新型冠狀病毒肺炎的免疫失衡及干預(yù)策略

楊晨茜，瞿 嬌，劉怡彤，孟思偉，王冰琳，馮美卿，孫 洋

(1. 南京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生物技術(shù)與藥學(xué)系，醫(yī)藥生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210023;2. 復(fù)旦大學(xué)藥學(xué)院，上海 201203)

1 引言

在過去的幾十年里，冠狀病毒(coronaviruses，CoVs)已經(jīng)上升為全球公共衛(wèi)生的重大威脅[1]。自2019年12月起，由新型冠狀病毒SARS-CoV-2引發(fā)的新型冠狀病毒肺炎(以下簡(jiǎn)稱新冠肺炎)的迅速傳播加劇了人們對(duì)疫情的恐慌[2]。與先前爆發(fā)的SARS冠狀病毒(SARS-CoV)及中東呼吸綜合征冠狀病毒(MERS-CoV)相比，新型冠狀病毒除了具有相似的基因組、體內(nèi)復(fù)制動(dòng)力學(xué)和生物學(xué)性質(zhì)外，還表現(xiàn)出一些獨(dú)特性[3-4]。因此，全面認(rèn)識(shí)新型冠狀病毒對(duì)于疾病防控和藥物研發(fā)十分關(guān)鍵。

同時(shí)，臨床上觀測(cè)到新冠肺炎患者，尤其是重癥患者的淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)顯著降低，中性粒細(xì)胞異常增多，同時(shí)伴隨著細(xì)胞因子大量累積[5]。在SARS和MERS等病毒感染的后期，患者同樣出現(xiàn)免疫力低下和系統(tǒng)性炎癥[6]。這些現(xiàn)象提示新冠肺炎發(fā)病過程中存在免疫應(yīng)答失調(diào)，通過對(duì)患者免疫狀態(tài)進(jìn)行動(dòng)態(tài)評(píng)估，有望為新冠肺炎患者診斷、治療效應(yīng)監(jiān)測(cè)及預(yù)后評(píng)估提供輔助信息。然而新冠肺炎免疫應(yīng)答機(jī)制十分復(fù)雜，臨床用藥時(shí)機(jī)、方法及劑量亟待進(jìn)一步探究。

該文通過對(duì)SARS冠狀病毒、MERS冠狀病毒以及新近流行的新型冠狀病毒進(jìn)行全面比較，以更好地深入了解宿主-病原體相互作用，希望有助于從這幾次冠狀病毒引起的傳染病爆發(fā)中吸取教訓(xùn)，積累經(jīng)驗(yàn)。通過對(duì)新冠肺炎免疫應(yīng)答機(jī)制的深入研究，可為提高臨床療效及開發(fā)藥物奠定堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。

2 冠狀病毒的介紹及分類

冠狀病毒(coronaviruses, CoVs)是屬于巢病毒目(nidovirales)的一類在自然界中廣泛存在的單鏈RNA病毒。冠狀病毒直徑約為80～120 nm，基因組全長約為27～32 kb，是目前已知的基因組最大的RNA病毒，可感染人類和多種哺乳動(dòng)物，引起呼吸道、消化道以及神經(jīng)系統(tǒng)等多種疾病，其中在人類中主要引起呼吸道的感染[3]。

