黃金膠囊對2型糖尿病大鼠肝組織eIF2α及GRP78表達(dá)的影響

余臣祖 秦雙紅 高攀 張朝寧

摘要：目的? 觀察黃金膠囊對2型糖尿?。═2DM）大鼠肝組織eIF2α、GRP78表達(dá)的影響，探討其可能的作用機制。方法? 采用高糖高脂飼料喂養(yǎng)聯(lián)合小劑量鏈脲佐菌素腹腔注射制作T2DM大鼠模型。成模大鼠隨機分為模型組、羅格列酮組和黃金膠囊低、中、高劑量組，另取8只大鼠為正常組。各給藥組給予相應(yīng)藥物灌胃，模型組和正常組給予生理鹽水灌胃，連續(xù)10周。Western blot和RT-PCR分別檢測大鼠肝組織eIF2α、GRP78蛋白和mRNA的表達(dá)，HE染色觀察肝組織病理形態(tài)。結(jié)果? 與正常組比較，模型組大鼠eIF2α、GRP78蛋白和mRNA表達(dá)均明顯升高（P<0.05）;與模型組比較，各給藥組大鼠eIF2α mRNA表達(dá)明顯降低（P<0.05），羅格列酮組較黃金膠囊中、低劑量組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），黃金膠囊高劑量組與羅格列酮組作用相當(dāng)（P>0.05）。HE染色顯示黃金膠囊各劑量組大鼠肝臟病理損害減輕，高劑量組減輕最明顯。結(jié)論? 黃金膠囊可抑制模型大鼠肝組織eIF2α、GRP78表達(dá)的上調(diào)，減輕病理損害，從而改善肝組織內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，降低血糖。

關(guān)鍵詞：黃金膠囊;糖尿病;內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激;大鼠

中圖分類號：R285.5? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A? ? 文章編號：1005-5304（2020）02-0028-05

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.201906074

Effects of Huangjin Capsules on Expressions of eIF2α and GRP78

in Liver of Type 2 Diabetes Mellitus Rats

YU Chenzu1，2， QIN Shuanghong1， GAO Pan1， ZHANG Chaoning1

1. Gansu University of Chinese Medicine， Lanzhou 730101， China;

2. Affiliated Hospital of Gansu University of Chinese Medicine， Lanzhou 730020， China

Abstract： Objective To explore the effects of Huangjin Capsules on the expressions of eIF2 and GRP78 in the liver of type 2 diabetes mellitusrats （T2DM）; To explore its possible mechanism of action. Methods T2DM rat model was established by high-sugar and high-fat diet combined with intraperitoneal injection of low-dose streptozotocin. The model rats were randomly divided into model group， rosiglitazone group， Huangjin Capsules low-， medium- and high-dosage groups. Another 8 rats were chosen as normal control group. Each administration group was given relevant medicine for gavage， while model group and normal control group were given saline for gavage， for consecutive 10 weeks. Western blot and RT-PCR were used to detect theprotein and mRNA expressions of eIF2α and GRP78 in rat liver tissue. HE staining was used to observe the pathological morphology of liver tissue. Results Compared with the normal control group， the protein and mRNA expressions of EIF2 and GRP78 significantly increased in the model group （P<0.05）. Compared with model group， eIF2 mRNA expressions decreased in both rosiglitazone group and Huangjin Capsules medium- and low-dosage groups， with statistical significance （P<0.05）. The effects of Huangjin Capsules high-dosage group were the same as rosiglitazone group. HE staining showed that the liver pathological damage was alleviated in the rats in Huangjin Capsules groups， and the most significant reduction was observed in the high-dosage group. Conclusion Huangjin Capsules can inhibit theup-regulation of expressions of eIF2 and GRP78 in liver tissue of model rats and reduce pathological damage， so as to improve the liver endoplasmic reticulum stress and reduce blood glucose.

