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    內(nèi)源性神經(jīng)營養(yǎng)因子促進(jìn)冷凍保存大鼠坐骨神經(jīng)異體移植后神經(jīng)再生的作用

    2020-04-26 23:02:00張松黃英如石一峰劉云霄冼華
    中國康復(fù)理論與實踐 2020年4期
    關(guān)鍵詞:施萬異體移植術(shù)

    張松,黃英如,石一峰,劉云霄,冼華

    1.重慶醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院針灸骨傷教研室,重慶市 400016;2.中醫(yī)藥防治代謝性疾病重慶市重點實驗室,重慶市 400016

    周圍神經(jīng)損傷常引起支配區(qū)域運動和感覺功能缺失,致殘率高。近年來,隨著基因治療和組織工程等技術(shù)的發(fā)展,周圍神經(jīng)損傷的治療取得長足的進(jìn)步,但周圍神經(jīng)缺損的修復(fù)與重建仍未取得突破[1-2]。自體神經(jīng)移植是臨床修復(fù)周圍神經(jīng)缺損(尤其是長段缺損)的金標(biāo)準(zhǔn),但存在供區(qū)能滿足移植需要的神經(jīng)有限、造成新的失神經(jīng)損傷等缺點,限制了臨床應(yīng)用。同種異體神經(jīng)具有與自體神經(jīng)相同的組織結(jié)構(gòu),可以為周圍神經(jīng)缺損修復(fù)提供各種類型的神經(jīng)移植物;而周圍神經(jīng)冷凍保存,能夠為周圍神經(jīng)缺損提供充足的、即時需要的各種類型的神經(jīng)移植物,從而使同種異體神經(jīng)代替自體神經(jīng)修復(fù)周圍神經(jīng)長段缺損成為可能[3-4]。

    去細(xì)胞神經(jīng)移植物可體外長期保存,具有較低的免疫原性,異體移植后能支持受者神經(jīng)軸突再生[5-6]。施萬細(xì)胞是周圍神經(jīng)的主要結(jié)構(gòu)和功能細(xì)胞,能合成和分泌多種神經(jīng)營養(yǎng)因子(neurotrophic factors,NTFs)和黏附分子,對周圍神經(jīng)損傷后的神經(jīng)再生極為重要[7]。去除施萬細(xì)胞的周圍神經(jīng),修復(fù)神經(jīng)缺損特別是長段神經(jīng)缺損后受者神經(jīng)再生能力可能有限[8-9]。有學(xué)者在去細(xì)胞神經(jīng)移植物中添加施萬細(xì)胞,異體移植后的神經(jīng)再生和功能恢復(fù)明顯優(yōu)于單純?nèi)ゼ?xì)胞異體移植[10]。因此,周圍神經(jīng)冷凍保存時維持施萬細(xì)胞的生物活性,對神經(jīng)移植后的神經(jīng)再生具有積極作用。我們的前期研究證實[11],周圍神經(jīng)冷凍保存能維持施萬細(xì)胞的生物活性,異體移植后的排斥反應(yīng)較弱,能支持移植后的神經(jīng)再生。

    內(nèi)源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(endogenous neurotrophic factors,ENTFs)是一類調(diào)節(jié)神經(jīng)元生長、存活和分化的多肽類物質(zhì),主要由施萬細(xì)胞合成和釋放,廣泛存在于動物體內(nèi)多種組織中[12]。周圍神經(jīng)損傷后,其遠(yuǎn)端發(fā)生Wallerian變性,施萬細(xì)胞失去與軸突的連接,在轉(zhuǎn)錄因子c-Jun的作用下去分化,轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂写僭偕硇偷男迯?fù)施萬細(xì)胞,分泌大量活性增強(qiáng)的ENTFs,從而修復(fù)受損神經(jīng)元,加速軸突再生[13-15]。然而,在神經(jīng)移植后的局部微環(huán)境中,由于施萬細(xì)胞分泌的NTFs濃度過低,可能不足以維持神經(jīng)元胞體的存活和軸突再生,出現(xiàn)施萬細(xì)胞基底膜破壞,導(dǎo)致遠(yuǎn)端軸突長入困難甚至移植失敗[16-17]。

    本研究體外預(yù)處理大鼠坐骨神經(jīng),模擬周圍神經(jīng)Wallerian變性,誘導(dǎo)施萬細(xì)胞表達(dá)ENTFs,并觀察施萬細(xì)胞的凋亡情況和免疫原性變化,然后將表達(dá)ENTFs的周圍神經(jīng)冷凍保存,觀察冷凍保存后神經(jīng)的生物活性,及同種異體移植后對神經(jīng)再生的影響,以探討ENTFs促進(jìn)冷凍保存周圍神經(jīng)異體移植后神經(jīng)再生的可能性。