冠狀病毒由刺突糖蛋白(spike protein，S蛋白)、核衣殼蛋白(nucleocapsid protein, N蛋白)、小包膜糖蛋白(envelope protein,E蛋白)、膜糖蛋白(membrane protein, M蛋白)以及核糖核酸組成[7]。S蛋白(180 ku)是一種插入到病毒包膜中的I型膜蛋白，賦予冠狀病毒特有的冠狀形態(tài)，可利用病毒和宿主細(xì)胞特異性受體的結(jié)合介導(dǎo)病毒的吸附和侵入過程。S蛋白由受體結(jié)合亞基S1和膜融合亞基S2組成。在病毒入侵時(shí)，S1亞基與宿主細(xì)胞表面受體結(jié)合使病毒附著于細(xì)胞表面，然后S2亞基促使病毒與宿主細(xì)胞的膜融合使病毒基因組進(jìn)入細(xì)胞中[8]。N蛋白是核衣殼中唯一的蛋白質(zhì)，也是病毒感染的細(xì)胞中含量最多的蛋白，它由兩個(gè)與RNA結(jié)合的N端結(jié)合域和C端結(jié)合域組成，負(fù)責(zé)與病毒基因組結(jié)合，識(shí)別基因組包裝信號(hào)將包膜基因組打包成病毒顆粒[9-11]。E蛋白(8～12 ku)是僅含有76～109個(gè)氨基酸殘基的完整跨膜蛋白，包括一個(gè)N端胞外域和一個(gè)C端胞內(nèi)域，主要參與病毒粒子的組裝與釋放。M蛋白(25～30 ku)是冠狀病毒中含量最多的結(jié)構(gòu)蛋白，含有3個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，它與E蛋白相互作用共同介導(dǎo)病毒包膜的組裝[12]。在一些β冠狀病毒中還存在血凝素糖蛋白(HE蛋白)，該蛋白作為血凝素，與細(xì)胞表面的唾液酸結(jié)合，具有乙酰酯酶活性，促進(jìn)S蛋白介導(dǎo)的病毒侵入過程和病毒通過粘膜的傳播[13]。

冠狀病毒具有高度保守的基因組結(jié)構(gòu)，含有5′帽端結(jié)構(gòu)和3′poly(A)尾，基因組中編碼非結(jié)構(gòu)蛋白的復(fù)制酶基因約占基因組的三分之二，約20 kb；結(jié)構(gòu)基因和輔助基因只占10 kb左右。冠狀病毒基因組順序如下：5′-復(fù)制酶(replicase)-S蛋白-E蛋白-M蛋白-N蛋白-3′。冠狀病毒整個(gè)感染過程包括吸附入侵、基因合成、病毒包裝和釋放4個(gè)步驟[14]。

根據(jù)遺傳學(xué)差異，冠狀病毒可分為α、β、γ、δ 四個(gè)屬，目前已發(fā)現(xiàn)七種人類冠狀病毒(HCoVs)：HCoV-NL63、HCoV-229E、 HCoV-OC43、HCoV-HKU1、SARS-CoV、MERS-CoV以及2019新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)[3]。

2.1 SARS冠狀病毒 (SARS-CoV)2002年11月，始于中國廣東省的以非典型性肺炎(非典)為主要臨床表現(xiàn)的嚴(yán)重急性呼吸系統(tǒng)綜合癥(SARS)短時(shí)間內(nèi)迅速在世界范圍內(nèi)傳播，共造成全球多個(gè)國家8 437例患者感染，超過900例患者死亡[15]。幾乎所有感染患者以發(fā)熱、干咳、呼吸短促等呼吸道癥狀開始，并在隨后幾天迅速發(fā)展為病毒性肺炎，胸部X射線檢查顯示肺部炎癥浸潤。部分患者出現(xiàn)淋巴細(xì)胞減少癥、白細(xì)胞減少癥、血小板減少癥[16-19]。通過對(duì)患者標(biāo)本中分離出的病毒鑒定，發(fā)現(xiàn)造成此次疾病的病原體為一種冠狀病毒SARS-CoV[20-22]，研究人員在中國馬蹄蝠中亦分離到了活性的SARS-CoV，證實(shí)蝙蝠是其自然界中的天然宿主[23-24]。SARS-CoV感染人類細(xì)胞的受體為一種金屬肽酶——血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2(ACE2)，它可有效地與病毒S蛋白的S1區(qū)域結(jié)合導(dǎo)致病毒的感染[25]。

2.2 中東呼吸綜合征冠狀病毒 (MERS-CoV)2012年9月，在沙特阿拉伯地區(qū)發(fā)現(xiàn)了一種來源于駱駝的高致病性的冠狀病毒，引起人類中東呼吸綜合征(MERS)，這種冠狀病毒被命名為MERS-CoV[26-27]。據(jù)世界衛(wèi)生組織的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，MERS-CoV在全球范圍內(nèi)造成2 066例患者感染，至少720例患者死亡，致死率遠(yuǎn)高于SARS，致病性極強(qiáng)[28]。與SARS感染癥狀相似，MERS患者首先表現(xiàn)為發(fā)熱、寒顫和肌肉酸痛，隨后急性呼吸衰竭成為主要癥狀，部分患者伴有消化道癥狀和肝腎衰竭等并發(fā)癥[29]。所有患者在胸片上均有輕微到廣泛的單側(cè)和雙側(cè)異常。實(shí)驗(yàn)室分析顯示，患者伴有乳酸脫氫酶和天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶濃度升高、血小板減少癥和淋巴細(xì)胞減少癥的表現(xiàn)[30]。不同于SARS-CoV和HCoV-NL63結(jié)合ACE2，MERS-CoV是以廣泛表達(dá)于肺泡上皮細(xì)胞的二肽基肽酶4(DDP4)作為感染人類細(xì)胞的表面受體[31]。這種受體分布的差異可能是引起SARS-CoV感染I型肺泡上皮細(xì)胞，而MERS-CoV感染II型肺泡上皮細(xì)胞和非纖毛支氣管細(xì)胞的主要原因[32-33]。