Keywords： Huangjin Capsules; type 2 diabetes mellitus; endoplasmic reticulum stress; rats

2型糖尿?。═2DM）是由多種原因引起的以慢性高血糖為特征的代謝性、系統(tǒng)性疾病，其病理機制是胰島素分泌不足和/或胰島素抵抗（IR）[1-2]。目前研究顯示，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（ERS）、IR與糖尿病的發(fā)生密切相關(guān)[3-4]。黃金膠囊由溫膽湯化裁而來，全方具有清熱解毒、運脾化濁功效。前期研究顯示，黃金膠囊能降低血糖，改善IR[5-6]。本實驗通過觀察肝組織ERS標(biāo)志分子eIF2α、GRP78的表達(dá)，探討黃金膠囊治療T2DM的可能作用機制。

1? 實驗材料

1.1? 動物

雄性Wistar大鼠60只，SPF級，體質(zhì)量（200±20）g，2～3月齡，甘肅中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供，動物許可證號SCXK（甘）2015-0002。飼養(yǎng)于甘肅中醫(yī)藥大學(xué)SPF級實驗動物中心，溫度20～25 ℃，相對濕度40%～70%，自由攝食飲水。

1.2? 藥物

黃金膠囊（黃連9 g，雞內(nèi)金12 g，法半夏9 g，竹茹15 g，枳實9 g，陳皮9 g，茯苓15 g，炙甘草9 g），甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，批號171103;羅格列酮片，重慶涪陵制藥廠有限公司，批號20170203。

1.3? 主要試劑與儀器

鏈脲佐菌素（STZ，北京索萊寶科技有限公司，批號641J03），eIF2α（GeneTex，批號42774），GRP78（GeneTex，批號42606）。臺式電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司，型號DZF-OB），Western blot轉(zhuǎn)膜儀（北京六一生物科技有限公司，型號DYY-6D），Western blot電泳儀（北京六一生物科技有限公司，型號DYY-6D），搖床（德國IKA，型號SK-O180-E），酶標(biāo)儀（美國BIO-RAD，型號iMark），恒溫培養(yǎng)箱（澳柯瑪股份有限公司，型號BC/BD-208HNE），血糖儀（美國強生，型號02211601B），滅菌鍋（上海申安醫(yī)療器械廠，型號LDZX-50KBS），高速低溫臺式離心機（德國Eppendorf公司，型號TGL-16），超低溫冰箱（美國Thermo，型號DW-HL528），實時定量PCR儀（美國Agilent，型號Applied Biosystems Step One PlusTM），渦旋振蕩器（美國賽洛捷克，型號MX-S），小型離心機（美國賽洛捷克，型號D1008E），NanoDrop核酸濃度測量儀（美國Thermo，型號NanoDropOne）。

2? 實驗方法

2.1? 分組、造模及給藥

普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，禁食12 h，尾靜脈采血測空腹血糖。血糖4.77～7.77 mmol/L大鼠入選[7]，其中5只大鼠不達(dá)標(biāo)。入選的55只大鼠按體質(zhì)量編號，按隨機數(shù)字表法分為正常組8只、造模組47只，造模組大鼠給予高糖高脂飼料喂養(yǎng)，正常組給予普通飼料喂養(yǎng)[8]。自由飲水，飼養(yǎng)4周后，記錄大鼠體質(zhì)量，造模組大鼠空腹12 h，單次腹腔注射STZ 35 mg/kg，72 h后測定大鼠血糖，空腹血糖（FBG）≥11.0 mmol/L或餐后血糖≥16.7 mmol/L大鼠納入模型實驗組，STZ注射后2周末復(fù)測大鼠血糖，未達(dá)標(biāo)者均剔除，不作為實驗用鼠。將成模大鼠隨機分為模型組、羅格列酮組和黃金膠囊高、中、低劑量組，每組8只，成模大鼠均繼續(xù)給予高糖高脂飼料喂養(yǎng)，正常組給予普通飼料喂養(yǎng)，按人與大鼠體表面積折算及前期實驗研究[6]予相應(yīng)劑量藥物，黃金膠囊高劑量2.025 g/kg、中劑量1.265 g/kg、低劑量0.675 g/kg，羅格列酮0.5 mg/kg，正常組和模型組給予等量生理鹽水。每日1次，連續(xù)10周。

2.2? 指標(biāo)檢測

灌胃結(jié)束后，隔夜禁食、禁水12 h，采血測FBG;取肝組織置于凍存管，-80 ℃冰箱保存?zhèn)錂z。

2.2.1? RT-PCR檢測eIF2α、GRP78 mRNA表達(dá)

采用Trizol法從大鼠肝組織中提取RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以cDNA為模板，采用兩步法PCR反應(yīng)程序：95 ℃、120 s;95 ℃、30 s，60 ℃、60 s，40個循環(huán)，以β-actin為內(nèi)參，用2-ΔΔCt計算mRNA的相對表達(dá)量。引物序列見表1，引物設(shè)計合成由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

2.2.2? Western blot檢測eIF2α、GRP78蛋白表達(dá)

