肉蓯蓉苯乙醇總苷對壓力超負荷大鼠心肌肥厚及PI3K/PKB信號通路的影響

樊瓊玲，劉 濤，俞金秀，馬正文，張石蕾，由淑萍

(新疆醫(yī)科大學 1.護理學院，2. 公共衛(wèi)生學院，新疆 烏魯木齊 830011)

心肌肥厚是一種為維持心輸出量和保證組織灌流的適應性反應，壓力超負荷引起的心肌肥厚與高血壓的發(fā)生密切相關[1]。研究表明[2]，心肌肥厚的逆轉可以降低心血管疾病的死亡率。肉蓯蓉(Cistance)素有“沙漠人參”之美譽。苯乙醇總苷(Cistanche phenylethanoid glycosides，CPhGs)是肉蓯蓉發(fā)揮藥效的主要物質基礎之一[3]，具有抗癡呆、抗氧化、抗腫瘤、免疫調節(jié)、緩解疲勞、抗腦缺血/再灌注損傷等多種藥理作用[4]。研究顯示[5]，CPhGs可以抑制因缺血再灌注損傷引起的心肌細胞凋亡并發(fā)揮保護心肌組織的作用。然而，肉蓯蓉CPhGs能否對壓力超負荷引起的心肌肥厚能起到抑制作用，尚不可知。因此，本研究通過構建大鼠腹主動脈縮窄(abdominal aorta coarctation，AAC)模型，探討CPhGs對壓力超負荷大鼠心肌肥厚的作用，以及對磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(phosphatidylinositol 3-kinase/ protein kinase B，PI3K/PKB)通路相關蛋白表達的影響，以研究CPhGs抑制壓力超負荷大鼠心肌肥厚的作用機制，為進一步研發(fā)對心肌肥厚防控的藥物提供實驗依據。

1 材料

1.1 實驗動物健康雄性SPF級大鼠，70只，體質量(200±20)g,由新疆醫(yī)科大學動物實驗中心提供。動物生產許可證號與合格證號分別為：SYXK(新)2016-0003，SCXK(新)2016-0002。

1.2 藥物與試劑肉蓯蓉苯乙醇總苷CPhGs(和田帝辰醫(yī)藥生物科技有限公司，批號：20180502)，纈沙坦(北京諾華制藥有限公司,規(guī)格：80 mg)，0.5%羧甲基纖維素鈉(carboxymethylcellulose sodium，CMC-Na)(西安正天藥用輔料有限公司)，戊巴比妥鈉(德國Meck公司)，RIPA(美國Thermo公司),p-PI3K、PI3K、p-PKB、PKB、β-actin兔抗單克隆抗體、大鼠血漿內皮素1(endothelin 1, ET-1)和腦利鈉肽(brain natriuretic peptide, BNP)酶聯免疫吸附試驗試劑盒(北京博奧森公司)，辣根過氧化酶標記二抗(北京中杉金橋公司)，蛋白酶抑制劑、蛋白磷酸酶抑制劑混合物、BCA蛋白定量試劑盒(北京索萊寶公司)，ECL顯色液(中國Biosharp公司)、PVDF膜(英國Roche公司)。

1.3 主要儀器飛利浦HD11 XE超聲診斷儀(德國Philips公司)；移液器(德國Eppendorf公司)；低溫離心機(美國Sigma公司)；全波長自動酶聯免疫反應檢測儀((美國Thermo公司)；電泳和轉膜裝置(美國Bio-Rad公司)；FluorChem E 化學發(fā)光高靈敏凝膠成像儀(美國Protein Simple公司)；電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海一恒科學儀器有限公司)。

2 方法

2.1 動物分組、模型制備及給藥根據文獻[6]采用AAC術制備大鼠壓力超負荷心肌肥厚模型。雄性SD大鼠70只，隨機分為7組：空白組(Control, Con)、假手術組(Sham)、模型組(Mod)、纈沙坦陽性藥對照組(Valsartan, Vst)、CPhGs 125、250、250 mg·kg-1組，涉及藥物劑量參照文獻[7-8]及預實驗結果設置。Con組不進行手術，Sham組分離腹主動脈不予結扎，其余五組建立壓力超負荷心肌肥厚模型。術后d 3，CPhGs各劑量組及Vst組(10 mg·kg-1)按每天設定劑量灌胃給予受試物，其余3組均灌胃給予相同體積的0.5%CMC-Na，連續(xù)42 d，每日1次；d 43，以2.5%戊巴比妥鈉麻醉后，行心臟超聲檢查，開腹采取腹主動脈血處死大鼠，立即開胸，取出心臟。

