烏司他丁通過 miR-146a 調(diào)節(jié) TLR4/NF-κB信號(hào)通路減輕失血性休克大鼠腎炎性損傷研究

王振杰，陳 硬，宋 琦，徐志鵬，紀(jì) 忠，邱兆磊，鄭傳明，李 磊，程 峰

創(chuàng)傷失血性休克[1](traumatic hemorrhagic shock，THS)指因創(chuàng)傷致使機(jī)體大量失血，并出現(xiàn)有效循環(huán)血容量降低、器官灌注不足及細(xì)胞代謝失調(diào)等一系列病理生理過程。若不能得到及時(shí)救治，會(huì)引起機(jī)體微循環(huán)功能紊亂，重者則可致使病人死亡。據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)[2]報(bào)道，全球每年大約190萬人死于失血性休克，其中，發(fā)生在美國(guó)的就有近6萬人。急性失血造成的微循環(huán)功能障礙、細(xì)胞代謝紊亂及炎癥反應(yīng)失調(diào)是THS發(fā)展的可預(yù)防和控制的首要死亡原因[3-5]。其中如何進(jìn)行有效的液體復(fù)蘇、改善微循環(huán)及調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)是目前THS研究的關(guān)鍵問題之一。YAN等[6]研究發(fā)現(xiàn)，失血性休克后予以復(fù)蘇后可能會(huì)引起持續(xù)性微循環(huán)障礙，導(dǎo)致多器官損傷，腎臟是受累器官之一。近年來，有日益增多的研究結(jié)果顯示出miR-146a與機(jī)體內(nèi)的炎癥反應(yīng)緊密相關(guān)，本團(tuán)隊(duì)前期研究結(jié)果[7]顯示失血性休克大鼠的miR-146a表達(dá)在肺組織中上調(diào)，但其是否參與失血性休克大鼠腎組織炎性損傷的調(diào)控及其作用機(jī)制尚不明確。

Toll樣受體4(TLR4)是炎癥反應(yīng)中信號(hào)傳導(dǎo)通路的關(guān)鍵樞紐之一，可通過激活核轉(zhuǎn)錄因子(NF-κB)進(jìn)行信號(hào)傳遞，刺激免疫細(xì)胞釋放出大量的炎癥介質(zhì)，進(jìn)而影響機(jī)體內(nèi)的炎癥均衡和免疫調(diào)節(jié)[8-9]。所以，調(diào)控TLR4/NF-κB信號(hào)通路或許是救治失血性休克的潛在途徑。烏司他丁(ulinastatin,UTI)指存在于尿液中，后經(jīng)高度提純而分離出來的蛋白酶抑制劑，在穩(wěn)定溶酶體膜、減輕內(nèi)皮細(xì)胞損傷、調(diào)理炎癥反應(yīng)、改善免疫狀態(tài)及緩解微循環(huán)功能障礙等方面具有重要的作用，現(xiàn)主要應(yīng)用于膿毒癥、急性循環(huán)衰竭及重癥胰腺炎等常見臨床危重癥的治療。醋酸鈉林格液是現(xiàn)今限制性液體復(fù)蘇的一線晶體液，且本課題組早期在關(guān)于限制性液體復(fù)蘇的研究結(jié)果中已經(jīng)得出了醋酸鈉林格液相比0.9%氯化鈉溶液和乳酸鈉林格液等療效更佳的結(jié)果[10-11]。CAO等[12]經(jīng)研究認(rèn)為，UTI能夠影響TLR4/NF-κB的信號(hào)通路，達(dá)到抑炎并減輕肺組織急性損傷的作用。本課題組的前期實(shí)驗(yàn)中已發(fā)現(xiàn)UTI可上調(diào)THS大鼠中miR-146a表達(dá)，但是其影響TLR4/NF-κB信號(hào)通路及減輕腎炎性損傷方面的作用與調(diào)控miR-146a表達(dá)水平是否有關(guān)，仍需進(jìn)一步驗(yàn)證。本實(shí)驗(yàn)旨在探討醋酸鈉林格液對(duì)THS大鼠行限制性液體復(fù)蘇的基礎(chǔ)上加用UTI，后檢測(cè)各指標(biāo)如miR-146a、炎癥因子及TLR4和NF-κB在腎組織中的表達(dá)量，從而研究經(jīng)UTI干預(yù)后的作用機(jī)制，以便為今后失血性休克的病人提供更精準(zhǔn)的醫(yī)治策略。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 24只雌雄不限的SD大鼠(均為SPF級(jí))，體質(zhì)量為230～250 g。大鼠在(24±1)℃的室溫及40%～60%的濕度中，經(jīng)12 h光照與黑暗周期循環(huán)交替環(huán)境下飼養(yǎng)7 d后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。Medlab-u/2cs生物信號(hào)采集處理系統(tǒng)、漩渦振蕩器、恒溫水浴鍋及全功能化學(xué)發(fā)光及熒光生物圖像分析系統(tǒng)等均購自中國(guó)，臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)和實(shí)時(shí)定量熒光PCR儀等均購自美國(guó)。烏司他丁和醋酸鈉林格液分別產(chǎn)自中國(guó)天普公司和湖南康源制藥有限公司。其他所有化學(xué)品均為試劑級(jí)。