    1 材料與方法

    1.1 實驗動物

    SPF級雌性Sprague-Dawley大鼠138只,體質(zhì)量(200±20) g,重慶醫(yī)科大學(xué)動物中心提供,動物生產(chǎn)許可證號SCXK(渝)2012-0001。SPF級雌性Wistar大鼠153只,體質(zhì)量(200±20)g,成都達(dá)碩實驗動物有限公司提供,動物生產(chǎn)許可證號SCXK(川)2015-030。根據(jù)《醫(yī)學(xué)實驗動物管理實施細(xì)則》和重慶醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)研究倫理委員會的要求,所用動物實驗研究均嚴(yán)格按照動物福利與倫理原則處理。12 h黑白交替,相對濕度為65%~75%,室溫22~24 ℃。

    1.2 試劑與儀器

    膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(glial cell line-derived neurotrophicfactor,GDNF)、神經(jīng)生長因子(nerve growth factor,NGF)、主要組織相容性復(fù)合體(major histocompatibility complex,MHC)-Ⅱ、CD8單克隆抗體:美 國ABCAM公 司。Bcl-2、Bax、Caspase-3、MHC-Ⅰ單克隆抗體:美國AFFⅠNⅠTY公司。CD68單克隆抗體:美國NOVUS公司。β-actin單克隆抗體:北京博奧森生物技術(shù)有限公司。GAPDH單克隆抗體、山羊抗兔ⅠgG二抗、山羊抗鼠ⅠgG二抗:美國EARTHOX公司。神經(jīng)絲(neurofilament,NF)200單 克隆抗體:武漢博士德生物工程有限公司。高糖型DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)、DMSO:美國HYCLONE公司。雙抗(青霉素-鏈霉素):上海碧云天生物技術(shù)有限公司。海藻糖:北京索萊寶科技有限公司。乙二醇:成都市科龍化工試劑廠。triton X-100:北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司。Calcein-AM:日本東仁化學(xué)科技有限公司。碘化丙啶(propidium iodide,PⅠ):武漢賽維爾生物科技有限公司。BCA蛋白濃度測定試劑盒:上海碧云天生物技術(shù)有限公司。大鼠白細(xì)胞介素(interleukin,ⅠL)-2、干擾素(interferon,ⅠFN)-γ、腫 瘤 壞 死 因 子(tumor necrosis factor,TNF)-α ELⅠSA試劑盒:上海滬尚生物科技有限公司。

    電泳儀、凝膠成像系統(tǒng):美國BⅠO-RAD公司。H-7500型透射電鏡:日本HⅠTACHⅠ公司。TCS-SP2型激光掃描共聚焦顯微鏡:德國LEⅠCA公司。BL-420N機(jī)能實驗系統(tǒng):成都泰盟。BX53正置顯微鏡:日本OLYMPUS公司。低溫高速離心機(jī):德國SⅠGMA公司。

    1.3 動物造模與分組

    1.3.1 坐骨神經(jīng)取材及體外預(yù)處理

    將138只Sprague-Dawley大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)5 d后,隨機(jī)取12只備用(9只作為移植階段供體大鼠,3只用作凍存后新鮮神經(jīng)對照組),余126只2%戊巴比妥鈉30 mg/kg腹腔注射麻醉,無菌條件下切取雙側(cè)坐骨神經(jīng)段15 mm,0.9% NaCl注射液沖洗,切取神經(jīng)后大鼠斷頸處死。隨機(jī)將252條坐骨神經(jīng)置于含有10%FBS和1%青霉素-鏈霉素的高糖型DMEM預(yù)處理液中,37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)1 d (A組,n=42)、3 d (B組,n=42)、7 d (C組,n=42)、14 d (D組,n=42)和21 d(E組,n=42),每2天換液,設(shè)置新鮮神經(jīng)對照組(F組,n=42)。

    1.3.2 冷凍保存液配制、坐骨神經(jīng)冷凍保存及復(fù)溫

    在高糖型DMEM溶液(含0.2 mol/L海藻糖、10%FBS、1%青霉素-鏈霉素)中分別加入5%乙二醇和5%DMSO、10%乙二醇和10% DMSO、20%乙二醇和20%DMSO,配制成含5%、10%、20%冷凍保護(hù)劑的冷凍保存液。

    將上述6組坐骨神經(jīng)依次分別置于含5%、10%冷凍保護(hù)劑的冷凍保存液中室溫靜置各10 min,然后置于含20%冷凍保護(hù)劑的冷凍保存液中,4 ℃放置30 min,-20 ℃放置1 h,-80 ℃放置1 h,最后將其置于液氮中保存4周。

    坐骨神經(jīng)在液氮中保存4周后,置于37 ℃水浴鍋中復(fù)溫3 min,然后依次置于含10%、5%冷凍保護(hù)劑的冷凍保存液中各10 min,最后置于高糖型DMEM溶液(含10%FBS和1%青霉素-鏈霉素)中。

    1.3.3 移植術(shù)受體分組及手術(shù)方法

    健康成年SPF級雌性Wistar大鼠153只,其中144只作為受體大鼠,9只作為供體大鼠。另取上述9只Sprague-Dawley大鼠為供體大鼠。用上述冷凍保存后的A組、B組、C組、D組、E組、F組坐骨神經(jīng)(每組取18條)和9只Sprague-Dawley大鼠新鮮坐骨神經(jīng)(G組,n=18)修復(fù)對應(yīng)Wistar大鼠(A′組、B′組、C′組、D′組、E′組、F′組、G′組)坐骨神經(jīng)10 mm缺損,設(shè)置Wistar大鼠同系移植對照組(H′組),每組18只。