2.3 2019新型冠狀病毒 (SARS-CoV-2/2019-nCoV)2019年12月，中國湖北省武漢市爆發(fā)了一系列原因不明的與病毒性肺炎癥狀極為相似的肺炎病例。患者下呼吸道樣本深度測(cè)序發(fā)現(xiàn)這是一種新型冠狀病毒感染導(dǎo)致的肺炎，全基因組測(cè)序和系統(tǒng)發(fā)育分析表明這種新型冠狀病毒與SARS-CoV和MERS-CoV不同，被歸類為β冠狀病毒的2b譜系，世界衛(wèi)生組織將其命名為2019-nCoV，而后國際病毒分類委員會(huì)將其命名為SARS-CoV-2[34]。截止目前全球47個(gè)國家共造成82 294例感染，2 804例死亡[35]。當(dāng)前的證據(jù)表明，蝙蝠可能是該病毒的原始宿主，而中間宿主目前尚未有定論[36]。新型冠狀病毒感染導(dǎo)致臨床最為常見的癥狀為發(fā)熱、乏力和干咳，大多數(shù)患者出現(xiàn)呼吸困難和肺部雙側(cè)磨玻璃渾濁，常見并發(fā)癥有急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)、急性心肌損傷、休克和繼發(fā)性感染，這些癥狀與SARS-CoV和MERS-CoV感染存在一定相似性，但新型冠狀病毒感染患者就診時(shí)發(fā)熱的比例明顯低于SARS-CoV和MERS-CoV感染，且較少的出現(xiàn)上呼吸道和消化道癥狀[5,37-38]。Tab 1從多個(gè)方面對(duì)3種冠狀病毒進(jìn)行了比較，可以更加直觀地體現(xiàn)3種冠狀病毒的異同。

對(duì)新型冠狀病毒進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，其與SARS冠狀病毒的受體結(jié)合域具有高度相似性[36]。目前研究已證實(shí)新型冠狀病毒也利用ACE2受體作為病毒感染和入侵宿主細(xì)胞的特異性受體[39-40]。2020年2月16日美國德克薩斯大學(xué)奧斯汀分校的研究團(tuán)隊(duì)利用冷凍電鏡技術(shù)，首次解析了新型冠狀病毒的S蛋白結(jié)構(gòu)，他們發(fā)現(xiàn)新型冠狀病毒是利用高度糖基化的同源三聚體S蛋白進(jìn)入宿主細(xì)胞的，且ACE2蛋白與新型冠狀病毒S蛋白的親和力是SARS冠狀病毒的10到20倍，這也在一定程度上解釋了新冠病毒具備更強(qiáng)傳染力的原因[41]。2月20日，西湖大學(xué)研究團(tuán)隊(duì)利用冷凍電鏡在2.9埃全分辨率條件下全球范圍內(nèi)首次成功解析ACE2的完整結(jié)構(gòu)，揭示了人類全長的ACE2受體與新型冠狀病毒S蛋白受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域(RBD)復(fù)合體的精細(xì)化結(jié)構(gòu)[42]。

Tab 1 Biological characteristics of SARS-CoV, MERS-CoV and SARS-CoV-2

在基因型-組織表達(dá)數(shù)據(jù)庫(genotype-tissue expression,GTEx)中，ACE2 mRNA可廣泛表達(dá)于全身各組織器官(Fig 1)，其中在睪丸組織表達(dá)最高，其次是小腸末端回腸，而肺、腎臟、心臟等組織ACE2表達(dá)量相似，提示其均為新型冠狀病毒的易感器官。值得注意的是，ACE2組織表達(dá)分布提示睪丸表達(dá)量很高，提示病毒很可能作用于該器官，引起病毒性睪丸炎[43]，因此治愈出院的新冠肺炎年輕男性患者，更需要定期隨訪。

