復(fù)方黃芪降糖顆粒對四氧嘧啶致高血糖小鼠的降糖作用研究

張亞楠，趙瓊玥，岳可心，宋鳳瑞，劉志強(qiáng)，皮子鳳※

（1.中國科學(xué)院長春應(yīng)用化學(xué)研究所，吉林 長春 130022；2.吉林大學(xué)藥學(xué)院，吉林 長春 130021）

糖尿病，中醫(yī)謂之“消渴”，臨床具有陰津虧損、飲食不節(jié)、體形肥胖等表現(xiàn)。在西醫(yī)理論中，糖尿病是一種以高血糖為特征的常見代謝性內(nèi)分泌疾病。根據(jù)糖尿病的發(fā)病機(jī)制進(jìn)行劃分，主要有I 型糖尿病和II 型糖尿病。由于糖尿病具有發(fā)病率高、并發(fā)癥多的特點(diǎn)，已成為危害人類健康的高發(fā)疑難疾病。復(fù)方黃芪降糖顆粒（FFHQ）是中國科學(xué)院長春應(yīng)用化學(xué)研究所自主研發(fā)的中藥復(fù)方，由黃芪和白芍等中藥組成。黃芪中主要含有三萜皂苷類、多糖類和黃酮類三大類成分，此外還含有亞油酸、亞麻酸、綠原酸和微量元素等多種化學(xué)成分。三萜皂苷類為黃芪中主要的有效成分，黃芪甲苷含量最高[1]。Jiang等[2]研究發(fā)現(xiàn)，黃芪甲苷通過誘導(dǎo)脂肪細(xì)胞的TNF分泌，降低3T3-L1 脂肪細(xì)胞的脂解作用，改善胰島的耐受性。此外，呂琳[3]研究表明，黃芪甲苷可以通過抑制肝臟中糖原磷酸化酶和葡萄糖-6-磷酸酶的活性，進(jìn)而減少肝糖原的分解和葡萄糖的氧化，從而發(fā)揮其降糖作用。宋恩峰等[4]在黃芪提取物降糖作用的研究中給予STZ所致的糖尿病大鼠灌胃給藥黃芪注射液（5 mg/kg），發(fā)現(xiàn)黃芪注射液可以顯著改善大鼠蛋白尿、腎臟肥大、腎臟病變等癥狀，說明黃芪提取物對糖尿病并發(fā)癥有一定的療效。張利[5]通過對白芍（Paeonlae Radix Alba）藥理作用的研究進(jìn)展進(jìn)行總結(jié)發(fā)現(xiàn)，白芍提取物的主要成分為萜類及苷類、黃酮類、多糖類和鞣質(zhì)類化合物，而白芍總苷（total glucosides of paeony，TGP）是其中主要的有效成分，以單萜苷類化合物為主[6]。張薔等[7]研究發(fā)現(xiàn)，TGP可以從提高胰島素敏感性、改善脂質(zhì)代謝和降低尿蛋白排泄等幾個方面發(fā)揮保護(hù)糖尿病動物腎臟的作用。研究發(fā)現(xiàn)以TGP 灌胃給藥8 周后，糖尿病大鼠腎組織中的 p38 MAPK磷酸化、NF-Bp65 的表達(dá)均下降，表明TGP可能是通過抑制p38 MAPK 信號通路和激活NF-B 來實(shí)現(xiàn)對糖尿病腎臟的保護(hù)作用[8]。TGP 可以降低糖尿病大鼠24 h尿白蛋白排泄率，且該作用呈劑量依賴性；Western-blot 結(jié)果表明TGP 給藥8 周可顯著下調(diào)腎組織中 p-JAK2、p-STAT3 和 1（IV）型膠原蛋白的表達(dá)，表明TGP可能通過抑制腎臟JAK/STAT信號通路的激活發(fā)揮改善糖尿病大鼠早期腎損害的作用[9-10]。

本研究旨在通過糖尿病小鼠模型和體外 HepG2細(xì)胞胰島素抵抗試驗(yàn)，考察FFHQ 對糖尿病小鼠空腹血糖（GLU）、糖耐量（GT）、糖原水平、血清胰島素水平、胰島素抵抗等各項(xiàng)糖尿病相關(guān)指標(biāo)的影響，進(jìn)而評價(jià)復(fù)方黃芪降糖顆粒的降糖作用，同時對其作用機(jī)制進(jìn)行初步探討。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試驗(yàn)材料 復(fù)方黃芪降糖顆粒（FFHQ）由中國科學(xué)院長春應(yīng)用化學(xué)研究所自制，每1 g 顆粒相當(dāng)于飲片0.84 g，其中含黃芪0.21 g、白芍0.21 g。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動物 試驗(yàn)用小鼠為雄性昆明小鼠，體重為18～22 g（吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供）

