流動相pH值對離子型物質(zhì)分離的影響

劉珍 王彥 閆超

（上海交通大學(xué)藥學(xué)院 上海 200240）

在多物質(zhì)的液相色譜分離過程中，常常包含有酸堿離子型化合物，除了通過篩選色譜柱、更改流動相種類和比例等方式外，調(diào)節(jié)流動相的pH值常常是改善該類物質(zhì)分離度的有效手段。本文從理論上進行分析，并且輔以具體的實例，闡述了這一行為在色譜分離中的應(yīng)用和注意事項。

1.流動相pH值對分離的影響

流動相的pH值對酸堿離子型的物質(zhì)影響最為顯著，其保留與pH值的關(guān)系有詳細的理論分析[1]。簡單來說，酸性物質(zhì)在低pH條件下呈分子態(tài)，保留較強；在高pH條件下呈離子態(tài)，保留較弱。堿性物質(zhì)在高pH條件下呈分子態(tài)，保留較強；在低pH條件下呈離子態(tài)，保留較弱。

對于中性物質(zhì)，保留時間一般不受pH值影響，重現(xiàn)性相對比較好；對于離子型物質(zhì)，如上所述，在一定的pH值范圍內(nèi)，保留時間受pH值影響很明顯，特別是臨近pKa附近，微小的pH值波動就可能使保留時間出現(xiàn)較大的變化，導(dǎo)致方法的重現(xiàn)性較差。

圖1 不同pH值下離子型物質(zhì)的分子-離子態(tài)轉(zhuǎn)化和保留時間的變化

離子型物質(zhì)的離子化過程如下：

上圖從微觀和宏觀上很好的描述了這種現(xiàn)象[2]。

pH≤4時，酸性物質(zhì)HA主要以分子態(tài)[HA]形式存在，在色譜圖上表現(xiàn)為較強的保留（10min）；堿性物質(zhì)B以離子態(tài)的[BH+]形式存在，色譜圖上表現(xiàn)為幾乎無保留（1min）。

pH=5時，酸性物質(zhì)HA呈50%離子化狀態(tài)，在色譜圖上表現(xiàn)為保留減弱（6min）；堿性物質(zhì)B在此pH下仍舊以離子態(tài)[BH+]形式存在，色譜圖上仍無保留。

pH=7時，酸性物質(zhì)HA和堿性物質(zhì)B均主要以離子態(tài)[A-]和[BH+]形式存在，表現(xiàn)在色譜圖上為兩者均無保留（重合，1min）。

pH=9時，酸性物質(zhì)HA呈完全離子化狀態(tài)，色譜圖上無保留；堿性物質(zhì)B呈50%離子化狀態(tài)，在色譜圖上表現(xiàn)為保留增強（6min）。

pH≥10時，酸性物質(zhì)HA仍呈完全離子化狀態(tài)，色譜圖上無保留；堿性物質(zhì)B主要以分子態(tài)[B]形式存在，在色譜圖上表現(xiàn)為較強的保留（10min）。

2.合理認識流動相pH值在分離中的作用

pKa是一把雙刃劍。我們一方面希望流動相體系的pH值遠離被分離物質(zhì)的pKa來獲得穩(wěn)定的保留時間，但對于十余個物質(zhì)的混合溶液，常常沒法避開所有物質(zhì)的pKa；從另一個方面來說，正因為有pKa的存在，當(dāng)酸、堿物質(zhì)的流動相體系處于pKa附近時，保留時間可以很容易被精細調(diào)整，使得分離的可能性大大增加。

在實際的方法開發(fā)過程中，我們通過各個待分離物質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)式就能大致判斷哪些物質(zhì)是pH值敏感型。但這些pH值敏感型物質(zhì)在哪一個pH值范圍段內(nèi)敏感？敏感到什么程度？峰型如何？這些數(shù)據(jù)往往需要通過實驗來系統(tǒng)的了解，我們可以在大范圍的pH值內(nèi)（如pH值=2，4，6，8，10）進行初篩，然后根據(jù)結(jié)果進行小范圍的pH微調(diào)。