3 新冠肺炎的免疫失衡及干預(yù)策略

雖然目前臨床上大部分新冠肺炎患者癥狀較輕，但仍存在部分患者早期病情較輕，后期突然加重的現(xiàn)象，最終死于多器官功能衰竭，而加重的原因可能是細(xì)胞因子風(fēng)暴[5,37]。此外，新冠肺炎患者的中性粒細(xì)胞異常增多，同時(shí)伴隨著淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)的顯著降低[5,37-38]。這些現(xiàn)象提示新冠肺炎發(fā)病過程中存在免疫應(yīng)答失調(diào)，下面將對(duì)這些現(xiàn)象進(jìn)行逐一剖析，以進(jìn)一步了解新冠肺炎發(fā)病的免疫應(yīng)答機(jī)制，為制定相應(yīng)的干預(yù)策略提供依據(jù)。

3.1 細(xì)胞因子風(fēng)暴——新冠肺炎患者的“奪命殺手”細(xì)胞因子風(fēng)暴(cytokine storm)一詞首次出現(xiàn)在1993年一篇關(guān)于移植物抗宿主疾病的文章中[44]。從2000年開始它被廣泛使用在多種感染性疾病如乙型溶血性鏈球菌感染、流感以及SARS中。近年來，細(xì)胞因子風(fēng)暴也成為CART細(xì)胞療法帶來的最主要的副作用。那么什么是細(xì)胞因子風(fēng)暴，細(xì)胞因子風(fēng)暴，又稱炎癥風(fēng)暴，是指機(jī)體在感染微生物或者其他劇烈刺激的情況下，免疫系統(tǒng)被過度激活，導(dǎo)致體液中多種細(xì)胞因子迅速大量產(chǎn)生的現(xiàn)象。細(xì)胞因子風(fēng)暴引發(fā)的炎癥從局部開始通過系統(tǒng)循環(huán)擴(kuò)散到全身，從而導(dǎo)致多種疾病如急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)、敗血癥、急性胰腺炎等發(fā)生，嚴(yán)重威脅患者生命[45]。

在SARS冠狀病毒相關(guān)的細(xì)胞因子風(fēng)暴中，重癥SARS患者血清中的促炎細(xì)胞因子(如IFN-γ, IL-1β, IL-6, IL-12, TGF-β)和趨化因子(如CXCL10,CXCL9, CCL2, IL-8)呈現(xiàn)高表達(dá)[46-49]，但抗炎因子IL-10則低表達(dá)[46]。類似地，在MERS冠狀病毒引起的細(xì)胞因子風(fēng)暴中，重癥患者血清中的促炎因子(如IFN-γ,TNF-α,IL-15,IL-17)和趨化因子(如CXCL10,CCL5,IL-8)高表達(dá)[50-52]。近來爆發(fā)的新冠肺炎重癥患者血漿中的IL-2, IL-7, IL-10, G-CSF, IP10, MCP-1, MIP-1A和TNF-α顯著升高[37]。值得注意的是，抗炎因子IL-10在SARS和新冠肺炎重癥患者中的表達(dá)趨勢(shì)完全相反。IL-10會(huì)抑制許多促炎細(xì)胞因子、趨化因子和趨化因子受體的表達(dá)，對(duì)細(xì)胞因子風(fēng)暴起到抑制作用。新冠肺炎尤其是重癥患者外周血抗炎因子IL-10上升的原因有待進(jìn)一步研究。