1.2 動(dòng)物分組與休克模型建立 實(shí)驗(yàn)依據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠隨機(jī)分成3組，即休克未復(fù)蘇組(SR組)、醋酸鈉林格液復(fù)蘇組(AR組)和UTI聯(lián)用醋酸鈉林格液復(fù)蘇組(UR組)，每組各8只。建立創(chuàng)傷失血性休克及液體復(fù)蘇的大鼠模型：應(yīng)用2%戊巴比妥鈉(劑量為0.25 mL/100 g)通過腹腔給稱好體質(zhì)量的大鼠注射，待麻醉滿意后將其固定在操作臺(tái)上，并予以備皮后，使用聚維酮碘消毒，再予以鋪巾，充分暴露出腹股溝區(qū)皮膚，沿股靜脈走形切開后使用玻璃分針仔細(xì)顯現(xiàn)兩側(cè)的股動(dòng)、靜脈，并依次給予置管(管腔內(nèi)注入少量2.5%枸櫞酸鈉稀釋液，維持管腔暢通)。其中，右股動(dòng)脈于Medlab-u/2cs系統(tǒng)連通，右股靜脈的管道留予補(bǔ)充液體，左股動(dòng)脈的管道留以緩慢放血，左股靜脈的管道于微量泵相連。成功置管后，留置20 min給予大鼠適應(yīng)。用2 mL的注射器(內(nèi)含枸櫞酸鈉溶液0.2 mL)自大鼠左側(cè)股動(dòng)脈持續(xù)緩慢放血(速度為2 mL/3 min)，待大鼠平均動(dòng)脈壓下降至35 mmHg左右，整個(gè)過程約需15 min。再經(jīng)回輸少量大鼠的自體血和/或間斷緩慢放血保證平均動(dòng)脈壓約30～40 mmHg，持續(xù)60 min。SR組大鼠不復(fù)蘇，靜置4 h(如大鼠死亡，則死亡瞬間)后取其腎臟組織備檢。AR組予以醋酸鈉林格液進(jìn)行限制性液體復(fù)蘇，于大鼠的右股靜脈管道內(nèi)補(bǔ)充醋酸鈉林格液(總復(fù)蘇量∶總失血量=3∶1，過程約30 min)，左股靜脈在5 min內(nèi)泵入2 mL 0.9%氯化鈉溶液，復(fù)蘇滿意后，靜觀大鼠4 h后，取其腎臟組織。UR組是以AR組的基礎(chǔ)上聯(lián)用UTI，于左股靜脈在5 min內(nèi)泵入稀釋于2 mL 0.9%氯化鈉溶液中的UTI(10萬U/kg)，復(fù)蘇滿意后，靜觀大鼠4 h后，取其腎臟組織。在上述實(shí)驗(yàn)中，為了補(bǔ)償大鼠經(jīng)呼吸道和手術(shù)區(qū)域喪失的液體量，皆自大鼠左股靜脈連通微量泵推注0.9%氯化鈉溶液(5 mL·kg-1·h-1)。本實(shí)驗(yàn)已通過蚌埠醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理和相關(guān)倫理委員會(huì)的審查同意。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法和觀察指標(biāo)

1.3.1 采用QT-PCR法檢測(cè)大鼠腎組織中的miR-146a和炎癥因子的mRNA表達(dá)水平 按Trizol法從腎組織中分離、提取RNA，并根據(jù)美國(guó)Invitrogen公司的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒再將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA，后通過QT-PCR進(jìn)行擴(kuò)增。miR-146a、IL-1、IL-4、IL-6、IL-10和TNF-α、GAPDH的引物序列詳見表1。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR的引物序列

