醋酸鈉林格液對(duì)失血性休克大鼠心肌炎性介質(zhì)及NF-κB、MAPK信號(hào)通路的影響

王振杰，徐志鵬，陳 硬，宋 琦

創(chuàng)傷失血性休克(THS)是創(chuàng)傷導(dǎo)致死亡最主要的原因之一[1]。嚴(yán)重失血、凝血功能障礙和嚴(yán)重感染以及繼發(fā)造成的全身炎癥反應(yīng)綜合癥及多器官功能障與死亡率直接相關(guān)[2]，有效控制出血和液體復(fù)蘇是提高生存率的主要治療措施。既往研究[3]表明，液體復(fù)蘇有益于THS組織灌注的恢復(fù)、組織缺氧的預(yù)防、細(xì)胞因子作用的減弱以及組織細(xì)胞凋亡的減少等。THS繼發(fā)的心肌損傷具有較差的生存率[4]，其機(jī)制尚不完全清楚，但心肌細(xì)胞中基因異常上調(diào)可調(diào)控相關(guān)蛋白和炎癥因子的表達(dá)，包括核因子κB(NF-κB)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)及白細(xì)胞介素(IL)-6等[5]。發(fā)生THS后，NF-κB激活炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，加快促炎因子如TNF-α的釋放[6]。研究[7-8]表明，絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號(hào)通路的激活對(duì)于失血性休克所致急性肝、肺損傷發(fā)揮重要介導(dǎo)作用，但其在THS所致心肌損傷中的研究較少。最近一項(xiàng)研究[9]表明，炎癥介質(zhì)的體外釋放受到MAPKs影響，如c-Jun NH2-末端激酶(JNK)、p38MAPK和細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ERK)。JNK在介導(dǎo)IL-6和TNF-α的表達(dá)中發(fā)揮重要作用[10]。MAPK磷酸酶(MKP-1)可通過(guò)去磷酸化導(dǎo)致包括JNK在內(nèi)的MAPK失活，調(diào)節(jié)MKP-1表達(dá)的機(jī)制對(duì)于確定MAPK磷酸化的持續(xù)時(shí)間和免疫應(yīng)答至關(guān)重要[11-12]。本研究旨在探討NF-κB、MKP-1及JNK在THS相關(guān)心肌損傷進(jìn)展中的潛在作用，探討醋酸鈉林格液相對(duì)常規(guī)復(fù)蘇液乳酸鈉林格液及對(duì)THS的早期復(fù)蘇效果，并進(jìn)一步驗(yàn)證通過(guò)調(diào)控NF-κB和MAPK信號(hào)表達(dá)保護(hù)THS相關(guān)心肌損傷的潛在作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 健康SD大鼠32只，SPF級(jí)，雌雄不限，體質(zhì)量(300±20)g，由上海杰思捷實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供(上海，中國(guó))。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物于室溫(22±1)℃、濕度45%～55%、12 h光照/黑暗周期條件下飼養(yǎng)7 d。醋酸鈉林格液購(gòu)于湖南康源制藥有限公司(瀏陽(yáng)，中國(guó))，0.9%氯化鈉溶液及乳酸鈉林格液購(gòu)于安徽環(huán)球藥業(yè)股份有限公司(蚌埠，中國(guó))，Trizol、UltraPure Agarose、Sybr qpcr mix、SuperScript Ⅲ RT 反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)于美國(guó)Invitrogen公司，JNK抗體、MKP-1抗體、p65(Ser536)抗體、p65(Lys310)抗體購(gòu)于MDL公司(北京，中國(guó))。