2.2 大鼠心臟超聲指標的檢測在2.5%戊巴比妥鈉麻醉下，剃毛后，使用超聲診斷儀檢測各組大鼠的心功能指標：(1)左心室舒張末期后壁厚度(left ventricular posterior wall thickness，LVPWT)(2)左心室舒張末期內徑(left ventricular end-diastolic diameter，LVEDD)(3)左心室短軸收縮率(left ventricular fractional shortening，LVFS)(4)左心室射血分數(left ventricular ejection fractions，LVEF)。每只大鼠重復3次測量后，計算平均值。

2.3 大鼠心臟體質量指數(heart weight/body weight index, HWI)計算大鼠結束心臟超聲學檢測后，打開腹腔，腹主動脈取血至大鼠死亡后，立即開胸，取出大鼠心臟，用預冷的生理鹽水沖洗心腔3次，用干凈的濾紙吸干水分，稱心臟質量(heart weight, HW)。HWI=HW/體質量(body weight，BW)。

2.4 酶聯免疫吸附試驗檢測大鼠血漿ET-1和BNP水平腹主動脈血液儲存于EDTA抗凝采血管，混勻后3 000 r·min-1離心15min，收集上清，-20 ℃條件下凍存。按試劑盒說明書操作。

2.5 顯微鏡觀察大鼠心肌組織病理學改變大鼠心肌組織以4%多聚甲醛固定、石蠟包埋后，經伊紅蘇木素染色后以中性樹膠封片，電子顯微鏡下觀察心肌組織和細胞形態(tài)并拍圖。用Image J測量細胞表面積，每組選取四張標本，每張隨機選取3個視野，每視野測量10～15個心肌細胞面積(area of myocardial cells，AMC)，計算平均值。

2.6 Western blot 檢測p-PI3K, PI3K, p-PKB, PKB蛋白的表達稱取心肌組織50mg,加入液氮研磨充分后加入RIPA裂解液、蛋白酶抑制劑、蛋白磷酸酶抑制劑混合物，提取總蛋白，采用BCA法進行蛋白定量至60 μg，加入4×Loading buffer后在100 ℃下熱變性5 min，上樣到10%聚丙烯酰胺凝膠，120 V電泳60 min，200 mA恒流電轉90 min，PVDF膜濕轉。5%脫脂奶粉室溫下封閉 PVDF膜1 h，1×TBST緩沖液置于搖床振蕩清洗10 min，3次，加入相應比例稀釋的一抗(目的基因p-PI3K, PI3K, p-PKB, PKB為1 ∶1 000，內參β-actin為1 ∶20 000)，4 ℃下孵育過夜，清洗3次后室溫下孵育二抗1 h。FluorChem E 化學發(fā)光高靈敏凝膠成像儀拍照顯色，分析條帶灰度值。蛋白相對表達水平=目的條帶灰度值/內參條帶灰度值×100%

3 結果

3.1 CPhGs對壓力超負荷心肌肥厚大鼠的心臟超聲指標的影響Tab 1可見，與Con組和Sham組相比，Mod組的LVPWT顯著增加，LVEDD、LVEF、LVFS顯著減小(P<0.01)；與Mod組相比， Vst組和CPhGs 125、250、500 mg·kg-1組大鼠的LVPWT減少，LVEDD、LVEF、LVFS增加，CPhGs組隨著劑量的增加呈現改變逐漸明顯的趨勢，Vst組及CPhGs 250、500 mg·kg-1組作用顯著(P<0.05或P<0.01)；與Vst組相比， CPhGs 250、500 mg·kg-1組各指標沒有統(tǒng)計學差異。表明中、高劑量的CPhGs對壓力超負荷心肌肥厚大鼠有保護作用，其作用與陽性藥物相當。