1.3.2 采用Western blotting檢測(cè)各組腎組織中TLR4、NF-κB的蛋白相對(duì)表達(dá)量 取凍存的腎組織，經(jīng)裂解收集和勻漿后，檢測(cè)組織蛋白濃度(用BCA試劑盒)，通過電泳后，轉(zhuǎn)移到PVDF膜，并將其放置在5%脫脂奶粉的封閉液內(nèi)，經(jīng)搖床2 h后，添加一抗。在搖床上(4 ℃)經(jīng)過孵育一夜之后，洗滌膜3次(用TBST)，添加二抗(已提前標(biāo)記)，通過1 h孵育(室溫)后，再次洗滌膜。使用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法(ECL)掃描并統(tǒng)計(jì)分析膜上條帶的密度，最后分析其目的蛋白和GAPDH灰度比值。

1.3.3 光鏡下觀察大鼠腎組織的病理變化 采用4%多聚甲醛用以固定大鼠的腎組織，后經(jīng)石蠟處理，再對(duì)其進(jìn)行切片，最后，按照HE染色，通過光鏡分別觀察3組大鼠腎組織的病理結(jié)構(gòu)變化。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用方差分析和q檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 腎組織中miR-146a和炎癥因子的mRNA表達(dá)水平 3組在miR-146a mRNA方面進(jìn)行比較，其在UR組中的表達(dá)水平較其他2組明顯上升(P<0.01)；在IL-1 mRNA方面表達(dá)的比較中，UR組較SR組有明顯下降(P<0.01)，與AR組對(duì)比，兩者差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；在IL-4 mRNA表達(dá)水平的比較中，UR組中IL-4 mRNA表達(dá)水平較其他2組明顯升高(P<0.01)；在IL-6 mRNA表達(dá)的比較中，UR組中IL-6 mRNA的表達(dá)較SR組明顯下降(P<0.01)，與AR組比較，兩者差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；在IL-10 mRNA表達(dá)的比較中，UR組中IL-10 mRNA表達(dá)水平較其他2組有明顯提升(P<0.01)；在TNF-α mRNA表達(dá)的比較中，UR組中TNF-α mRNA表達(dá)水平較其他2組有明顯下降(P<0.01)(見表2)。

2.2 腎組織中的TLR4、NF-κB蛋白表達(dá)水平 與SR組和AR組對(duì)比，UR組的TLR4和NF-κB蛋白表達(dá)水平均明顯降低(P<0.01)；與AR組相比，UR組的TLR4和NF-κB蛋白表達(dá)水平亦明顯降低(P<0.01)(見圖1、表3)。

2.3 腎組織在病理學(xué)方面的改變 光鏡下大鼠的腎組織：SR組的病理變化尤為顯著，可見明顯擴(kuò)張的腎小管，其中有壞死、脫落的細(xì)胞，近曲小管上皮細(xì)胞腫脹明顯，在小管間的血管有明顯的擴(kuò)張充血，且在間質(zhì)內(nèi)也存在較多浸潤(rùn)的炎性細(xì)胞。較SR組的腎組織病理改變，AR組變化稍輕，但仍可見管腔稍擴(kuò)張的腎小管，上皮細(xì)胞有少許腫脹，小管間存在充血的血管，且間質(zhì)內(nèi)也有散在的炎性細(xì)胞。UR組的腎組織病理改變較其他2組都有明顯減輕，其腎組織的結(jié)構(gòu)無明顯改變，間質(zhì)內(nèi)有零落的炎性細(xì)胞(見圖2)。

