正常肝細(xì)胞損傷是否具有保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 試劑 人張氏肝細(xì)胞購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司；乙醇購(gòu)自天津市購(gòu)于精細(xì)化工有限公司，純度>99%；RPMI 1640培養(yǎng)液購(gòu)自Gibco公司；南美洲胎牛血清購(gòu)自ExCell；雙抗購(gòu)自Biosharp；NAC、胰酶消化液、活性氧檢測(cè)試劑盒購(gòu)自碧云天生物科技研究所；MTT試劑購(gòu)自Biofoxx生物科技公司。天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)購(gòu)自南京建成生物工程有限公司；腫瘤壞死因子(TNF-α)、白細(xì)胞介素(IL-6)ELISA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海酶聯(lián)生物科技有限公司。

1.2 儀器設(shè)備 細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo公司)；酶標(biāo)儀(美國(guó)BioTek公司)；超聲細(xì)胞破碎儀(美國(guó)Sonics公司)；超高速冷凍離心機(jī)(美國(guó)SIGMA公司)，倒置顯微鏡(日本OLYMPUS公司)。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)與分組 將張氏肝細(xì)胞使用RPMI1640培養(yǎng)液(含10%胎牛血清，1%雙抗)于細(xì)胞培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)。待細(xì)胞數(shù)量達(dá)到80%～90%時(shí)，將細(xì)胞消化下來并進(jìn)行分組，分為對(duì)照組(不做任何處理)；乙醇損傷組(Hurt組：使用400 mmol/L的乙醇對(duì)肝細(xì)胞損傷24 h)和NAC預(yù)處理保護(hù)組[NAC低、中、高劑量組(NAC-L、NAC-M、NAC-H)終濃度分別為1 mmol/L、2 mmol/L和5 mmol/L的NAC進(jìn)行預(yù)處理30 min后，加入乙醇使其終濃度為400 mmol/L并繼續(xù)干預(yù)24 h]。

1.3.2 MTT法測(cè)定細(xì)胞存活率 待細(xì)胞長(zhǎng)滿培養(yǎng)皿的80%～90%后，用PBS清洗1～2次后將細(xì)胞消化下來，細(xì)胞(每孔1×105)接種于96孔板中，每孔200 μL，待細(xì)胞完全貼壁后，各組按照方法“1.3.1”進(jìn)行處理，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)后移除培養(yǎng)液，每孔加入50 μL的MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，棄去上清液，每孔加入200 μL二甲基亞砜，置于平板搖床上水平搖晃15 min，隨后使用酶標(biāo)儀在490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，并計(jì)算每組存活率，細(xì)胞存活率的計(jì)算公式如下：

細(xì)胞存活率=樣品組吸光度/對(duì)照組吸光度× 100%

1.3.3 AST、ALT的測(cè)定 收集細(xì)胞：1 000 r/min離心10 min，棄上清，留細(xì)胞沉淀，加入PBS，冰水浴條件下超聲破碎，勻漿液配好混勻后立即測(cè)試活性，根據(jù)試劑盒說明書步驟操作，測(cè)定每個(gè)樣本的吸光度，最后根據(jù)AST、ALT的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出各樣本酶活性。

1.3.4 ELISA法測(cè)定TNF-α、IL-6水平 按照“1.3.1”項(xiàng)下方法處理細(xì)胞后，收集上清液，用超高速冷凍離心機(jī)3 000 r/min離心20～30 min，收集離心后的上清液，按照試劑盒說明書要求測(cè)定TNF-α、IL-6水平，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。

1.3.5 細(xì)胞ROS測(cè)定 按“1.3.1”項(xiàng)下方法處理細(xì)胞后，按照將1∶1 000用無血清培養(yǎng)基進(jìn)行稀釋后安裝終濃度為10 mmol/L探針DCFH-DA。 37 ℃孵育20 min后用無血清細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞3次。用酶標(biāo)儀在488 nm激發(fā)光及525 nm發(fā)射光檢測(cè)每組細(xì)胞內(nèi)的ROS水平。細(xì)胞內(nèi)相對(duì)ROS水平=實(shí)驗(yàn)組吸OD值/對(duì)照組OD值×100%