3.2 CPhGs對壓力超負荷心肌肥厚大鼠的HWI的影響Tab 2可見，各組大鼠的BW沒有明顯差異；與Con組和Sham組相比，Mod組大鼠的HW和HWI顯著相加(P<0.01)；與Mod組相比，Vst組HW和HWI顯著減小(P<0.01),CPhGs 125、250、500 mg·kg-1組(P<0.05或0.01)HW和HWI有不同程度的減小，且隨著劑量的增加呈現逐漸減小的趨勢；與Vst組相比，CPhGs 500 mg·kg-1組與其接近，差異無統(tǒng)計學意義。表明中、高劑量CPhGs可以減小壓力超負荷心肌肥厚大鼠的心肌肥厚程度，保護心肌，與Vst作用相當。

Tab 1 Effect of CPhGs on echocardiography in rats with myocardial hypertrophy induced by pressure

**P<0.01vsCon and Sham;#P<0.05,##P<0.01vsMod;▲P<0.05vsVst

Tab 2 Effect of CPhGs on HWI in rats with myocardial hypertrophy induced by pressure

**P<0.01vsCon and Sham;#P<0.05,##P<0.01vsMod;▲P<0.05vsVst

3.3 CPhGs對壓力超負荷心肌肥厚大鼠血漿BNP和ET-1水平的影響Tab 3可見，與Con組和Sham組相比，Mod組大鼠的血漿BNP和ET-1水平顯著上升(P<0.01)；與Mod組相比，Vst組大鼠的血漿BNP和ET-1水平顯著下降(P<0.01)，CPhGs 125、250、500 mg·kg-1組血漿BNP和ET-1水平有不同程度下降，并且隨著劑量的增加呈現逐漸減小的趨勢，其中CPhGs 250組BNP顯著下降(P<0.01)、500 mg·kg-1組BNP和ET-1均顯著下降(P<0.01)；與Vst組相比，CPhGs 500 mg·kg-1組BNP和ET-1水平降低，沒有統(tǒng)計學差異。表明250、500 mg·kg-1中、高劑量的CPhGs可以降低壓力超負荷心肌肥厚大鼠的血漿BNP和ET-1水平，高劑量組作用強度與Vst相當。

Tab 3 Effect of CPhGs on BNP and ET-1 in plasma of ratswith myocardial hypertrophy

**P<0.01vsCon and Sham;##P<0.01vsMod;▲P<0.05,▲▲P<0.01vsVst

3.4 心肌組織病理學觀察結果Fig 1 和Fig 2可見，與Con組和Sham組相比，Mod組心肌細胞排列紊亂，組織中可見炎性細胞浸潤，單位視野內細胞核的數量減少，AMC顯著增大(P<0.01)；與Mod組相比，Vst組單位視野內的細胞數量增加，AMC顯著減小(P<0.01)，CPhGs 125、250、500 mg·kg-1組的AMC也有不同程度減小，并且隨著劑量的增加呈現逐漸減小的趨勢,其中CPhGs 250、500 mg·kg-1組較Mod組有明顯差異(P<0.05或0.01)；與Vst組相比，CPhGs 500 mg·kg-1組AMC與其接近，差異無統(tǒng)計學意義。表明中、高劑量CPhGs在一定程度有減小壓力超負荷型心肌肥厚大鼠AMC的作用，當劑量達500 mg·kg-1作用與Vst接近。

3.5 CPhGs對壓力超負荷心肌肥厚大鼠心肌組織PI3K/PKB通路相關蛋白表達的影響Fig 3和Fig 4可見，與Con組和Sham組相比，Mod組p-PI3K、p-PKB蛋白的相對表達量顯著降低(P<0.01)；與Mod組相比，Vst組p-PI3K、p-PKB蛋白的相對表達量顯著升高(P<0.01)，CPhGs 125、250、500 mg·kg-1組有不同程度升高，隨著劑量的增加, p-PI3K、p-PKB蛋白相對表達量呈逐步增加趨勢,其中CPhGs 250、500 mg·kg-1組較Mod組有明顯統(tǒng)計學意義(P<0.01)；與Vst組相比，CPhGs 500 mg·kg-1組p-PI3K、p-PKB蛋白的相對表達量與其接近，無明顯差異。表明中、高劑量CPhGs能夠增加壓力負荷型心肌肥厚大鼠心肌組織的p-PI3K、p-PKB蛋白的相對表達量，高劑量組與Vst的作用相當。