1.2 方法 SD大鼠隨機(jī)分為失血性休克未復(fù)蘇組(CR組)、0.9%氯化鈉溶液復(fù)蘇組(NR組)、乳酸鈉林格液復(fù)蘇組(LR組)和醋酸鈉林格液復(fù)蘇組(AR組)，各8只。4組大鼠均制備失血性休克模型：腹腔注射2%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)進(jìn)行麻醉，大鼠雙側(cè)腹股溝區(qū)備皮、消毒、鋪巾，分離股動(dòng)脈和股靜脈。右側(cè)股動(dòng)脈置管連接MedLab-U/4C501H生物信號(hào)采集處理系統(tǒng)，監(jiān)測(cè)平均動(dòng)脈壓(MAP)(2.5%枸櫞酸鈉沖洗測(cè)壓系統(tǒng))，左側(cè)股動(dòng)脈置管放血制作休克模型，右側(cè)股靜脈置管用于液體復(fù)蘇，左側(cè)股靜脈連接微量泵。置管后適應(yīng)20 min，用1 mL注射器(已預(yù)先填充枸櫞酸鈉溶液0.1 mL)從左側(cè)股動(dòng)脈以2 mL/3 min速度緩慢放血，直到MAP達(dá)30 mmHg，此過(guò)程大概需要20 min。通過(guò)緩慢回輸自體血或少量緩慢放血維持MAP(30 mmHg)60 min后，NR組、LR組和AR組大鼠經(jīng)右側(cè)股靜脈分別泵入0.9%氯化鈉溶液、乳酸鈉林格液、醋酸鈉林格液(速度<20 mL/h)，CR組誘導(dǎo)休克后不予以復(fù)蘇，觀察4 h。復(fù)蘇組(NR組、LR組和AR組)液體復(fù)蘇成功后(MAP維持在80 mmHg)，觀察4 h，處死大鼠，取心組織置于-80 ℃冰箱保存。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)蚌埠醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理和倫理委員會(huì)批準(zhǔn)進(jìn)行。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)大鼠心肌組織TNF-α mRNA、IL-4 mRNA及IL-10 mRNA相對(duì)表達(dá)量 用Trizol試劑盒提取大鼠心肌組織RNA：反轉(zhuǎn)錄應(yīng)用Invitrogen反轉(zhuǎn)錄試劑盒superscript Ⅲ配制反應(yīng)液，65 ℃滅活10 min去DNA，加入引物混合物，42 ℃逆轉(zhuǎn)錄60 min，置于85 ℃反應(yīng)10 min，滅活逆轉(zhuǎn)錄酶。反應(yīng)結(jié)束后置-20 ℃待用。將cDNA稀釋10倍，作為PCR模板加入引物反應(yīng)體系，于ABI 7900 qPCR儀上，按照95 ℃預(yù)變性2 min，94 ℃變性20 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，讀取Ct值并計(jì)算2-ΔΔCt，得到結(jié)果。各引物序列見(jiàn)列表1。

表1 目的基因引物序列

1.3.2 Western blotting法檢測(cè)大鼠心肌組織JNK磷酸化、MKP-1乙?；65(Ser536)磷酸化和P65(Lys310)乙?；鞍紫鄬?duì)表達(dá)量 取冷凍保存的大鼠心肌組織，加入裂解液作用1 min，離心30 min，取上清即細(xì)胞總蛋白置于-80 ℃冰箱凍存?zhèn)溆?。使用BCA 試劑盒檢測(cè)蛋白濃度，蛋白經(jīng)SDS-PAGE 分離后通過(guò)轉(zhuǎn)移電泳將凝膠上分離到的蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜。經(jīng)5%脫脂奶粉室溫封閉120 min后，加入相應(yīng)一抗4 ℃孵育過(guò)夜。TBST 洗膜3 次，加入堿性磷酸酶(AP)標(biāo)記的二抗室溫孵育60 min，TBST 洗膜3次，ECL化學(xué)發(fā)光、顯影、定影、拍照。計(jì)算目的蛋白與β-actin灰度值比值，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.3.3 大鼠心肌組織病理學(xué)檢查 大鼠心肌組織經(jīng)10%甲醛溶液內(nèi)固定，石蠟包埋且卡片，HE染色，在光鏡下進(jìn)行心肌組織形態(tài)學(xué)觀察。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用方差分析和q檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 大鼠心肌組織形態(tài)學(xué)觀察 誘導(dǎo)休克維持4 h后，CR組大鼠心肌細(xì)胞混濁腫脹，間質(zhì)水腫明顯，可見(jiàn)紅細(xì)胞外滲；復(fù)蘇成功后維持4 h，AR組大鼠心肌組織損傷程度較NR組和CR組明顯改善(見(jiàn)圖1)。

2.2 4組大鼠心肌組織相關(guān)細(xì)胞因子mRNA表達(dá)水平比較 THS復(fù)蘇成功4 h后，NR組、LR組和AR組大鼠心肌組織TNF-α mRNA表達(dá)水平均明顯低于CR組(P<0.01)，LR組和AR組IL-10 mRNA均高于CR組(P<0.05和P<0.01)，AR組IL-4 mRNA均明顯高于LR組、NR組和CR組(P<0.01)(見(jiàn)表2)。