對(duì)于新冠肺炎尤其是重癥患者的治療，除了一些抗病毒藥物外，基于細(xì)胞因子風(fēng)暴進(jìn)行干預(yù)已成為減輕患者過度炎癥反應(yīng)的有效策略(Fig 2)。IL-6是造成細(xì)胞因子風(fēng)暴的典型促炎因子，IL-6阻斷策略已成功用于多種慢性炎癥疾病的治療。根據(jù)美國國家癌癥研究所提出的CTCAE v4.0制定了與抗體治療相關(guān)的細(xì)胞因子風(fēng)暴的分級(jí)系統(tǒng)，在患者出現(xiàn)危及生命的癥狀，需要呼吸機(jī)支持或達(dá)到四級(jí)器官毒性時(shí)，可采用抗IL-6聯(lián)合糖皮質(zhì)激素治療的手段[53]。第一個(gè)IL-6抑制劑托珠單抗(Tocilizumab)是一種人源化的抗IL-6受體單克隆抗體，目前廣泛用于類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的治療[54]。通過分析123例新冠肺炎患者外周血和細(xì)胞因子分析狀況，臨床研究人員發(fā)現(xiàn)重癥患者中CD4 T和CD8 T細(xì)胞比例明顯降低，而促炎因子IL-6水平明顯升高，表明T細(xì)胞亞群和細(xì)胞因子可作為預(yù)測(cè)病情由輕到重轉(zhuǎn)變的依據(jù)之一[55]。目前以中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)附屬第一醫(yī)院牽頭的托珠單抗在新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)中的有效性及安全性的多中心、隨機(jī)對(duì)照臨床研究(注冊(cè)號(hào)：ChiCTR2000029765)正在開展中。TNF-α是急性病毒性疾病中十分關(guān)鍵的細(xì)胞因子，可通過過度的炎癥反應(yīng)加重冠狀病毒的致病性。已有研究報(bào)道，使用TNF-α中和抗體或可溶性TNF-α受體融合蛋白治療可減少流感病毒感染的小鼠肺部細(xì)胞因子產(chǎn)生和炎性細(xì)胞浸潤[56-57]。在小鼠模型中敲除TNF-α受體可明顯緩解SARS冠狀病毒感染所導(dǎo)致的嚴(yán)重組織損傷[58]。臨床報(bào)道新冠肺炎重癥患者血漿中TNF-α水平顯著上升[37]，提示在重癥患者上使用TNF-α中和抗體亦是阻斷細(xì)胞因子風(fēng)暴的有效手段。阿達(dá)木單抗為抗人腫瘤壞死因子(TNF)的人源化單克隆抗體。事實(shí)上，上海長征醫(yī)院已在中國臨床試驗(yàn)注冊(cè)中心申請(qǐng)格樂立(阿達(dá)木單抗)治療新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)重型和危重型患者的安全性和有效性的臨床研究(注冊(cè)號(hào)：ChiCTR2000030089 )。

Fig 1 ACE2 mRNA expression distribution in human tissues based on GTEx database

Fig 2 Cytokine storm, also termed cytokine-release syndrome, in SARS-CoV-2-induced acute respiratory distress syndrome (ARDS)

另一方面，鐘南山院士團(tuán)隊(duì)分析了1 099新冠肺炎病例發(fā)現(xiàn)，只有43.1%的患者在入院時(shí)出現(xiàn)發(fā)熱癥狀，即使是重癥患者發(fā)熱比例也只有47.4%，而在這些重癥發(fā)熱患者中，入院時(shí)體溫大于38.0 ℃的高熱只占26.3%[59]。對(duì)比1 425 例SARS患者的臨床數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，其發(fā)熱比率高達(dá)94%[60]，可見新冠肺炎患者就診時(shí)發(fā)熱的比例明顯低于SARS患者。南京市第二醫(yī)院聯(lián)合南京大學(xué)的研究團(tuán)隊(duì)最近發(fā)現(xiàn)，相比于22例非新冠病毒感染的肺炎患者，71例普通型新冠肺炎患者T細(xì)胞和B細(xì)胞更加顯著地下降，而單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和NK細(xì)胞數(shù)量卻無顯著差異[38]，而這3種細(xì)胞恰恰是細(xì)胞因子風(fēng)暴的主要參與者。華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院的研究團(tuán)隊(duì)通過對(duì)外周血細(xì)胞因子動(dòng)態(tài)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與普通型新冠肺炎患者(27例)相比，重癥患者(13例)的多種細(xì)胞因子如IL-6、IL-2、TNF-α、IFN-γ以及IL-10僅在某一時(shí)間段有顯著性上升，而其他時(shí)間段兩組無明顯差異，且這些炎癥因子的血清水平相對(duì)較低[61]，從這13例新冠肺炎重癥患者來看，細(xì)胞因子風(fēng)暴的現(xiàn)象并不明顯，可能與目前的樣本數(shù)偏少有關(guān)。以上結(jié)果提示，對(duì)于新冠肺炎患者細(xì)胞因子風(fēng)暴是否為病情進(jìn)展的主要因素還需要進(jìn)一步確證。但不可否認(rèn)，失控的細(xì)胞因子風(fēng)暴會(huì)進(jìn)一步造成炎癥彌漫，導(dǎo)致肺泡結(jié)構(gòu)受損，進(jìn)而機(jī)體肺血氧不足，最終進(jìn)展為急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)，危及患者生命。