    手法方法:受體大鼠術(shù)前禁食12 h,2%戊巴比妥鈉30 mg/kg腹腔注射麻醉,剃毛,常規(guī)消毒、鋪巾,于右股后外側(cè)行斜行切口,沿肌間隙鈍性分離,暴露、游離坐骨神經(jīng)干,于梨狀肌下緣5 mm處整齊切除坐骨神經(jīng)造成10 mm缺損;將供體神經(jīng)段整齊修剪至10 mm,6倍手術(shù)顯微鏡下,以9-0帶線縫合針行神經(jīng)外膜無張力間斷縫合4~6針,0.9%氯化鈉注射液沖洗術(shù)區(qū),4-0縫合線逐層縫合,麻醉蘇醒后按組分籠飼養(yǎng)。手術(shù)均由同一人操作完成,術(shù)后大鼠均不做特殊處理。

    1.4 檢測指標(biāo)

    1.4.1 Western blotting

    冷凍保存前,取各組神經(jīng)組織約30 mg (從18條坐骨神經(jīng)中取出),剪碎,加入10 ml/kg裂解液,冰上裂解15 min,勻漿后4 ℃靜置1 h,4 ℃、12 000 r/min離心15 min,取上清,BCA蛋白濃度測定試劑盒檢測濃度。

    上樣量100 μg,12% SDS-PAGE凝膠電泳,70 V電泳30 min后100 V電泳80 min,恒流300 mA轉(zhuǎn)膜90 min至PVDF膜上,5%脫脂牛奶室溫封閉2 h,TBST洗膜,加一抗(GDNF 1∶5000;NGF 1∶10000;Bcl-2 1∶1000;Bax 1∶1000;Caspase-3 1∶1000;βactin 1∶5000;MHC-Ⅰ1∶2000;MHC-Ⅱ1∶1000;GAPDH 1∶5000)4 ℃孵育過夜,TBST洗膜,加相應(yīng)二 抗(山羊抗兔ⅠgG 1∶10000;山羊抗鼠ⅠgG 1∶10000)室溫孵育2 h,TBST洗膜,ECL顯色,凝膠成像系統(tǒng)成像,GDNF、NGF、Bcl-2、Bax、Caspase-3以β-actin為內(nèi)參,MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ以GAPDH為內(nèi)參;用Ⅰmage J軟件進(jìn)行定量分析,分別用目的蛋白與內(nèi)參蛋白的灰度值比值表示蛋白的相對表達(dá)量。生物學(xué)重復(fù)6次。

    1.4.2 冷凍保存后坐骨神經(jīng)生物活性

    Calcein-AM/Propidium Ⅰodide熒光染色,激光共聚焦顯微鏡觀察冷凍保存后坐骨神經(jīng)細(xì)胞存活與死亡情況。取上述冷凍保存4周后未用于移植的坐骨神經(jīng),每組6條,復(fù)溫,另取上述備用3只Sprague-Dawley大鼠,切取坐骨神經(jīng)6條作為新鮮神經(jīng)對照組(G組),剪切成長3 mm神經(jīng)段,室溫下1% triton X-100通透30 min,PBS緩沖液沖洗,Calcein-AM 20 μmol/L避光孵育30 min,PBS緩 沖液沖洗,Propidium Ⅰodide 100 μg/ml避光孵育15 min,PBS緩沖液避光沖洗,防熒光淬滅甘油封片,激光共聚焦顯微鏡觀察熒光強(qiáng)度,激發(fā)波長490 nm (綠色熒光)和535 nm (紅色熒光),活細(xì)胞呈綠色熒光,死細(xì)胞呈紅色熒光。

    1.4.3 移植后一般情況

    觀察移植后大鼠術(shù)口愈合、足趾潰瘍、移植側(cè)肌肉萎縮情況,取材時觀察移植神經(jīng)斷端吻合情況及粘連情況。

    1.4.4 移植術(shù)后免疫排斥反應(yīng)

    移植術(shù)后1周,每組選取6只大鼠,2%戊巴比妥鈉30 mg/kg腹腔注射麻醉,于右股后外側(cè)原切口進(jìn)入,沿肌間隙鈍性分離,暴露、分離移植側(cè)坐骨神經(jīng)段,切取移植神經(jīng)段8 mm,4%多聚甲醛固定,梯度乙醇脫水,常規(guī)石蠟包埋,縱切5 μm;脫蠟后,PBS緩沖液沖洗5 min×4次,山羊血清37 ℃封閉1 h,加一抗(CD81∶100;CD681∶100)孵育過夜,PBS緩沖液沖洗5 min,共4次,加相應(yīng)熒光二抗37 ℃避光孵育1 h,PBS緩沖液避光沖洗5 min,共4次,滴加防熒光淬滅甘油封片,熒光顯微鏡下觀察拍照。

    移植術(shù)后1周,上述大鼠截取移植神經(jīng)段后,心臟取血,室溫下靜置20 min后,3000 r/min離心20 min,取上清,ELⅠSA檢測ⅠL-2、ⅠFN-γ、TNF-α水平。

