不同液體限制性復(fù)蘇對創(chuàng)傷失血性休克病人外周血Th17和Treg細(xì)胞比例的影響

李啟梁，朱 恒，邱兆磊，紀(jì) 忠，王振杰

創(chuàng)傷失血性休克是臨床常見的休克類型之一，同時也是目前全球45歲以下病人死亡的主要原因[1]。嚴(yán)重創(chuàng)傷通常導(dǎo)致嚴(yán)重的免疫功能障礙，進(jìn)而導(dǎo)致膿毒癥和多器官功能障礙綜合征等多種創(chuàng)傷后并發(fā)癥，而這些創(chuàng)傷后并發(fā)癥是24 h內(nèi)病人最常見的死亡原因[2]。免疫系統(tǒng)的異常改變被認(rèn)為是導(dǎo)致創(chuàng)傷后并發(fā)癥的關(guān)鍵因素，主要表現(xiàn)為創(chuàng)傷后T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫功能受損，同時伴隨著CD4 T細(xì)胞免疫活動的抑制或改變[3-4]，其中，輔助性T細(xì)胞17(helper T cell 17,Th17)和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cell,Treg)作為免疫調(diào)節(jié)因子在創(chuàng)傷失血性休克后免疫調(diào)節(jié)失衡的發(fā)病機(jī)制中起核心作用[5-6]，Th17/Treg平衡可能是維持創(chuàng)傷失血性休克病人免疫穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵[7]。但目前探討Th17、Treg比例變化及相關(guān)細(xì)胞因子在創(chuàng)傷失血性休克中的變化、意義以及臨床常用復(fù)蘇液對其影響報道較少。我們通過觀察不同液體限制性復(fù)蘇對創(chuàng)傷失血性休克病人外周血Th17、Treg比例及相關(guān)細(xì)胞因子水平的影響，評估其復(fù)蘇效果，從而選擇有助于維持病人免疫穩(wěn)態(tài)、減少創(chuàng)傷后并發(fā)癥發(fā)生、提高病人生存率的相對理想復(fù)蘇液，為臨床失血性休克早期液體復(fù)蘇治療提供理論依據(jù)?，F(xiàn)作報道。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2016年1月至2019年6月我科收治的創(chuàng)傷失血性休克病人56例作為研究對象(創(chuàng)傷組)，其中男44例，女12例；年齡19～84歲；創(chuàng)傷原因：交通意外傷24例，高處墜落傷16例，利器傷9例，擠壓傷5例，斗毆及其他2例。隨機(jī)分為醋酸鈉林格氏液復(fù)蘇(AR)組和乳酸鈉林格氏液復(fù)蘇(LR)組，各28例。另隨機(jī)選取我院健康醫(yī)師志愿者18名作為對照組，采血前 1個月內(nèi)均無創(chuàng)傷病史，其中男10例，女8例。3組年齡、性別構(gòu)成均具有可比性。本研究通過本院倫理委員會批準(zhǔn)(批號：BYYFY-2015KY07)，并告知病人或病人家屬研究相關(guān)情況，簽署相關(guān)知情同意書。

創(chuàng)傷組病人納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)年齡≥18歲；(2)ISS≥16分；(3)受傷至入院時間<6 h[8]；(4)本次受傷前 1個月內(nèi)無創(chuàng)傷病史；(5)符合歐洲危重病醫(yī)學(xué)會失血性休克的相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)[9]。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)入院后1 h內(nèi)死亡病人；(2)入院后1 h內(nèi)進(jìn)行輸血治療或介入、手術(shù)治療病人；(3)伴有重要臟器器質(zhì)性病變病人；(4)既往有凝血功能障礙病史病人；(5)既往有自身免疫性、風(fēng)濕性疾病或長期服用糖皮質(zhì)激素者；(6)有嚴(yán)重的慢性疾?。?7)妊娠及哺乳期婦女。

1.2 方法 采集受試者外周血10 mL，其中5 mL肝素抗凝后用于分離淋巴細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測Th17、Treg比例；5 mL促凝后離心分離血清置于-80 ℃冰箱凍存，用于檢測血清白細(xì)胞介素(IL)-17、IL-6、IL-23和腫瘤壞死因子α(TNF-α)水平，同時進(jìn)行血常規(guī)、凝血功能等實(shí)驗(yàn)室檢查，創(chuàng)傷組進(jìn)行創(chuàng)傷嚴(yán)重程度評分。

其中Th17、Treg檢測采用BD FACScantoⅡ流式細(xì)胞儀(美國BD公司)，參照文獻(xiàn)及說明書實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行，所有血液標(biāo)本均于采集后30 min內(nèi)進(jìn)行檢測，采用BD FACSDiva軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。IL-17、IL-6、IL-23和TNF-α水平采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)試劑盒(聯(lián)科生物)分別進(jìn)行檢測，按照說明書方法進(jìn)行。受試者使用醋酸鈉林格液來自湖北多瑞藥業(yè)有公司，乳酸鈉林格液來自安徽環(huán)球藥業(yè)股份有限公司。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用t(或t′)檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 AR組和LR組受試者一般情況比較 復(fù)蘇前對AR組和LR組受試者相應(yīng)指標(biāo)進(jìn)行比較，結(jié)果顯示，2組體質(zhì)量、年齡、體溫、呼吸頻率、心率、收縮壓、舒張壓、平均動脈壓、創(chuàng)傷嚴(yán)重程度評分和血紅蛋白、紅細(xì)胞、凝血酶原時間、活化部分凝血活酶時間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(見表1)。