3.2 中性粒細(xì)胞捕獲網(wǎng)——新冠肺炎的免疫干預(yù)新靶點(diǎn)中性粒細(xì)胞是外周血白細(xì)胞中最豐富的細(xì)胞類型，是機(jī)體先天免疫的重要組成部分，在介導(dǎo)炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)答方面發(fā)揮著十分重要的作用[62]。一方面，中性粒細(xì)胞可經(jīng)過沿血管內(nèi)壁運(yùn)動(dòng)、結(jié)合內(nèi)皮細(xì)胞選擇素/黏附素、遷移穿過內(nèi)皮-上皮細(xì)胞層等步驟在病毒感染24小時(shí)內(nèi)進(jìn)入肺泡腔中[63]。在肺泡腔內(nèi)，中性粒細(xì)胞被腔內(nèi)炎癥因子和病原體迅速激活，通過吞噬作用清除病原微生物[64]。另一方面，中性粒細(xì)胞可在炎癥環(huán)境下，釋放一種以DNA為骨架內(nèi)含多種殺菌蛋白的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，即中性粒細(xì)胞捕獲網(wǎng)(neutrophil extracellular traps, NETs)，可有效清除病原微生物，抑制其擴(kuò)散[65]。

然而，越來越多的研究表明：中性粒細(xì)胞及其胞外捕獲網(wǎng)既能殺滅入侵的病原微生物，又能加重組織器官的損傷。這主要?dú)w因于在清除病毒的過程中，中性粒細(xì)胞產(chǎn)生的活性氧、細(xì)胞因子、NETs均對(duì)上皮-內(nèi)皮屏障具有破壞作用[66]。有研究表明NETs參與了多種病毒包括流感病毒在內(nèi)感染導(dǎo)致的肺部炎癥進(jìn)程[67-72]。重癥流感患者的血漿中NETs水平明顯升高，同時(shí)中性粒細(xì)胞對(duì)IL-8或脂多糖刺激會(huì)釋放更多的MPO-DNA復(fù)合物；另外，H7N9和H1N1感染患者體內(nèi)NETs可以增加肺泡上皮細(xì)胞的通透性[67]。在甲型H1N1流感病毒PR8株侵染的小鼠模型中也觀察到過多NETs的形成，進(jìn)而損傷肺泡毛細(xì)血管，引發(fā)肺功能障礙[68]。補(bǔ)體C5a介導(dǎo)的NETs會(huì)加劇急性肺損傷病人對(duì)高致病性病毒的感染。在感染H1N1的小鼠模型中發(fā)現(xiàn)阻斷C5a會(huì)抑制中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞在氣道中的浸潤，減少NETs的形成以及肺上皮的損傷[69]。臨床研究表明[70]，急性呼吸窘迫綜合征患者支氣管肺泡灌洗液內(nèi)中性粒細(xì)胞的濃度和NETs的數(shù)量與疾病嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。值得一提的是，中性粒細(xì)胞暴露于急性呼吸窘迫綜合征患者支氣管肺泡灌洗液后可加速NETs的產(chǎn)生[71]，這也許歸因于肺泡灌洗液中細(xì)胞因子風(fēng)暴的作用。MERS患者和近來爆發(fā)的新冠肺炎患者均表現(xiàn)出中性粒細(xì)胞大量增多的現(xiàn)象[61,72]。全國首例新冠肺炎逝者的遺體解剖報(bào)告顯示，新冠肺炎主要引起深部氣道和肺泡損傷為特征的炎性反應(yīng)，肺部纖維化及實(shí)變沒有SARS導(dǎo)致的病變嚴(yán)重，但滲出性反應(yīng)較SARS明顯。尸體肺部切面可見大量粘稠的分泌物從肺泡內(nèi)溢出[73]，這或許與NETs在肺部異常聚集有關(guān)(Fig 3)，但分泌物形成的具體原因仍需研究。