1.1.3 試劑 四氧嘧啶（ALX）（Sigma 公司）；阿卡波糖（德國拜耳公司）；胰島素（Insulin，Ins）、二甲雙胍（Aladdin 公司）；高糖改良的 eagle 培養(yǎng)基（Dulbecco’s modified eagle medium，DMEM）、胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）（美國 Life 公司）；糖原含量測定試劑盒、小鼠胰島素ELISA 檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所有限公司）；葡萄糖測定試劑盒（上海榮盛生物藥業(yè)有限公司）；檸檬酸、檸檬酸鈉（上海前塵生物科技有限公司）；血糖儀、血糖試紙（北京怡成生物電子技術(shù)股份有限公司）；HepG2 細(xì)胞系（中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫）。

1.2 儀器與設(shè)備

TECAN GENios 酶標(biāo)儀（瑞士 Tecan 公司）；Centrifuge 5810R 型冷凍離心機(jī)（德國Eppendorf 公司）；HX-200A型中藥粉碎機(jī)；SanoriusBSl10S分析天平（北京賽多利斯有限公司）；96 孔板（美國Corning 公司）；BB15 CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國Thermo 公司）。

1.3 方法

1.3.1 四氧嘧啶型糖尿病小鼠模型的構(gòu)建 試驗(yàn)用小鼠禁食38 h 后，尾靜脈注射ALX 75 mg/kg，給予普通飼料，飼養(yǎng)84 h 后，禁食12 h，剪尾取血，測定血糖值，若測定值大于16 mmol/L，則造模成功，給予普通飼料喂養(yǎng)。

1.3.2 小鼠分組及給藥 試驗(yàn)動物共分為7 組，每組10 只分別為模型組、空白組、高劑量組、中劑量組、低劑量組、陽性對照組、空白給藥組。FFHQ 按成人每日推薦食用量20 g，體重以60 kg 計(jì)，相當(dāng)于0.33 g/kg，擴(kuò)大 5、10、20 倍，給藥量分別為 1.65、3.30、6.60 g/kg，依次作為FFHQ-L、FFHQ-M、FFHQ-H 組，灌胃給藥；陽性對照組灌胃二甲雙胍溶液（0.0025 g/kg）；空白組和模型組以蒸餾水灌胃（0.02 mL/g）；空白給藥組以FFHQ 高劑量灌胃（5.6 g/kg）。各組小鼠給藥劑量見表1，每日 1 次，連續(xù)給藥 30 d。

1.3.3 HepG2 細(xì)胞胰島素抵抗試驗(yàn)[11-12]HepG2 細(xì)胞在DMEM 高糖培養(yǎng)基（含10%FBS、1%雙抗）中培養(yǎng)，置于飽和濕度為5%、溫度為37 ℃的CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中，細(xì)胞貼壁長滿后，用胰蛋白酶消化，傳代。將細(xì)胞（處于對數(shù)生長期）以5 104cells/孔接種于96 孔板，置于培養(yǎng)箱中孵育24 h，待細(xì)胞貼壁后棄去培養(yǎng)液，以其中6 個細(xì)胞孔作為正常對照，其余細(xì)胞孔用于造模。

將HepG2 細(xì)胞分為模型組、陽性對照組（二甲雙胍）、FFHQ 降糖顆粒提取物組每組6 個復(fù)孔?？瞻捉M細(xì)胞孔內(nèi)加入5%FBS的高糖DMEM培養(yǎng)液200L，模型組細(xì)胞孔內(nèi)加入含10 6 mol/L胰島素、1%FBS的高糖DMEM 培養(yǎng)液200L，培養(yǎng) 48 h 棄去培養(yǎng)液，待胰島素抵抗模型成功，根據(jù)分組情況加入相對應(yīng)的培養(yǎng)液200L，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h 后，測定上清中葡萄糖的含量，計(jì)算消耗量，另用MTT 比色法檢測細(xì)胞的增殖情況。分組如下：

1.4 指標(biāo)測定

1.4.1 小鼠GLU 和GT 給藥30 d 后，禁食12 h。末次灌胃給藥30 min 后，小鼠進(jìn)行剪尾采血，用血糖試紙和血糖儀測定GLU，以此為GT0 min 血糖值。葡萄糖以2.0 g/kg灌胃各組小鼠，于30、60、120 min測定血糖值。記錄各時間點(diǎn)的血糖值，并計(jì)算血糖曲線下面積（AUC）。

血糖曲線下面積（AUC）=0 min（血糖測定值）0.25+30 min（血糖測定值）0.5+60 min（血糖測定值）0.75+120 min（血糖測定值）0.5