需要注意的是，上述分子-離子態(tài)轉(zhuǎn)化對離子型物質(zhì)的保留時間有非常顯著的影響，但不同pH環(huán)境只是影響該類物質(zhì)保留的因素之一。對于結(jié)構(gòu)較復(fù)雜的離子型物質(zhì)，對保留行為起主要作用的可能是該物質(zhì)中其他結(jié)構(gòu)與固定相的作用力，比如芳香族離子型分析物在苯基柱上，起主要作用的可能是π-π作用，不同pH值下分子-離子態(tài)對保留時間的敏感程度可能相對較低。因此，進行pH值的篩選，應(yīng)盡可能減少其他作用力，減少各影響因素。建議在封端的未進行鍵合基團改造的單純C18鍵合相的色譜柱上進行，其色譜行為更加可控。在各因素未能充分研究透徹的情況下，單因素考察是一個非常簡單有效的方式，可以提供規(guī)律性更強的信息。

3.pH值調(diào)節(jié)在色譜分離中的應(yīng)用

在一種降壓藥中8個雜質(zhì)與主成份的分離試驗。在8個待研究的雜質(zhì)中，有2個堿（雜質(zhì)A和F），1個酸（雜質(zhì)C），理論上來說，流動相的pH值能顯著影響這些物質(zhì)的保留。

選用pH值耐受范圍為1-12的Waters XBridge C18色譜柱，磷酸鹽-乙腈體系梯度洗脫。

圖2 8個雜質(zhì)在流動相pH4.0-pH10.0的色譜圖

上述雜質(zhì)中，雜質(zhì)A和雜質(zhì)F是帶有-NH2結(jié)構(gòu)的堿性物質(zhì)，在低pH下呈離子態(tài)，保留較弱，隨pH升高而保留增強；雜質(zhì)C是帶-COOH結(jié)構(gòu)的可電離的復(fù)雜物質(zhì)，在高pH下呈離子態(tài)，保留較弱，隨pH降低而保留增強。

上圖中可以明顯看出這些酸堿雜質(zhì)隨流動相pH變化導(dǎo)致保留時間變化的情況，可以收集到如下信息：

（1）堿性雜質(zhì)F在pH6.0～pH8.0對流動性pH值最敏感。

（2）堿性雜質(zhì)A在pH6.0以下時，對流動相pH較為敏感，pH在6.0以上，保留時間趨于穩(wěn)定。

（3）酸性雜質(zhì)C在pH值6.0以下時，對流動相的pH較為敏感；且在pH6.0以下時，可能因其分子態(tài)/離子態(tài)同時存在而導(dǎo)致峰形拖尾現(xiàn)象；當(dāng)pH值在6.0以上時，電離較為完全，保留時間基本固定。

（4）pH8.0～10.0間，雜質(zhì)F和C分離度較小，且位置互換，應(yīng)盡量避免此段。

初篩4個pH后，考慮到雜質(zhì)C的峰形，且雜質(zhì)F在雜質(zhì)A和C的空間要大于雜質(zhì)C和G的空間，最終細篩pH值為7.7，各雜質(zhì)的分離度和峰型良好。

4.討論

離子型物質(zhì)的分離還有其他的選擇，如使用離子對試劑增強保留時間和達到分離的目的。但離子對分析方法本身存在很多局限，主要是效率低下，無法兼容質(zhì)譜，以及會對色譜柱的填料造成難以逆轉(zhuǎn)的保留行為改變，這在實際應(yīng)用過程中會帶來諸多不便。此外，通過特殊的色譜柱，如離子交換色譜柱、Hillc等實現(xiàn)離子型物質(zhì)的保留和分離，也是一種積極的嘗試。