2.2 創(chuàng)傷組(LR組+AR組)和對照組外周血Th17、Treg比例及相關(guān)細(xì)胞因子水平比較 與對照組比較，創(chuàng)傷組外周血Th17、Treg比例和IL-17、IL-6、IL-23、TNF-α水平均明顯升高(P<0.01)(見表2)。

2.3 AR組和LR組病人各時點(diǎn)Th17、Treg比例及相關(guān)細(xì)胞因子水平比較 復(fù)蘇前，創(chuàng)傷組2組病人外周血Th17、Treg比例及細(xì)胞因子水平差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。復(fù)蘇后30 min，LR組Th17比例和IL-6、TNF-α水平升高幅度均大于AR組(P<0.05～P<0.01)；2組Treg比例、IL-17、和IL-23水平變化差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。復(fù)蘇后1 h，AR組和LR組各指標(biāo)變化差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(見表3)。

3 討論

創(chuàng)傷失血性休克引發(fā)復(fù)雜的機(jī)體反應(yīng)，超過90%的病人在創(chuàng)傷失血性休克后可檢測到早期和持續(xù)的炎癥免疫反應(yīng)[10]，其擾亂天然免疫和適應(yīng)性免疫，免疫反應(yīng)的中樞調(diào)節(jié)被改變，誘導(dǎo)細(xì)胞因子和介質(zhì)隨時間變化，這些被認(rèn)為會引起嚴(yán)重的臨床后果，因?yàn)樗鼈兪菣C(jī)會性感染和創(chuàng)傷后并發(fā)癥的主要原因，這主要?dú)w因于T淋巴細(xì)胞和抗原呈遞細(xì)胞之間的相互作用受損[6]。報道顯示，創(chuàng)傷失血性休克病人外周血單核細(xì)胞不能產(chǎn)生T淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)[11]。過去T輔助細(xì)胞1型(Th1)和2型(Th2)模式已被認(rèn)為是創(chuàng)傷失血性休克T細(xì)胞反應(yīng)的基本原則，例如創(chuàng)傷后Th1型免疫反應(yīng)明顯減少[4]，此外，創(chuàng)傷增加了Th2細(xì)胞的表達(dá)，并導(dǎo)致細(xì)胞免疫功能受損[12]，進(jìn)而導(dǎo)致Th1/Th2失衡，Th2細(xì)胞傾向升高或抗炎免疫反應(yīng)增強(qiáng)。但是隨著研究的深入，Th17和Treg被發(fā)現(xiàn)在創(chuàng)傷后調(diào)節(jié)宿主免疫反應(yīng)中起著更為重要的作用，研究[13]顯示，Th17細(xì)胞在創(chuàng)傷性視神經(jīng)病變大鼠脾臟中上調(diào)，Treg對嚴(yán)重?fù)p傷后Th1細(xì)胞的抑制有一定促進(jìn)作用[14]，此外，Treg在抑制Th1細(xì)胞因子和產(chǎn)生較高水平的Th2細(xì)胞因子反應(yīng)方面起重要作用。同時，有研究[15]表明，Th17和Treg細(xì)胞及其相關(guān)細(xì)胞介質(zhì)也參與了創(chuàng)傷失血性休克相關(guān)多器官缺血再灌注損傷。本研究結(jié)果顯示，創(chuàng)傷失血性休克病人外周血Th17細(xì)胞和Treg細(xì)胞比例及IL-17、TNF-α、IL-6等均明顯高于對照組，提示病人體內(nèi)發(fā)生了廣泛且劇烈的炎癥反應(yīng)。Th17比例及其介質(zhì)的升高提示其參與了創(chuàng)傷失血性休克的炎癥反應(yīng)進(jìn)程，加強(qiáng)了其炎癥反應(yīng)的程度，而Treg比例及其介質(zhì)的代償性上升也進(jìn)一步說明創(chuàng)傷失血性休克的疾病進(jìn)展不是單純的促炎反應(yīng)，而是促炎和抗炎相互作用的結(jié)果。可見Th17和Treg及其相關(guān)細(xì)胞介質(zhì)與創(chuàng)傷失血性休克病人免疫穩(wěn)態(tài)的維持及進(jìn)展密切相關(guān)。