1.3.6 細(xì)胞上清液中LDH的檢測(cè) 將細(xì)胞按照"1.3.1"項(xiàng)下方法處理后收集上清液；將收集到的細(xì)胞上清液按照12 000 r，10 min進(jìn)行離心并且取上清液。按照說明書步驟及所提供試劑測(cè)定各樣品吸光度，并根據(jù)說明書步驟及提供的標(biāo)準(zhǔn)品制作LDH的標(biāo)準(zhǔn)曲線，將測(cè)得吸光度帶入制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線后得到各樣品中的LDH水平。

1.3.7 乙醇誘導(dǎo)肝細(xì)胞損傷模型的建立 根據(jù)不同濃度乙醇損傷肝細(xì)胞24 h后細(xì)胞的存活率和細(xì)胞上清液中LDH含量，并參照相關(guān)文獻(xiàn)建立損傷模型的方法建立乙醇誘導(dǎo)肝細(xì)胞損傷模型。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用方差分析和q檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 肝細(xì)胞損傷組乙醇濃度的篩選 本次濃度篩選共設(shè)置4組，分別為control組(不作任何處理)；乙醇損傷組(各組濃度分別為200 mmol/L、400 mmol/L、500 mmol/L)。當(dāng)乙醇濃度為400 mmol/L時(shí)，乙醇損傷24 h后細(xì)胞活力約在75% 左右(P<0.01)。并且在此濃度干預(yù)24 h時(shí)LDH濃度最高(P<0.01)(見表1)，參照劉吉云等[12-13]建立乙醇誘導(dǎo)肝細(xì)胞損傷模型的方法，選取乙醇濃度400 mmol/L，作用24 h來建立乙醇誘導(dǎo)肝細(xì)胞損傷模型。

2.2 NAC預(yù)處理對(duì)乙醇誘導(dǎo)的肝細(xì)胞存活率的影響 采用MTT檢測(cè)細(xì)胞存活率,不同處理方法處理張氏肝細(xì)胞24 h后,預(yù)加入NAC的細(xì)胞存活率都相對(duì)高于Hurt組細(xì)胞存活率 (P<0.05～P<0.01)，1～5 mmol/L的NAC對(duì)乙醇誘導(dǎo)損傷組的細(xì)胞存活率都有提高作用(見表2)。

分組n細(xì)胞存活率/%LDH/(U/L)對(duì)照組3100.00±2.36 182.25±11.91Hurt組 200mmol/L 3100.03±1.11##185.31±12.29## 400 mmol/L375.63±2.84??321.71±9.19?? 500 mmol/L345.16±3.26??##264.19±4.81??## F—319.12135.62 P—<0.01<0.01 MS組內(nèi)—6.384100.122

q檢驗(yàn)：與對(duì)照組比較**P<0.01；與400 mmol/L組比較##P<0.01

2.3 細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化觀察 各組細(xì)胞于倒置顯微鏡下觀察,對(duì)照組細(xì)胞呈橢圓形或多角形,明顯可見突觸,貼壁生長(zhǎng)。經(jīng)乙醇處理后,可見一些細(xì)胞開始變圓，邊界遮光性差，貼壁狀態(tài)差有細(xì)胞出現(xiàn)漂浮死亡。NAC處理組可見細(xì)胞死亡變圓細(xì)胞減少，存活細(xì)胞增多(見圖1)。

2.4 NAC預(yù)處理對(duì)肝細(xì)胞中AST、ALT含量的影響 NAC干預(yù)組與Hurt組相比細(xì)胞AST、ALT含量均下降(P<0.05)，說明NAC在1～5 mmol/L的范圍內(nèi)均可以降低AST和ALT的含量(見表2)。