    1.4.5 移植術(shù)后電生理檢測

    移植術(shù)后20周,每組取6只大鼠,2%戊巴比妥鈉30 mg/kg腹腔注射麻醉,于右股后外側(cè)原切口進(jìn)入,沿肌間隙鈍性分離,暴露、分離移植坐骨神經(jīng)段,于梨狀肌下緣3 mm處神經(jīng)干放置刺激電極,同側(cè)外踝關(guān)節(jié)上10 mm腓腸肌上放置接收電極,地線遠(yuǎn)離兩電極接地,刺激電流4 mA,刺激頻率1 Hz。用BL-420N生物信號采集與分析系統(tǒng)測定肌肉復(fù)合動作電位(compound muscle action potential,CMAP)和神經(jīng)傳導(dǎo)速度(nerve conduction velocity,NCV)。

    1.4.6 移植術(shù)后腓腸肌肌肉濕重比

    電生理檢測后,完整剝離上述大鼠雙側(cè)腓腸肌,吸干其表面殘留液體并稱重,以自身非移植側(cè)作為對照,計算移植術(shù)后各組腓腸肌濕重比。

    1.4.7 移植術(shù)后再生神經(jīng)NF200免疫熒光染色

    電生理檢測后,切取上述大鼠移植神經(jīng)段8 mm,按照上述免疫熒光染色法(一抗NF200 1∶100),熒光顯微鏡觀察移植神經(jīng)NF200熒光強(qiáng)度。

    1.4.8 移植術(shù)后再生神經(jīng)組織學(xué)分析

    移植術(shù)后20周,每組取6只大鼠,切取大鼠移植神經(jīng)段8 mm,2%戊二醛4 ℃固定過夜,1%鋨酸固定2 h,梯度丙酮脫水,環(huán)氧樹脂包埋。半薄切片,甲苯胺藍(lán)染色,CCD光譜測量系統(tǒng),每個樣本隨機(jī)選5張切片,每張切片隨機(jī)取5個視野,采用Ⅰmage-Pro Plus 6.0分析再生有髓神經(jīng)纖維數(shù)量;每組選取兩個樣本,超薄切片、醋酸鈾-檸檬酸鉛雙重染色,透射電鏡觀察再生神經(jīng)超微結(jié)構(gòu),Ⅰmage-Pro Plus 6.0計算再生神經(jīng)髓鞘厚度。

    1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

    2 結(jié)果

    2.1 Western blotting

    GDNF蛋白表達(dá)從高到低依次為:D組、C組/E組、A組(P<0.05);C組、D組和E組與F組比較均有顯著性差異(P<0.05)。NGF蛋白表達(dá)從高到低依次為:D組、C組、E組、A組(P<0.05);C組、D組和E組與F組比較均有顯著性差異(P<0.05)。見圖1、表1。

    圖1 各預(yù)處理組坐骨神經(jīng)GDNF、NGF蛋白表達(dá)

    表1 各預(yù)處理組坐骨神經(jīng)GDNF、NGF蛋白表達(dá)

    Bax蛋白表達(dá)從高到低依次為:E組、C組/D組、A組/B組(P<0.05);與F組相比,B組、C組、D組和E組表達(dá)均增加(P<0.05),A組與F組比較無顯著性差異(P >0.05)。Bcl-2蛋白表達(dá)從低到高依次為:D組/E組、C組、A組/B組(P<0.05);與F組相比,B組、C組、D組和E組表達(dá)下降(P<0.05),A組與F組比較無顯著性差異(P >0.05)。Bax/Bcl-2比值與Bax蛋白表達(dá)趨勢基本一致。Caspase-3蛋白表達(dá)從高到低依次為:D組/E組、B組/C組、A組(P<0.05);與F組相比,B組、C組、D組和E組表達(dá)增加(P<0.05),A組與F組比較無顯著性差異(P >0.05)。見圖2、表2。

    在預(yù)處理組中,MHC-Ⅰ表達(dá)從低到高依次為D組/E組、B組/C組、A組(P<0.05);MHC-Ⅱ表達(dá)則為E組、D組、A組/B組(P<0.05)。與F組相比,A組~E組MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ蛋白表達(dá)均下降(P<0.05)。見圖3、表3。

    表2 各預(yù)處理組坐骨神經(jīng)Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)

    圖2 各預(yù)處理組坐骨神經(jīng)Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)

    圖3 各預(yù)處理組坐骨神經(jīng)MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ蛋白表達(dá)

    2.2 冷凍保存坐骨神經(jīng)細(xì)胞生物活性

    G組神經(jīng)纖維綠色熒光強(qiáng)、分布廣泛,可見零星紅色熒光分布。A組~F組仍可見神經(jīng)纖維綠色熒光,但熒光強(qiáng)度較G組弱,紅色熒光較G組多。與F組相比,A組~E組綠色熒光強(qiáng)度減弱,紅色熒光強(qiáng)度增強(qiáng),其中,A組綠色熒光強(qiáng)度最強(qiáng),紅色熒光強(qiáng)度最低,B組次之,C組、D組和E組最差。見圖4。