表2 3組腎組織中miR-146a和炎癥因子的mRNA表達(dá)水平

q檢驗(yàn)：與SR組比較*P<0．05；與*R組比較，△P<0．05

q檢驗(yàn)：與SR組比較*P<0．05；與AR組比較△P<0．05

3 討論

THS除創(chuàng)傷直接損傷重要臟器外，主要是由于創(chuàng)傷應(yīng)激及低血容量造成微循環(huán)功能障礙和組織灌注不足，從而產(chǎn)生損傷相關(guān)分子模式，觸發(fā)炎癥呈“瀑布樣”釋放，以致機(jī)體的免疫炎癥調(diào)控系統(tǒng)紊亂，加重組織器官損傷，引起多器官功能的衰竭[13-14]。近些年來，由于醫(yī)學(xué)研究和生活方式的不斷提升，THS引起的死亡率較前已稍有下降，但發(fā)病率依舊居高不下[15]。然而，目前與THS的相關(guān)研究多局限于復(fù)蘇液體的選擇，在微小RNA聯(lián)合信號(hào)通路方面的研究鮮少。miR-146a是近年研究炎癥、免疫和腫瘤等疾病的焦點(diǎn)之一，在今后的個(gè)體化治療中有很好的應(yīng)用前景[16]。HUANG等[17]研究發(fā)現(xiàn)miR-146a在腎缺血再灌注損傷中，具有保護(hù)腎臟功能有的作用。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)miR-146a在THS肺組織炎性損傷中表達(dá)升高，但其是否參與腎組織炎性反應(yīng)的調(diào)控及其初步機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

TLRs主要通過結(jié)合病原相關(guān)分子模式，活化諸如NF-κB、絲裂原活化蛋白激酶、c-Jun N端激酶、胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶等，參與感染、免疫、炎癥等多種疾病的病理生理過程[18-20]。TLR4是其目前研究最為前沿的族員之一，可激活NF-κB，使其磷酸化，釋放出大量炎癥介質(zhì)，是導(dǎo)致機(jī)體出現(xiàn)“炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)”的重要起因[21-22]。ZUSSO等[23]研究發(fā)現(xiàn)，TLR4/NF-κB 信號(hào)通路可能是調(diào)節(jié)促炎因子(如TNF-α和IL-1等)釋放的門控通道。另外，機(jī)體內(nèi)產(chǎn)生抑炎因子(如IL-10等)也與其關(guān)系密切[24]。因此，許多研究者開始著手探索可以干預(yù)TLR4/NF-κB 信號(hào)通路的相關(guān)藥物及治療措施，并取得了一定的成果[25-27]。

醋酸鈉林格液可用于補(bǔ)充創(chuàng)傷失血性休克大鼠的有效循環(huán)血量、調(diào)節(jié)水電解質(zhì)平衡、緩解微循環(huán)障礙、減輕組織器官損傷，是失血性休克復(fù)蘇的一線晶體液[28]。UTI是可以抑制蛋白酶作用的一種糖蛋白，有大量研究表明其具有調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)、改善免疫功能及清除氧自由基等作用，但研究其發(fā)揮抗炎作用的機(jī)制仍存在相當(dāng)大的空間。本實(shí)驗(yàn)在大鼠身上復(fù)制THS及其液體復(fù)蘇條件，從大鼠腎組織mRNA的表達(dá)中發(fā)現(xiàn)了UR組TNF-α、IL-1和IL-6的表達(dá)低于SR組和AR組；而IL-4、IL-10反而高于SR組和AR組。光鏡下，腎組織切片的HE染色結(jié)果也顯示出UR組的腎組織病理改變較其他2組有明顯減輕，表明了UTI有益于進(jìn)一步削弱THS大鼠導(dǎo)致的腎組織炎性損傷。同時(shí)，UR組較SR組、AR組的miR-146a mRNA表達(dá)水平有明顯提升；但在TLR4、NF-kB蛋白表達(dá)方面則恰恰相反。有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[29]，miR-146a減輕小腸缺血/再灌注損傷可能與抑制TLR4/NF-κB通路有關(guān)。所以，我們推測(cè)UTI在減輕失血性休克腎組織炎性損傷方面可能與其通過miR-146a作用于TLR4/NF-kB信號(hào)通路有一定的聯(lián)系。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)通過病理學(xué)和miR-146a、TLR4/NF-κB信號(hào)通路及相關(guān)炎癥因子在創(chuàng)傷失血性休克腎組織中表達(dá)水平的檢測(cè)，證實(shí)了UTI可以在醋酸鈉林格液的基礎(chǔ)上進(jìn)一步使THS腎組織免受炎性細(xì)胞浸潤(rùn)損傷。同時(shí)，我們推測(cè)UTI或許通過上調(diào)miR-146a在腎組織中的表達(dá)水平，抑制下游TLR4/NF-κB信號(hào)通路的傳導(dǎo)，繼而在THS中起保護(hù)作用，從而為THS的治療積累一定的實(shí)驗(yàn)素材及理論數(shù)據(jù)。但鑒于THS的發(fā)展涉及很多信號(hào)機(jī)制，仍需進(jìn)一步研究探索。