表2 各組細(xì)胞存活率及細(xì)胞內(nèi)AST、ALT含量

q檢驗(yàn)：與對(duì)照組比較*P<0.05,**P<0.01；與Hurt組比較#P<0.05,##P<0.01

2.5 NAC預(yù)處理對(duì)細(xì)胞中TNF-α、IL-6水平的影響 NAC干預(yù)組細(xì)胞上清液中TNF-α、IL-6含量均低于Hurt組(P<0.05)，說明NAC在1～5 mmol/L的范圍內(nèi)都可以降低上清液中TNF-α和IL-6的含量，TNF-α、IL-6隨NAC濃度的增高而降低(見表3)。

2.6 細(xì)胞內(nèi)ROS的水平 NAC干預(yù)后的各組細(xì)胞內(nèi)ROS水平均低于Hurt組 (P<0.05)，NAC在1～5 mmol/L的范圍內(nèi)都可以降低細(xì)胞中由于乙醇損傷導(dǎo)致的ROS，隨NAC劑量的升高，細(xì)胞內(nèi)ROS的水平逐漸減少(P<0.01)(見表3)。

分組nTNF-α/(ng/L) IL-6/(ng/L) 相對(duì)ROS水平/% 對(duì)照組351.58±1.59 132.36±3.87 100.00±9.83 Hurt組383.33±5.82??210.56±7.03??535.36±28.27??NAC-L組364.76±3.74??##194.04±14.42??#343.73±40.64??##NAC-M組361.67±1.38??##163.06±5.90??##138.02±15.68##NAC-H組354.17±1.76##158.06±7.50??##117.87±18.82##F—42.45 39.40 204.70 P—<0.01 <0.01 <0.01 MS組內(nèi)—11.071 72.672 516.580

q檢驗(yàn)：與對(duì)照組比較**P<0.01；與Hurt組比較#P<0.01,##P<0.01

3 討論

肝臟是人體最大的代謝場(chǎng)所，所以肝臟的健康狀態(tài)對(duì)于人體健康有著至關(guān)重要的影響，探索不同物質(zhì)對(duì)各種類型肝臟損傷的保護(hù)作用及機(jī)制一直是世界性的熱點(diǎn)問題，也是一直以來的難題。ALD是一種由于長(zhǎng)期或者少次大量飲酒造成的一種代謝類疾病，飲酒對(duì)于肝臟造成的損傷極大，可以由脂肪肝、肝纖維化發(fā)展到肝硬化，嚴(yán)重大量酗酒甚至可以造成肝衰竭[14]。目前已知ALD的發(fā)生機(jī)制較為復(fù)雜，現(xiàn)在對(duì)于其機(jī)制的研究已經(jīng)涉及氧化應(yīng)激機(jī)制、免疫機(jī)制、營(yíng)養(yǎng)機(jī)制等，但是卻沒有找到明確的防治營(yíng)養(yǎng)素或者藥物對(duì)ALD有特別療效。2016年，全球1 100萬死亡病例中，約有40萬例是由乙醇引起的，同時(shí)，乙醇會(huì)增加肝硬化和胰腺炎的風(fēng)險(xiǎn)[15]，估計(jì)有63.7萬人死于消化系統(tǒng)疾病，其中由于酒精性肝硬化死亡60.7萬人[16]。