    2.3 同種異體神經(jīng)移植后檢測

    2.3.1 移植后一般情況

    實驗期間大鼠無死亡,術(shù)后傷口無感染和壞死。同種異體移植術(shù)后1周,各組移植神經(jīng)段稍腫脹,與周圍組織無粘連。移植術(shù)后3周,各組右下肢肌肉出現(xiàn)不同程度的萎縮,除H′組外,其余各組(A′組4只、B′組4只、C′組3只、D′組2只、E′組2只、F′組5只、G′組5只)移植側(cè)出現(xiàn)足趾紅腫、潰瘍、缺失等改變,術(shù)后8~10周以后潰瘍陸續(xù)愈合。移植術(shù)后20周,各組移植神經(jīng)段與周圍組織均出現(xiàn)不同程度粘連,G′組粘連最重,F(xiàn)′組次之,H′組最輕,遠(yuǎn)近端吻合口稍膨大,無神經(jīng)瘤形成。

    表3 各預(yù)處理組坐骨神經(jīng)MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ蛋白表達(dá)

    2.3.2 免疫排斥反應(yīng)

    移植術(shù)后1周,H′組血清中ⅠL-2、ⅠFN-γ、TNF-α水平較低,G′組較高。與G′組相比,C′組、D′組、E′組ⅠL-2、ⅠFN-γ、TNF-α水平降低(P <0.05)。與F′組相比,C′組、D′組、E′組ⅠL-2水平降低(P <0.05),E′組ⅠFN-γ 水平降低(P <0.05),C′組、D′組、E′組TNF-α水平降低(P <0.05),其他組間比較均無顯著性差異(P >0.05)。在各預(yù)處理冷凍保存移植組中,D′組、E′組ⅠL-2水平較低,A′組、B′組、C′組較高(P <0.05);各組間ⅠFN-γ 水平無顯著性差異(P >0.05);D′組、E′組TNF-α 水平最低,C′組次之,A′、B′組最高(P <0.05)。見表4。

    2.3.3 電生理檢測

    H′組CMAP、NCV較優(yōu),G′組和F′組較差,但D′組、H′組間和F′組、G′組間均無顯著性差異(P >0.05)。與F′組相比,B′組、C′組、D′組和E′組CMAP、NCV較優(yōu)(P <0.05),A′組與F′組間無顯著性差異(P >0.05);在預(yù)處理冷凍保存移植組中,D′組CMAP、NCV最優(yōu),C′組和E′組次之,A′組和B′組最差(P <0.05)。見圖7、表5。

    2.3.4 腓腸肌肌肉濕重比

    H′組腓腸肌濕重比較高,G′組和F′組較低,但D′組與H′組間和F′組與G′組間均無顯著性差異(P >0.05)。與F′組相比,C′組、D′組和E′組腓腸肌濕重比較高(P <0.05),但A′組、B′組、F′組間無顯著性差異(P >0.05);在預(yù)處理冷凍保存移植組中,D′組腓腸肌濕重比最高,C′組、E′組次之,A′組、B′組最差(P <0.05)。見表6。

    2.3.5 再生神經(jīng)NF200

    H′組綠色熒光強(qiáng)度最高、分布均勻,G′組熒光強(qiáng)度最低、散在分布。與H′組相比,A′組~F′組綠色熒光較弱。與F′組相比,A′組~E′組綠色熒光較強(qiáng);在各預(yù)處理冷凍保存移植組中,D′組綠色熒光強(qiáng)度最高、分布均勻,C′組次之,A′組和B′組最差。見圖8。

    2.3.6 再生神經(jīng)組織學(xué)分析

    H′組有髓神經(jīng)纖維數(shù)最優(yōu),G′組最差,但D′組和H′組間無顯著性差異(P >0.05)。與F′組相比,B′組、C′組、D′組和E′組有髓神經(jīng)纖維數(shù)較多(P <0.05),但A′組與F′組間無顯著性差異(P >0.05)。在各預(yù)處理冷凍保存移植組中,D′組有髓神經(jīng)纖維數(shù)最多、分布均勻,C′組和E′組次之,A′組和B′組最差(P <0.05)。見圖9、表7。

    H′組和D′組可見大量有髓神經(jīng)纖維,纖維粗細(xì)均勻,髓鞘厚;C′組和E′組再生有髓神經(jīng)纖維數(shù)量較多,分布廣泛、髓鞘較厚;A′組和B′組再生有髓神經(jīng)纖維數(shù)量較少,分布較廣泛,髓鞘較??;G′組再生有髓神經(jīng)纖維數(shù)量少,直徑細(xì),髓鞘薄,分布稀疏。H′組有髓神經(jīng)纖髓鞘厚度最優(yōu),G′組最差,但D′組與H′組間無顯著性差異(P >0.05)。與F′組相比,B′組、C′組、D′組和E′組有髓神經(jīng)纖髓鞘厚度較優(yōu)(P <0.05),但A′組與F′組間無顯著性差異(P >0.05)。在各預(yù)處理冷凍保存移植組中,D′組有髓神經(jīng)纖髓鞘厚度最優(yōu),C′組和E′組次之,A′組和B′最差(P <0.05)。見圖10、表7。