取200 mg冷凍的肝組織樣本提取組織蛋白，BCA法行蛋白定量，蛋白樣本變性，SDS-PAGE，轉(zhuǎn)膜，免疫雜交反應(yīng)，最后曝光顯影觀察，運用Quantity One軟件進(jìn)行光密度定量分析，以各目的蛋白條帶灰度值與相應(yīng)內(nèi)參的條帶灰度值比計算各目的蛋白相對表達(dá)量。

2.2.3? HE染色

取肝組織4%甲醛固定，石蠟包埋，HE染色，鏡下觀察肝組織病理形態(tài)學(xué)變化。

3? 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS20.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，計量資料以—x±s表示，多組間比較采用方差分析，多重比較用LSD法，若方差不齊時用Games-Howell方法分析。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

4? 結(jié)果

4.1? 黃金膠囊對大鼠空腹血糖的影響

與正常組比較，模型組大鼠FBG明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;與模型組比較，羅格列酮組和黃金膠囊各劑量組大鼠FBG明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;黃金膠囊中、低劑量組效果不及羅格列酮組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;黃金膠囊高劑量組與羅格列酮組作用相當(dāng)，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)果見表2。

4.2? 黃金膠囊對大鼠肝組織eIF2α、GRP78 mRNA表達(dá)的影響

與正常組比較，模型組大鼠肝組織eIF2α、GRP78 mRNA表達(dá)明顯升高（P<0.05）;與模型組比較，羅格列酮組和黃金膠囊各劑量組大鼠肝組織eIF2α mRNA表達(dá)明顯降低（P<0.05），黃金膠囊中、低劑量組效果不及羅格列酮組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），黃金膠囊高劑量組與羅格列酮組作用相當(dāng)，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）;與羅格列酮組比較，羅格列酮組和黃金膠囊高、中劑量組GRP78 mRNA表達(dá)均明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;與羅格列酮組比較，黃金膠囊中劑量組效果不及羅格列酮組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），黃金膠囊高劑量組與羅格列酮組作用相當(dāng)，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)果見表3。

4.3? 黃金膠囊對大鼠肝組織eIF2α、GRP78蛋白表達(dá)的影響

與正常組比較，模型組大鼠肝組織eIF2α、GRP78蛋白表達(dá)明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;與模型組比較，羅格列酮組和黃金膠囊組大鼠肝組織eIF2α、GRP78蛋白表達(dá)明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），黃金膠囊中、低劑量組效果不及羅格列酮組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），黃金膠囊高劑量組與羅格列酮組作用相當(dāng)，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)果見表4、圖1。

4.4? 黃金膠囊對大鼠肝組織病理形態(tài)的影響

正常組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝索排列規(guī)則，細(xì)胞核結(jié)構(gòu)清晰，染色均勻，未見明顯的脂肪變性、壞死，無界面性炎癥及纖維化;模型組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)破壞，肝索排列紊亂，染色變淺，肝細(xì)胞體積變大，出現(xiàn)明顯的氣球樣變性，并伴有大量的炎性細(xì)胞浸潤及肝組織脂肪沉積;羅格列酮組大鼠大部分肝小葉結(jié)構(gòu)接近正常，肝細(xì)胞排列較為整齊，偶見少量炎性細(xì)胞浸潤，可見少量肝細(xì)胞氣球樣變性及脂肪性病變，肝臟脂肪組織沉積明顯減少，較模型組病變程度明顯減輕;黃金膠囊各劑量組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)逐漸清晰，肝索排列基本規(guī)則，肝細(xì)胞氣球樣變性及脂肪性病變明顯減輕，炎細(xì)胞浸潤及肝組織脂肪沉積均明顯減少，黃金膠囊高劑量組改善最明顯。見圖2。