Fig 3 Neutrophil extracellular traps (NETs) is possibly invovled in SARS-CoV-2-induced lung injury

目前，進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段的藥物也有與NETs潛在的關(guān)聯(lián)。例如，利用抗IL-6受體的單克隆抗體托珠單抗(Tocilizumab)治療新冠肺炎的臨床試驗(yàn)(注冊(cè)號(hào)：ChiCTR2000029765)已在開展之中，而IL-6是誘導(dǎo)NETs的重要炎癥因子。此外，新冠肺炎的治療方案中推薦了氯喹[74]，而已有研究顯示自噬抑制劑氯喹能抑制NETs的形成，提高胰腺炎小鼠的生存率[75]。相信隨著研究的深入，針對(duì)NETs為靶點(diǎn)的治療策略將為臨床病毒性肺炎提供新的選擇。

3.3 淋巴細(xì)胞亞群失衡——新冠肺炎臨床現(xiàn)象帶來的思考淋巴細(xì)胞(lymphocyte)可分為T淋巴細(xì)胞(T細(xì)胞)、B淋巴細(xì)胞(B細(xì)胞)和自然殺傷(NK)細(xì)胞，是免疫系統(tǒng)功能調(diào)節(jié)的主要執(zhí)行者。在免疫應(yīng)答過程中，當(dāng)各淋巴細(xì)胞亞群的數(shù)量及功能出現(xiàn)異常時(shí)，機(jī)體可發(fā)生一系列的病理改變。因此，淋巴細(xì)胞亞群失衡是反映機(jī)體免疫應(yīng)答異常的重要指標(biāo)[76]。

南京市第二醫(yī)院聯(lián)合南京大學(xué)的團(tuán)隊(duì)近期研究顯示，相比于非新冠病毒引起的肺炎(non-COVID-19)，新冠肺炎(COVID-19)患者出現(xiàn)明顯的T細(xì)胞和B細(xì)胞計(jì)數(shù)減少，且數(shù)量與器官損傷相關(guān)生化指標(biāo)呈負(fù)相關(guān)[38]。此外，鐘南山院士團(tuán)隊(duì)對(duì)1 099例新冠肺炎患者臨床特征的回顧性研究顯示，82.1%的患者出現(xiàn)淋巴細(xì)胞減少癥狀，其中重癥患者占95.5%(147/154)，顯著高于非重癥患者[59]。北京地壇醫(yī)院研究團(tuán)隊(duì)報(bào)道，中性粒細(xì)胞與淋巴細(xì)胞比值(neutrophil-to-Lymphocyte Ratio, NLR)可作為新冠肺炎患者發(fā)展為重癥的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[72]。深圳市第三人民醫(yī)院的研究團(tuán)隊(duì)，通過收集新冠肺炎患者支氣管肺泡灌洗液中的免疫細(xì)胞，利用單細(xì)胞TCR免疫組庫測(cè)序技術(shù)，發(fā)現(xiàn)與輕癥患者相比，重癥患者體內(nèi)可殺傷新冠病毒的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的克隆數(shù)目顯著下降[77]。這一系列的數(shù)據(jù)提示新冠肺炎患者出現(xiàn)明顯的淋巴細(xì)胞亞群失衡，從而造成免疫功能受損，這種情況在重癥患者上更為嚴(yán)重[37]。此外，陸軍軍醫(yī)大學(xué)的研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)新冠肺炎患者T細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯減少以及細(xì)胞因子的累積，而存活的T細(xì)胞也呈現(xiàn)功能耗竭狀態(tài)。隨著患者病情進(jìn)展，T細(xì)胞上PD-1和Tim-3表達(dá)增加，提示T細(xì)胞逐漸失能[78]。無獨(dú)有偶，四川大學(xué)華西醫(yī)院已經(jīng)在中國臨床試驗(yàn)注冊(cè)中心申請(qǐng)PD-1單抗用于治療新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)重型或危重型患者的臨床對(duì)照研究(注冊(cè)號(hào)：ChiCTR2000030028)，利用PD-1單抗阻斷PD-1/PD-L1通路，恢復(fù)T細(xì)胞功能改善免疫失衡。此外，減少的T細(xì)胞中，CD4及CD8 T細(xì)胞下降幅度更為顯著，且與病情嚴(yán)重程度正相關(guān)[55,61,79]。另一方面，解放軍總醫(yī)院王福生院士團(tuán)隊(duì)對(duì)一例新冠肺炎死亡患者進(jìn)行病理檢測(cè)[80]，外周血的流式分析發(fā)現(xiàn)CD4及CD8 T細(xì)胞數(shù)量雖然大幅降低，但T細(xì)胞的狀態(tài)卻被顯著激活。CD4 T細(xì)胞中具有高促炎效應(yīng)的Th17細(xì)胞數(shù)量增加，CD8 T細(xì)胞則呈現(xiàn)高顆粒酶細(xì)胞毒性，這一現(xiàn)象似乎可以解釋患者出現(xiàn)的嚴(yán)重免疫損傷。Th17細(xì)胞作為T細(xì)胞獨(dú)特的一類分支，其表達(dá)失調(diào)使患者病情更加錯(cuò)綜復(fù)雜，同時(shí)提示淋巴細(xì)胞在新冠肺炎中的重要作用需要進(jìn)一步探究。總而言之，臨床治療中密切關(guān)注T細(xì)胞，尤其是CD4及CD8 T細(xì)胞數(shù)量及功能的變化，或?qū)⒅苯佑绊懞笃谥委煵呗缘倪x擇。