    表4 移植術(shù)后1周,各組血清IL-2、IFN-γ、TNF-α水平(ng/L)

    表5 移植術(shù)后20周各組CMAP和NCV比較

    表6 移植術(shù)后20周各組腓腸肌濕重比

    表7 移植術(shù)后20周各組軸突密度與髓鞘厚度比較

    3 討論

    自體神經(jīng)移植因來源有限、供區(qū)并發(fā)癥等缺點,不能滿足臨床對周圍神經(jīng)缺損,尤其是長段缺損修復(fù)的需要。同種異體神經(jīng)具有與自體神經(jīng)相同的組織結(jié)構(gòu),可能是自體神經(jīng)理想的替代物。周圍神經(jīng)冷凍保存可以為臨床提供神經(jīng)缺損修復(fù)所需要的神經(jīng)移植物,從而使同種異體神經(jīng)代替自體神經(jīng)修復(fù)周圍神經(jīng)長段缺損成為可能[3-4]。

    去細(xì)胞神經(jīng)具有低免疫原性,同時神經(jīng)內(nèi)部的三維支架結(jié)構(gòu)和細(xì)胞外基質(zhì)的活性成分得以保持,并且可以體外長期保存,異體移植后能支持受者神經(jīng)軸突再生[5-6]。有學(xué)者在去細(xì)胞神經(jīng)移植物中添加NTF,移植后的神經(jīng)再生優(yōu)于單純?nèi)ゼ?xì)胞異體神經(jīng)移植[18]。然而,NTFs半衰期短,如何在去細(xì)胞移植物中長期穩(wěn)定釋放是運用的難點[19-20]。運用控釋技術(shù)將GDNF復(fù)合到去細(xì)胞神經(jīng)移植物中,GDNF的長期持續(xù)釋放促進(jìn)移植后的神經(jīng)再生和功能恢復(fù)[21]。因此,NTFs的持久釋放對周圍神經(jīng)長段缺損修復(fù)后的軸突再生尤為重要。

    施萬細(xì)胞是周圍神經(jīng)的主要結(jié)構(gòu)和功能細(xì)胞,能合成和分泌多種NTFs和黏附分子,對周圍神經(jīng)損傷后的神經(jīng)再生具有非常重要的作用[7]。有研究證實,在去細(xì)胞的神經(jīng)移植物中添加施萬細(xì)胞,術(shù)后受體神經(jīng)再生明顯優(yōu)于單純?nèi)ゼ?xì)胞異體神經(jīng)移植[10]。因此,周圍神經(jīng)冷凍保存時維持施萬細(xì)胞的生物活性,對神經(jīng)移植后的神經(jīng)再生具有積極作用。我們的前期研究發(fā)現(xiàn),周圍神經(jīng)冷凍保存能維持施萬細(xì)胞的生物活性,異體移植后的排斥反應(yīng)較弱,能支持移植后的神經(jīng)再生[11]。

    本研究體外預(yù)處理大鼠坐骨神經(jīng),體外模擬周圍神經(jīng)Wallerian變性,誘導(dǎo)施萬細(xì)胞表達(dá)ENTFs,然后將表達(dá)ENTFs的周圍神經(jīng)冷凍保存,最后將冷凍保存后的神經(jīng)進(jìn)行同種異體移植,結(jié)果發(fā)現(xiàn),體外預(yù)處理大鼠坐骨神經(jīng)能誘導(dǎo)其施萬細(xì)胞表達(dá)ENTFs;高表達(dá)ENTFs的坐骨神經(jīng)Bcl-2表達(dá)下降,Bax、Caspase-3表達(dá)增加,Bax/Bcl-2比值增高,MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ表達(dá)下降;高表達(dá)ENTFs的坐骨神經(jīng)冷凍保存4周后,雖然存活施萬細(xì)胞數(shù)量減少,但同種異體移植后免疫反應(yīng)較弱,能促進(jìn)移植后受者神經(jīng)再生和功能恢復(fù)。

    圖4 各組坐骨神經(jīng)比較(Calcein-AM/Propidium Ⅰodide染色,激光共聚焦顯微鏡,×400,bar=50μm)

    ENTFs主要由施萬細(xì)胞合成和釋放,施萬細(xì)胞作為周圍神經(jīng)的主要結(jié)構(gòu)和功能細(xì)胞,在生理條件下經(jīng)逆向運輸ENTFs至神經(jīng)元胞體,提供營養(yǎng)支持,促進(jìn)神經(jīng)元成熟、分化[22];周圍神經(jīng)損傷后,軸突、髓鞘崩解,其遠(yuǎn)端發(fā)生Wallerian變性,施萬細(xì)胞在轉(zhuǎn)錄因子c-Jun的作用下去分化,轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂写僭偕硇偷男迯?fù)施萬細(xì)胞,釋放大量ENTFs,如GDNF、NGF等,這些ENTFs在周圍神經(jīng)損傷后對施萬細(xì)胞的存活、軸突的生長和走向起著十分重要的營養(yǎng)和誘導(dǎo)作用[23-24]。GDNF能促進(jìn)運動神經(jīng)元的存活[25];NGF能促進(jìn)感覺神經(jīng)元的存活[26]。然而,在同種異體神經(jīng)移植后的局部微環(huán)境中,由于施萬細(xì)胞分泌的NTFs濃度過低,可能不足以維持神經(jīng)元胞體的存活和軸突再生,出現(xiàn)施萬細(xì)胞基底膜破壞,導(dǎo)致遠(yuǎn)端軸突長入困難甚至移植失敗[16-17]。因此,促進(jìn)周圍神經(jīng)施萬細(xì)胞分泌ENTFs可能會改善神經(jīng)異體移植后的軸突再生和功能恢復(fù)。