5? 討論

研究顯示，胰島素與胰島素受體結(jié)合后主要通過2條途徑將信號下傳至效應(yīng)器：一是經(jīng)胰島素受體底物（IRS）和磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）的代謝信號通路;另一個通路是經(jīng)促分裂原活化蛋白激酶（MAPK）調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞增殖的生長信號通路[9-10]。研究發(fā)現(xiàn)，ERS可通過影響上述2條信號通路誘導(dǎo)肝臟IR的形成，促進(jìn)T2DM的發(fā)生[11]。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是哺乳動物細(xì)胞重要的Ca2+貯存器，也是蛋白質(zhì)合成與翻譯后修飾，多肽鏈正確折疊與裝配的重要場所[12]。某些情況下如缺氧缺血、高血糖、化學(xué)毒物等使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔Ca2+耗竭、蛋白質(zhì)糖基化抑制、二硫鍵錯配，均可導(dǎo)致未折疊或錯誤折疊蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中蓄積，發(fā)生ERS。GRP78是促進(jìn)蛋白質(zhì)正確折疊的重要分子伴侶，GRP78表達(dá)上調(diào)是ERS的重要標(biāo)志之一。發(fā)生ERS時，PERK與GRP78解離后，發(fā)生自身磷酸化，并使eIF2α磷酸化，阻止新蛋白質(zhì)的合成。PERK與eIF2α的磷酸化被認(rèn)為是發(fā)生ERS的標(biāo)志[13-15]。

中醫(yī)認(rèn)為，人體是一個有機整體，五臟六腑功能協(xié)調(diào)，氣血化生有源，則病無由以生;若外感六淫或七情致五臟六腑功能失調(diào)，氣、血、津液運化失常，痰、飲、濁、瘀等停滯，對機體產(chǎn)生毒害作用而致發(fā)病，這種有形的病理產(chǎn)物皆可稱為濁毒。情志失調(diào)，肝氣郁結(jié)，橫逆克犯脾土，致脾胃虛弱，運化失司，痰飲由生;肝氣不舒，久郁化火，木火邢金，煎津成痰;肝氣郁結(jié)，脾胃失司，氣機運行受阻，血之統(tǒng)帥作用減弱，血停不運而為瘀;氣血停滯，脈道受阻，瘀血內(nèi)生而化為血濁。濁毒既是致病因素，又是病理產(chǎn)物，可流注于四肢關(guān)節(jié)、臟腑百骸而致病。濁毒流于肝臟，影響肝的正常生理功能，而引發(fā)肝臟內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，產(chǎn)生IR，致糖尿病的發(fā)生和發(fā)展。

黃金膠囊切合糖尿病濁毒病理機制，方中黃連味苦性寒，歸心、脾、胃、膽、大腸經(jīng)，清熱燥濕、瀉火解毒、止消渴，雞內(nèi)金甘、平，歸脾、胃、小腸、膀胱經(jīng)，具有醒脾消食、化積滯、縮小便之功，二者共為君藥，對于脾胃一瀉一補，對于痰濁一解一化，標(biāo)本兼治，起到化濁解毒之功效，以治消渴;法半夏體滑而性燥，健脾燥濕，溫胃降逆，竹茹開胃土之郁，清肺金之燥，膽和則煩嘔自止，陳皮以辛散之，以苦燥之，調(diào)中而快膈，消痰而導(dǎo)滯，枳實破氣，痰化而痞脹消，四者共為臣藥;茯苓為佐，味甘、淡，性平，歸心、肺、脾、腎經(jīng)，具有益脾除濕、利竅寧心之功，脾健而痰無以生;炙甘草味甘氣溫，補三焦元氣而散表寒，調(diào)和諸藥，為使藥。全方寒溫并用，補瀉兼施，達(dá)到清熱解毒、運脾化濁之效。

本實驗采用高脂高糖飼料喂養(yǎng)加腹腔注射鏈脲佐菌素制作T2DM大鼠模型。病理結(jié)果顯示，模型組大鼠肝臟出現(xiàn)明顯的病理損害，作為ERS發(fā)生的分子標(biāo)志，eIF2α、GRP78蛋白與mRNA表達(dá)均明顯升高，表明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能紊亂對肝細(xì)胞功能造成影響進(jìn)而導(dǎo)致肝臟病理損害的發(fā)生，T2DM大鼠肝臟ERS程度較正常大鼠顯著增強。與模型組比較，黃金膠囊各劑量組大鼠肝組織eIF2α、GRP78蛋白及mRNA表達(dá)明顯降低，肝臟病理損害明顯改善，提示黃金膠囊可通過降低eIF2α、GRP78表達(dá)起到保護(hù)肝組織ERS的作用。

綜上所述，鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的T2DM模型大鼠肝組織中存在eIF2α、GRP78基因表達(dá)的異常，黃金膠囊通過降低eIF2α、GRP78表達(dá)而改善ERS，從而發(fā)揮其治療T2DM的作用。

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（收稿日期：2019-06-06）

（修回日期：2019-07-09;編輯：華強）

基金項目：甘肅省自然科學(xué)基金（1610RJZA074）

通訊作者：張朝寧，E-mail：1754648867@qq.com