針對(duì)新冠肺炎患者出現(xiàn)淋巴細(xì)胞數(shù)量減少的現(xiàn)象，臨床上會(huì)使用諸如胸腺肽、丙種球蛋白等改善機(jī)體低下的免疫功能；而由細(xì)胞因子引發(fā)的免疫系統(tǒng)正反饋而造成的細(xì)胞因子風(fēng)暴，臨床上最常用的藥物為糖皮質(zhì)激素，然而糖皮質(zhì)激素在抑制細(xì)胞因子風(fēng)暴的同時(shí)會(huì)引發(fā)免疫抑制并延緩冠狀病毒的清除，有繼發(fā)性感染等風(fēng)險(xiǎn)[81]。最近來自Lancet的述評(píng)探討了糖皮質(zhì)激素治療新冠肺炎的可行性，文章指出將糖皮質(zhì)激素用于新冠肺炎的治療需要符合相應(yīng)的臨床指征[82]。糖皮質(zhì)激素使用的時(shí)機(jī)和劑量對(duì)于合理有效的免疫調(diào)節(jié)至關(guān)重要，需要更多有價(jià)值的研究為疫情診療提供證據(jù)，并推動(dòng)相關(guān)指南的制定。

綜上可知，對(duì)于新冠肺炎患者尤其是重癥患者，病情的轉(zhuǎn)折可能與淋巴細(xì)胞亞群失衡造成的免疫功能紊亂有關(guān)。通過結(jié)合患者基本臨床特征與淋巴細(xì)胞的數(shù)量、功能以及細(xì)胞因子的種類、水平，有望挖掘出新冠肺炎診斷及預(yù)后的潛在標(biāo)志物。

4 總結(jié)與展望

新冠肺炎發(fā)病是病毒與機(jī)體免疫系統(tǒng)“互相博弈”的過程，面對(duì)病毒的感染，機(jī)體需要啟動(dòng)免疫系統(tǒng)及時(shí)識(shí)別、清除病毒，但是失調(diào)的、過度的免疫反應(yīng)又會(huì)引起患者體內(nèi)炎癥因子過度表達(dá)而出現(xiàn)細(xì)胞因子風(fēng)暴。此外，臨床上觀察到新冠肺炎患者往往出現(xiàn)中性粒細(xì)胞的大量累積以及淋巴細(xì)胞數(shù)量的下降，這些都有望成為新冠肺炎免疫干預(yù)的切入環(huán)節(jié)。目前，多種已上市藥物或臨床前階段的候選藥物正在積極開展臨床試驗(yàn)用于新冠肺炎的防治[83-84]。這其中的一些藥物發(fā)揮療效離不開對(duì)免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)。未來研究人員將進(jìn)一步深入探索新冠肺炎發(fā)病過程中的免疫應(yīng)答機(jī)制，闡明相關(guān)的靶點(diǎn)及信號(hào)通路，以推動(dòng)治療藥物和疫苗的研發(fā)，為臨床上新冠肺炎的診療及預(yù)后提供可靠的科學(xué)依據(jù)。