肝臟酶學(xué)指標(biāo)可反映肝臟的基本情況，常用來評(píng)價(jià)肝臟損傷發(fā)生情況，而在肝臟酶學(xué)指標(biāo)中，通常使用ALT和AST反映肝細(xì)胞損傷程度，現(xiàn)在也有很多研究在探究?jī)烧弑戎祵?duì)于評(píng)價(jià)肝損傷是否更加敏感，在臨床應(yīng)用時(shí)是否對(duì)肝損傷程度反映更加敏感。ALT主要存在肝細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)，而絕大部分的AST分布在線粒體中[17]。所以本研究采用將細(xì)胞破裂并制作成勻漿的方式，檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的AST、ALT水平。本研究結(jié)果表明，在乙醇損傷肝細(xì)胞模型中，AST和ALT水平都出現(xiàn)明顯的升高，加入NAC干預(yù)后，AST和ALT明顯下降，說明NAC對(duì)乙醇誘導(dǎo)的肝細(xì)胞的損傷有較好的保護(hù)作用，這與的KISAOGLU等[18-20]的研究“補(bǔ)充NAC可以明顯減低由于如脂多糖、氨基酚類化合物等物質(zhì)導(dǎo)致的AST、ALT的升高”相一致。炎癥因子可以評(píng)價(jià)肝臟受到損傷后的炎癥反映水平。長(zhǎng)期接觸乙醇對(duì)誘發(fā)和促進(jìn)酒精性肝損傷有促進(jìn)作用。它可以激活先天免疫和產(chǎn)生促炎細(xì)胞因子TNF-α[21]。肝臟受到損傷后炎癥因子TNF-α敏感度相對(duì)較高[22]，并且對(duì)細(xì)胞的炎癥狀態(tài)有著非常重要的影響。一方面，乙醇刺激肝臟后可以產(chǎn)生促炎因子TNF-α等，其可以通過多種方式調(diào)節(jié)細(xì)胞的激活和增殖、細(xì)胞毒性、細(xì)胞凋亡等生理活動(dòng)[23]；另一方面TNF-α可以直接激活NF-κB信號(hào)通路，促進(jìn)IL-6等促炎因子的產(chǎn)生[24-25]，進(jìn)一步加重機(jī)體炎癥反應(yīng)。促炎因子IL-6也與肝臟的損傷程度有著密切的關(guān)系。根據(jù)本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過乙醇損傷的肝細(xì)胞TNF-α和IL-6的水平都顯著上升，但經(jīng)過NAC干預(yù)后兩個(gè)指標(biāo)都出現(xiàn)了顯著的下降，說明NAC能在一定程度上改善乙醇誘導(dǎo)肝細(xì)胞損傷后的炎癥狀態(tài)，這與ASLAN等[26-27]的研究“體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)NAC可以在一定程度上可以改善肝臟損傷的炎癥狀態(tài)，NAC通過減輕氧化應(yīng)激損傷來緩解炎癥反應(yīng)等”相一致。氧化應(yīng)激反應(yīng)是多種肝臟疾病的共同病理基礎(chǔ)，在正常條件下，人體氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)維持在平衡狀態(tài)，但當(dāng)肝臟長(zhǎng)期攝入乙醇時(shí)，導(dǎo)致肝臟內(nèi)氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)遭到破壞，體內(nèi)的ROS和活性氮堆積造成肝臟損傷[28]，還可以進(jìn)一步造成脂質(zhì)過氧化進(jìn)一步加重肝臟損傷[29]。ROS代表是反應(yīng)氧化應(yīng)激的重要指標(biāo)，ROS在肝臟中過量累積會(huì)造成肝臟中谷胱甘肽、超氧化物歧化酶等抗氧化物含量的下降，氧自由基的增加[30]，以及會(huì)誘導(dǎo)以TNF-α為主的細(xì)胞因子的產(chǎn)生加重炎癥反應(yīng)[31]。本研究表明，NAC可以有效的抑制和減少由于乙醇誘導(dǎo)肝細(xì)胞損傷所產(chǎn)生的ROS。經(jīng)NAC干預(yù)后，細(xì)胞的存活率出現(xiàn)了明顯的增加，說明NAC可能通過抑制細(xì)胞凋亡來保護(hù)乙醇誘導(dǎo)的肝細(xì)胞損傷。

綜上所述，NAC可能通過減輕乙醇誘導(dǎo)肝細(xì)胞炎癥反應(yīng)，減輕氧化應(yīng)激和抑制乙醇誘導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡，從而起到對(duì)乙醇誘導(dǎo)的肝細(xì)胞損傷的保護(hù)作用。目前，對(duì)ALD并沒有明確有效的防治方法，其最根本的方法還是戒酒，此研究在細(xì)胞水平上探究了NAC可能通過減輕炎癥反應(yīng)，降低氧化應(yīng)激水平和阻止細(xì)胞凋亡這幾個(gè)方面起到對(duì)肝細(xì)胞的保護(hù)作用，為以后的相關(guān)研究提供佐證，但其具體的分子機(jī)制還需要進(jìn)一步的探究。