    圖5 移植術(shù)后1周A′~D′組移植神經(jīng)段CD8+T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞入侵情況(免疫熒光染色,×200)

    本研究通過體外預(yù)處理大鼠坐骨神經(jīng)不同時間,模擬周圍神經(jīng)Wallerian變性,誘導(dǎo)其施萬細(xì)胞表達(dá)ENTFs,結(jié)果顯示,體外預(yù)處理7 d以上可促進(jìn)坐骨神經(jīng)ENTFs表達(dá),以14 d效果最佳。隨后將預(yù)處理后表達(dá)ENTFs的坐骨神經(jīng)冷凍保存4周,同種異體移植修復(fù)坐骨神經(jīng)缺損,結(jié)果顯示,表達(dá)ENTFs的坐骨神經(jīng)再生有髓神經(jīng)纖維數(shù)量多、髓鞘厚,CMAP高,NCV快,以預(yù)處理14 d效果最佳。

    圖6 移植術(shù)后1周E′~H′組移植神經(jīng)段CD8+T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞入侵情況(免疫熒光染色,×200)

    ENTFs主要由施萬細(xì)胞合成和釋放,施萬細(xì)胞的存活情況在一定程度上決定損傷周圍神經(jīng)的再生潛能。細(xì)胞凋亡的發(fā)生是在多種凋亡相關(guān)基因的調(diào)控下進(jìn)行的,Bcl-2、Bax與神經(jīng)元的存活關(guān)系密切,二者之間的比值決定細(xì)胞是凋亡還是存活[27];而Caspase-3的激活在神經(jīng)元凋亡中起著極其重要的作用,被認(rèn)為是細(xì)胞死亡前的終末事件[28-29]。

    圖7 移植術(shù)后20周各組CMAP波形

    本研究檢測預(yù)處理神經(jīng)Bcl-2、Bax蛋白表達(dá),結(jié)果顯示:與新鮮神經(jīng)對照組(F組)相比,坐骨神經(jīng)預(yù)處理組中7 d組、14 d組和21 d組Bcl-2表達(dá)下降,Bax表達(dá)增強(qiáng),Bax/Bcl-2比值升高。同時,我們還檢測Caspase-3蛋白表達(dá),與新鮮神經(jīng)對照組(F組)相比,坐骨神經(jīng)預(yù)處理組中7 d組、14 d組和21 d組Caspase-3表達(dá)也增強(qiáng),這與Bax表達(dá)、Bax/Bcl-2比值結(jié)果一致。將預(yù)處理坐骨神經(jīng)冷凍保存4周后,Calcein-AM/Propidium Ⅰodide熒光染色觀察保存后神經(jīng)的細(xì)胞存活情況,結(jié)果顯示,與新鮮神經(jīng)冷凍保存組(F組)、新鮮神經(jīng)組(G組)相比,各預(yù)處理冷凍保存組神經(jīng)纖維綠色熒光(代表活細(xì)胞)減弱,紅色熒光(代表死細(xì)胞)增強(qiáng);在預(yù)處理冷凍保存組中,1 d組綠色熒光強(qiáng)度最強(qiáng),紅色熒光強(qiáng)度最低,3 d組次之,7 d組、14 d組、21 d組最差。這與預(yù)處理神經(jīng)施萬細(xì)胞凋亡情況一致。這些結(jié)果表明,預(yù)處理時間將影響坐骨神經(jīng)施萬細(xì)胞的存活。

    圖8 移植術(shù)后20周各組移植神經(jīng)段再生神經(jīng)NF200(免疫熒光染色,×400)