分組nIL-4 mRNA IL-10 mRNA TNF-α mRNA CR組80.63±0.73 0.49±0.35 11.92±7.81 NR組81.45±1.142.46±1.454.33±2.72??LR組82.53±0.726.07±4.46?3.27±1.59??AR組86.97±4.39??##ΔΔ7.81±6.04??#1.33±0.80??F—11.82 6.07 9.63 P—<0.01 <0.01 <0.01 MS組內(nèi)—5.406 14.650 17.891

q檢驗(yàn)：與CR組比較*P<0.05，**P<0.01；與NR組比較#P<0.05，##P<0.01；與LR組比較ΔΔP<0.01

2.3 4組大鼠心肌組織p65(Ser536)磷酸化、p65(Lys310)乙酰化和JNK磷酸化、MKP-1乙酰化蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 復(fù)蘇成功4 h后，復(fù)蘇組大鼠p65(Ser536)磷酸化、p65(Lys310)乙酰化、JNK磷酸化蛋白相對(duì)表達(dá)量均低于CR組(P<0.05～P<0.01)，且AR組均低于NR組和LR組(P<0.05～P<0.01)；復(fù)蘇組MKP-1乙?；鞍紫鄬?duì)表達(dá)量均高于CR組(P<0.05～P<0.01)，且AR組和LR組均明顯高于CR組(P<0.01)(見(jiàn)圖2、表3)。

3 討論

全球每年大約有190萬(wàn)人因失血導(dǎo)致死亡，其中150萬(wàn)人死于創(chuàng)傷所致[3,13]。盡管隨著急救模式的不斷改進(jìn)和休克復(fù)蘇指南的普及學(xué)習(xí)，失血性休克早期復(fù)蘇成功率有了較大提高，但后期死亡率仍然居高不下，這可能與休克誘發(fā)機(jī)體細(xì)胞因子和炎性介質(zhì)失控性釋放，并由此介導(dǎo)全身炎癥反應(yīng)綜合癥、組織細(xì)胞損傷甚至多器官功能障有關(guān)[14]。創(chuàng)傷后繼發(fā)性心臟損傷是創(chuàng)傷病人預(yù)后的一個(gè)關(guān)鍵因素，但其機(jī)制尚未完全闡明。本研究通過(guò)建立THS模型，明確了NF-κB及MAPK信號(hào)通路在心肌炎癥損傷過(guò)程中發(fā)揮重要作用。

p50和p65是NF-κB在經(jīng)典激活途徑中研究最為常見(jiàn)的2個(gè)二聚體，并且p50和p65的激活與細(xì)胞存活和炎癥反應(yīng)的發(fā)生密切相關(guān)[15]。在細(xì)胞和組織遭受各種刺激或者損傷時(shí)可誘導(dǎo)p65發(fā)生磷酸化，特別是p65絲氨酸536位點(diǎn)磷酸化已成為轉(zhuǎn)錄激活新機(jī)制[16]。p65(Ser536)磷酸化通過(guò)增加組蛋白乙酰化酶與p65的結(jié)合進(jìn)而促進(jìn)p65(Lys310)乙?；?。p65乙酰化可增強(qiáng)與DNA 的結(jié)合能力，繼而增強(qiáng)NF-κB 對(duì)促炎因子的調(diào)控[17]。因此，本研究測(cè)定p65(Ser536)磷酸化及p65(Lys310)乙?；鞍紫鄬?duì)表達(dá)量來(lái)反映不同復(fù)蘇液復(fù)蘇對(duì)大鼠促炎核轉(zhuǎn)錄因子活性影響。

表3 4組大鼠p65(Ser536)磷酸化、p65(Lys310)乙?；?、JNK磷酸化和MKP-1乙酰化蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