表1 2組受試者一般情況比較

分組n平均動脈/mmHg創(chuàng)傷嚴(yán)重程度評分/分血紅蛋白/(g/L)紅細(xì)胞/(×1012/L)凝血酶原時間/s活化部分凝血活酶時間/sAR組2850.10±4.1125.39±2.9378.57±4.683.03±0.5620.13±2.9343.17±3.95LR組2850.51±4.2524.49±2.5879.68±5.502.91±0.5519.20±2.4843.08±4.20t—0.521.100.950.751.450.07P—>0.05>0.05>0.05>0.05>0.05>0.05

表2 對照組和創(chuàng)傷組外周血Th17、Treg比例及相關(guān)細(xì)胞因子水平比較

*示t′值

嚴(yán)重創(chuàng)傷的處理在很大程度上取決于促炎和抗炎免疫反應(yīng)的平衡，功能上有利的免疫細(xì)胞在創(chuàng)傷后器官衰竭的早期恢復(fù)和發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用。因此，通過對Th17/Treg平衡進(jìn)行早期、多層面的免疫干預(yù)，可能具有抑制由創(chuàng)傷失血性休克誘發(fā)的局部炎癥及全身炎性反應(yīng)的作用，從而減少創(chuàng)傷并發(fā)癥的發(fā)生。對創(chuàng)傷失血性休克早期干預(yù)最常見的措施就是限制性液體復(fù)蘇，有效的液體復(fù)蘇可以提高病人有效循環(huán)血量，進(jìn)而提高心輸出量，改善氧氣輸送，同時還可以抑制炎癥反應(yīng)，減低兒茶酚胺效應(yīng)，目前最新拯救全身性感染行動治療指南將晶體液做為限制性液體復(fù)蘇的首選液體[16]。目前臨床上常用的復(fù)蘇液主要包括乳酸鈉林格液與醋酸鈉林格液。本團(tuán)隊的前期基礎(chǔ)和臨床試驗(yàn)表明，相對于乳酸鈉林格液，醋酸鈉林格液在減輕失血性休克大鼠肺組織、肝組織炎癥反應(yīng)以及在休克早期可以更好的抑制外周血TNF-α、IL-6的表達(dá)等方面有較大優(yōu)勢[17-19]，但在Th17和Treg細(xì)胞及其相關(guān)細(xì)胞介質(zhì)方面尚未涉及，所以本研究在其基礎(chǔ)上增加了Th17和Treg細(xì)胞及其相關(guān)細(xì)胞因子的研究。

表3 AR組和LR組外周血Th17、Treg比例及相關(guān)細(xì)胞因子水平比較

*示t′值

Th17細(xì)胞是由Th0細(xì)胞在IL-6和IL-23等的刺激下分化而成的輔助性T細(xì)胞，主要分泌IL-17、TNF-α、IL-6等促炎癥因子，后者可激活中性粒細(xì)胞或者參與巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的組織損傷，從而誘導(dǎo)組織炎癥反應(yīng)。Treg主要表達(dá) Foxp3，通過細(xì)胞接觸或釋放抗炎介質(zhì)IL-10等，多途徑抑制淋巴細(xì)胞反應(yīng)，發(fā)揮抗炎作用[20-21]。IL-23是影響Th17細(xì)胞發(fā)育和功能的關(guān)鍵細(xì)胞因子之一，在誘導(dǎo)致病Th17細(xì)胞的發(fā)育中發(fā)揮著主要的作用[22]。本研究結(jié)果顯示，創(chuàng)傷失血性休克病人血清IL-23也較對照組升高，進(jìn)一步證實(shí)Th17細(xì)胞參與了創(chuàng)傷失血性休克疾病進(jìn)展。目前為止，調(diào)節(jié)CD4 T細(xì)胞亞群的平衡及相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)已引起人們越來越多的關(guān)注。有學(xué)者提出，低劑量的IL-12治療可同時增加或維持促炎和抗炎介質(zhì)的產(chǎn)生，以增強(qiáng)宿主防御[23]。本研究結(jié)果表明，相對于乳酸鈉林格液，醋酸鈉林格液在休克早期(復(fù)蘇后30 min)可以減少Th17比例及炎癥介質(zhì)IL-17、TNF-α、IL-6的釋放，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；而在復(fù)蘇后1 h各指標(biāo)變化差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，這也與本團(tuán)隊前期研究[19]結(jié)果符合。提示采用醋酸鈉林格液復(fù)蘇早期可能通過降低Th17比例，進(jìn)而減少下游炎癥介質(zhì)釋放，但其確切機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

綜上，醋酸鈉林格液作為創(chuàng)傷失血性休克病人復(fù)蘇液，有助于維持Th17/Treg 的免疫平衡，從而抑制局部及全身炎癥反應(yīng)，減少創(chuàng)傷并發(fā)癥的發(fā)生。但本研究也存在病例及分組較少，存在統(tǒng)計學(xué)偏倚，以及觀察時間較短等不足，同時因病人后續(xù)隨著介入、手術(shù)、輸血等措施的應(yīng)用，沒有對病人的臨床轉(zhuǎn)歸及器官功能障礙分析等，導(dǎo)致研究結(jié)果的臨床意義具有一定局限性，需要進(jìn)一步進(jìn)行大型多中心研究加以證實(shí)。