    免疫排斥反應(yīng)是異體組織器官移植成功的關(guān)鍵。異體組織器官移植后的免疫反應(yīng)包括體液免疫反應(yīng)和細(xì)胞免疫反應(yīng)。目前認(rèn)為細(xì)胞免疫應(yīng)答是同種異體神經(jīng)移植產(chǎn)生免疫排斥反應(yīng)的主要機(jī)制,T細(xì)胞和T細(xì)胞是主要的效應(yīng)細(xì)胞[30]?;罨腡細(xì)胞通過釋放ⅠL-2、ⅠFN-γ 和TNF-α 等炎性細(xì)胞因子募集和活化巨噬細(xì)胞,引起宿主炎性細(xì)胞浸潤和移植組織損傷[31];而T細(xì)胞則可通過分泌穿孔素、顆粒酶等物質(zhì)直接殺傷宿主靶細(xì)胞[32-33]。在移植免疫反應(yīng)中,T細(xì)胞識別MHC-ⅠⅠ分子,而T細(xì)胞識別MHC-Ⅰ分子[34],移植物MHC-Ⅰ、MHC-ⅠⅠ水平的高低在很大程度上決定移植后排斥反應(yīng)的強(qiáng)弱[35]。施萬細(xì)胞作為周圍神經(jīng)的抗原提呈細(xì)胞(antigen-presenting cell,APC),除了具有表達(dá)MHC-Ⅰ類分子外,還具有表達(dá)MHC-ⅠⅠ類分子的能力,是異體神經(jīng)移植后出現(xiàn)免疫排斥反應(yīng)的主要原因[36]。

    本研究檢測預(yù)處理神經(jīng)MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ分子表達(dá),結(jié)果顯示:各預(yù)處理組神經(jīng)的MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ蛋白表達(dá)均低于新鮮神經(jīng)對照組(F組),表明預(yù)處理后的周圍神經(jīng)具有較低的免疫原性,這些神經(jīng)在冷凍保存后可能對減輕神經(jīng)異體移植后的排斥反應(yīng)具有重要的作用。同時,本研究還檢測Bcl-2、Bax和Caspase-3蛋白表達(dá),結(jié)果顯示:預(yù)處理組中7 d組、14 d組和21 d組Bcl-2表達(dá)降低,Bax、Caspase-3表達(dá)均增加。預(yù)處理神經(jīng)的MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ蛋白表達(dá)下降可能與預(yù)處理過程中施萬細(xì)胞凋亡增加有關(guān)。隨后,將預(yù)處理后表達(dá)ENTFs的坐骨神經(jīng)冷凍保存4周,預(yù)處理組中7 d組、14 d組和21 d組神經(jīng)的活細(xì)胞明顯低于新鮮神經(jīng)冷凍保存組(F組)和新鮮神經(jīng)組(G組),這與預(yù)處理階段各組施萬細(xì)胞凋亡情況一致。最后,本研究觀察預(yù)處理冷凍保存的坐骨神經(jīng)異體移植后排斥反應(yīng)和受者神經(jīng)再生情況,結(jié)果顯示:移植術(shù)后1周,與新鮮神經(jīng)冷凍保存移植組(F′組)、同種異體新鮮移植組(G′組)相比,預(yù)處理冷凍保存移植組(A′~E′組)移植物中T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞入侵及受者血清ⅠL-2、ⅠFN-γ、TNF-α水平較低,尤其是7 d移植組、14 d移植組和21 d移植組更低;移植術(shù)后20周,預(yù)處理冷凍保存移植組中7 d移植組、14 d移植組和21 d移植組受者神經(jīng)再生和功能恢復(fù)優(yōu)于新鮮神經(jīng)冷凍保存移植組(F′組)和同種異體新鮮移植組(G′組)。這些結(jié)果說明,冷凍保存后的具有較低免疫原性的預(yù)處理神經(jīng),異體移植后受者排斥反應(yīng)降低,促進(jìn)了移植后受者神經(jīng)的再生和功能恢復(fù)。

    圖9 移植術(shù)后20周各組移植神經(jīng)段再生神經(jīng)(甲苯胺藍(lán)染色,bar=50 μm)

    ENTFs主要由施萬細(xì)胞合成和釋放,施萬細(xì)胞的活性在一定程度上決定周圍神經(jīng)移植物的再生潛能。然而,施萬細(xì)胞作為周圍神經(jīng)的主要表達(dá)MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ抗原分子的細(xì)胞,是同種異體移植后出現(xiàn)免疫排斥反應(yīng)的主要原因[37]。如果將周圍神經(jīng)施萬細(xì)胞的活細(xì)胞控制在一定的范圍內(nèi),則可能既降低周圍神經(jīng)免疫原性又保留其存活施萬細(xì)胞在異體移植后持續(xù)分泌ENTFs的能力,這對異體移植后的受者神經(jīng)再生和功能恢復(fù)具有重要意義。在本研究中,體外預(yù)處理大鼠坐骨神經(jīng)成功地誘導(dǎo)其ENTFs表達(dá),高表達(dá)ENTFs的坐骨神經(jīng)雖然活細(xì)胞減少,但其免疫原性也下降,異體移植后排斥反應(yīng)降低,能促進(jìn)移植術(shù)后受者神經(jīng)再生和功能恢復(fù)。然而,能高表達(dá)ENTFs的預(yù)處理坐骨神經(jīng)存活的施萬細(xì)胞卻減少,是因預(yù)處理時間較長導(dǎo)致坐骨神經(jīng)的存活施萬細(xì)胞減少,還是因預(yù)處理液中的營養(yǎng)成分不足以維持長時間體外培養(yǎng)過程中施萬細(xì)胞存活?還需進(jìn)一步研究并探討其可能機(jī)制和改進(jìn)措施。

    圖10 移植術(shù)后20周各組移植神經(jīng)段再生神經(jīng)(透射電鏡,×6000,bar=2 μm)

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