q檢驗(yàn)：與CR組比較*P<0.05，**P<0.01；與NR組比較#P<0.05，##P<0.01；與LR組比較ΔP<0.05，ΔΔP<0.01

MAPK在受到細(xì)胞外多種刺激因素和信號(hào)分子，如缺血再灌注損傷、細(xì)胞因子、神經(jīng)遞質(zhì)、激素等刺激后，發(fā)生磷酸化而活化，并將細(xì)胞外界刺激信號(hào)放大并轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核內(nèi)，驅(qū)動(dòng)下游細(xì)胞因子以轉(zhuǎn)錄和非轉(zhuǎn)錄方式激活導(dǎo)致不同的細(xì)胞內(nèi)反應(yīng)[18-19]。JNK作為MAPK家族一員，其信號(hào)表達(dá)在維持細(xì)胞正常狀態(tài)和應(yīng)激表達(dá)過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵的調(diào)控作用[20-21]。MKP-1作為p38MAPK和JNK的底物，通過(guò)去磷酸化作用使MAPK失活，MKP-1表達(dá)機(jī)制的干預(yù)對(duì)于MAPK磷酸化的持續(xù)過(guò)程及免疫應(yīng)答的反應(yīng)時(shí)間至關(guān)重要[22]。因此，本研究測(cè)定JNK磷酸化及MKP-1乙?；磉_(dá)水平來(lái)反映不同復(fù)蘇液復(fù)蘇對(duì)大鼠MAPK信號(hào)通路的影響。

創(chuàng)傷性損傷后立即治療和抗休克處理已成為現(xiàn)代創(chuàng)傷救治的關(guān)鍵措施。除了手術(shù)控制出血外，液體復(fù)蘇仍然是最重要的挽救生命的干預(yù)措施之一，并且有證據(jù)[23]表明，對(duì)于大多數(shù)低血容量病人，推薦晶體液作為一線復(fù)蘇液體。然而關(guān)于最佳晶體液的選擇，臨床一直存有較大爭(zhēng)議。近來(lái)研究[24]表明，醋酸鈉林格液林格液作為一種新型平衡鹽溶液，與0.9%氯化鈉溶液及乳酸鈉林格液相比，能夠維持較高碳酸氫鹽水平及降低堿缺乏量，較少導(dǎo)致高血糖。有研究表明，在脂多糖誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞的炎癥反應(yīng)中，醋酸鈉能夠抑制p38和JNK的磷酸化，來(lái)抑制促炎細(xì)胞因子表達(dá)及提升抗炎細(xì)胞因子的水平進(jìn)而減輕其小膠質(zhì)細(xì)胞的炎癥[25]。本研究結(jié)果顯示，與0.9%氯化鈉溶液和乳酸鈉林格液比較，采用醋酸鈉林格液復(fù)蘇失血性休克大鼠，可明顯降低p65(Ser536)磷酸化及p65(Lys310)乙?；磉_(dá)水平。提示醋酸鈉林格液能夠下調(diào)失血性休克大鼠心組織p65(Ser536)磷酸化水平，從而阻止組蛋白乙?；概cp65結(jié)合，進(jìn)而逆轉(zhuǎn)了p65(Lys310)乙?；?。同時(shí)，醋酸鈉林格液復(fù)蘇失血性休克大鼠可提高大鼠心肌組織MKP-1乙酰化表達(dá)水平及降低JNK磷酸化表達(dá)水平。經(jīng)醋酸鈉林格液復(fù)蘇后，大鼠TNF-α表達(dá)水平明顯低于休克未復(fù)蘇組，我們推測(cè)醋酸鈉林格液通過(guò)抑制NF-κB及MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，減少下游致炎因子的釋放。

此外，IL-4和IL-10作為2種重要的抗炎因子均能夠通過(guò)下調(diào)炎性介質(zhì)包TNF-α和IL-1等，促進(jìn)體液免疫反應(yīng)[26]。動(dòng)物研究[27]表明，IL-10水平升高可以保護(hù)心臟細(xì)胞免受急性心肌炎的損害。本研究結(jié)果顯示，與乳酸鈉林格液和0.9%氯化鈉溶液比較，醋酸鈉林格液復(fù)蘇失血性休克大鼠可以明顯提高IL-4 mRNA表達(dá)水平，IL-10 mRNA表達(dá)水平亦明顯高于0.9%氯化鈉溶液，說(shuō)明醋酸鈉林格液能夠逆轉(zhuǎn)促炎因子和抗炎因子表達(dá)失衡，從而保護(hù)心肌損傷。

綜上，醋酸鈉林格液復(fù)蘇失血性休克大鼠，可通過(guò)抑制NF-κB及MAPK途徑減少致炎因子TNF-α水平，同時(shí)可以增加抗炎因子IL-4和IL-10水平來(lái)保護(hù)休克造成的心肌損傷。但該結(jié)論仍需要進(jìn)一步的基礎(chǔ)研究和臨床研究加以證實(shí)。