Fig1PictureofmyocardialtissueswithHEstaining(×400,n=4)
A:Con;B:Sham;C:Mod;D:Vst;E:CPhGs 125 mg·kg-1;F:CPhGs 250 mg·kg-1;G:CPhGs 500 mg·kg-1

Fig 2 Effect of CPhGs on AMC in rats with myocardial hypertrophy induced by pressure

**P<0.01vsCon and Sham;#P<0.05,##P<0.01vsMod;▲P<0.05,▲▲P<0.01vsVst

4 討論

心肌肥厚作為高血壓的主要并發(fā)癥之一，同時也參與了慢性心衰、冠心病等心血管疾病的病理過程。在高血壓前期，心肌通過增加心室壁張力從而適應增加的壓力負荷，心肌細胞代償性增大，導致左室心肌肥厚。心肌肥厚的抑制可以降低心血管疾病發(fā)病率及總死亡率，其作用優(yōu)于單純降壓治療[9]。因此，高血壓的治療方案不應局限于血壓的控制能夠增加壓力負荷型心肌肥厚大鼠，逆轉心肌肥厚是治療高血壓的亟待解決的問題。

Fig 3 Representative Western blot bands of p-PI3K, PI3K, p-PKB, PKB and β-actin(n=3)

Fig 4 Effect of CPhGs on expression of p-PI3K and p-PKB in rats with myocardial hypertrophy

**P<0.01vsCon and Sham;##P<0.01vsMod;▲▲P<0.01vsVst

肉蓯蓉被列為管花肉蓯蓉Cistanche tubulosa Wight干燥帶鱗葉肉質莖。近年來，肉蓯蓉以其顯著的生物活性備受人們的關注，國內學者對肉蓯蓉的心血管等方面的藥理作用進行了較為深入的研究，發(fā)現肉蓯蓉對心肌具有一定保護作用，但其具體的分子作用機制仍不清楚。研究表明[10]，CPhGs能減輕自由基對心肌線粒體膜和漿網膜造成的損傷，降低丙二醛含量，減輕心肌超微結構損傷，提高大鼠心肌線粒體抗氧化酶活性，減少心肌梗死面積，提高心肌組織磷酸肌酸激酶活性，對缺血心肌有保護作用。本實驗發(fā)現，CPhGs可減小心肌肥厚大鼠的LVPWT、HWI、AMC及心肌肥厚標志物ET-1、BNP水平，同時增加LVEDD、EF、FS，而抑制心肌肥厚，改善大鼠的心功能。隨藥物濃度增加，CPhGs作用效果增加，呈現劑量依賴關系，其中CPhGs 中高劑量組肌肥厚大鼠有明顯的保護作用，高劑量組與纈沙坦陽性藥組作用相當。

PI3K是心肌細胞肥大和由收縮型向肥厚型轉換的最后通路[11]，PI3K的2種亞型可參與心肌細胞肥大，其中pll0α參與生理性心肌肥厚，而p110γ參與病理性心肌肥厚，小鼠敲除p110γ后，對心肌病理性刺激可產生保護作用，對于心肌細胞肥大的發(fā)生、發(fā)展起著至關重要的作用[12]。PKB途徑與心肌細胞增殖、生長、代謝、凋亡等多種生物學活動密切相關[13]。葉芳杏等[14]報道玉郎傘單體17-甲氧基-7-羥基-苯并呋喃查爾酮可以通過調控心肌內皮細胞的p-PI3K、p-PKB、p-eNOS等蛋白逆轉大鼠壓力超負荷心室的重構。楊洋等[15]報道，綠原酸可通過PI3K/PKB通路調控細胞凋亡，抑制異丙腎上腺素誘導的心肌細胞肥大。本研究中,CPhGs中、高劑量組顯著增加p-PI3K、p-PKB蛋白相對表達量，且CPhGs高劑量組與Vst組作用相當，進一步證明CPhGs可以通過激活PI3K/PKB信號通路，抑制壓力超負荷大鼠心肌肥厚。

綜上，本研究證實CPhGs對AAC術后壓力超負荷心肌肥厚大鼠有保護作用，可能與其增加PI3K、PKB磷酸化而激活PI3K/PKB信號通路有關。這為臨床研究高血壓心肌肥厚提供了新思路，可能為高血壓心肌肥厚的防控和逆轉提供了新的治療藥物。