1.4.2 小鼠血清胰島素、肝糖原、肌糖原含量 各組小鼠在末次給藥后，禁食（不禁水）12 h，摘眼球取血，低溫靜置30 min后離心10 min（3 000 r/min），分離血清，采用小鼠胰島素試劑盒測定血清胰島素的含量。摘眼球取血后，處死動物，迅速取出肝臟、右側(cè)大腿后肢肌肉，采用糖原試劑盒測定肝糖原、肌糖原含量。

1.4.4 HepG2 細(xì)胞MTT 測定 棄去待檢測MTT 細(xì)胞的原培養(yǎng)液，每孔加入20L5mol/LMTT 溶液，37℃孵育240min后棄去孔內(nèi)溶液，加入100LDMSO，37℃振蕩培養(yǎng)10 min，測定570 nm 處吸光度。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

數(shù)據(jù)均以x ± SD 表示，組間比較用t 檢驗(yàn)，所得數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS10.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 FFHQ對四氧嘧啶誘導(dǎo)糖尿病小鼠的影響

2.1.1 FFHQ 對GLU 和 GT 的影響 經(jīng)FFHQ 給藥30 d 治療后測定各組小鼠的GLU，結(jié)果見表1。在30 d試驗(yàn)中，空白組、空白給藥組的GLU相比較，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明FFHQ 對正常動物血糖無影響。給藥30 d中，模型組一直保持高GLU 水平，總體呈現(xiàn)略有上升的趨勢；給藥30 d 后，高劑量組（FFHQ-H）、中劑量組（FFHQ-M）、低劑量組（FFHQ-L）、陽性對照組的小鼠GLU 與模型組相比均顯著降低（P ＜0.01 或 P ＜0.05）。同時，空白組、空白給藥組GLU 比較無顯著性差異，說明FFHQ 對正常動物血糖無影響。

表1 FFHQ 對小鼠 GLU 和 GT 的影響Table 1 Effects of compound Huangqi hypoglycemic granules on fasting blood glucose and glucose tolerance in mice

糖耐量試驗(yàn)需要測定0、30、60、120 min 血糖值，其中 0 min 血糖代表 GLU，30、60、120 min 3 個時間點(diǎn)的血糖測定值可以反映出藥物對GT 的影響。曲線下面積（AUC）如表1 所示，糖耐量曲線見圖1。由圖1 可知，各治療組小鼠以葡萄糖溶液（2 g/kg）灌胃后60、120 min 時的血糖值均明顯低于模型組，AUC 明顯降低（P ＜0.01），表明 FFHQ 能夠有效提升GT，各治療組作用效果相當(dāng)。

2.1.2 FFHQ 對血清胰島素、肝糖原和肌糖原含量的影響 ALX 通過對胰島B 細(xì)胞的不可逆性損傷導(dǎo)致Ins分泌絕對不足，從而使得血清中胰島素水平顯著降低，血糖升高。各組小鼠血清胰島素測定結(jié)果如表2 所示，與空白組相比，模型組小鼠血清中胰島素含量明顯降低，符合ALX型糖尿病疾病模型特征。各治療組中，高劑量（FFHQ-H）、中劑量（FFHQ-M）組血清中胰島素含量顯著高于模型組（P ＜0.05），而低劑量組血清中胰島素含量與模型組相比并未顯著升高，說明FFHQ在低劑量下，并不能促進(jìn)血清中胰島素分泌。

圖1 不同給藥組GT 曲線Fig.1 Sugar tolerance curve of different group

表2 FFHQ 對血清胰島素、肝糖原和肌糖原含量的影響Table 2 Effects of compound Huangqi hypoglycemic granules on content of serum insulin，liver glycogen and muscle glycogen in mice

糖原的合成對于血糖的穩(wěn)定具有重要的意義，肝糖原、肌糖原的含量可以說明FFHQ 是否經(jīng)過此途徑發(fā)揮降血糖的作用。各組小鼠肝糖原、肌糖原的含量測定結(jié)果如表2 所示。模型組肝臟和肌肉中的糖原含量與空白組相比顯著降低；經(jīng)FFHQ治療后的高、中劑量組，陽性對照組肝糖原、肌糖原含量顯著增加（P＜0.01或P＜0.05），而低劑量組雖略有增加但不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

四氧嘧啶通過選擇性破壞動物胰島 細(xì)胞，阻斷胰島素分泌，使血糖升高，常用來建立糖尿病小鼠模型。造模成功的小鼠會出現(xiàn)不同程度的多飲、多食、多尿、體重減輕等癥狀，經(jīng)過30 d 的治療，各治療組上述癥狀均有好轉(zhuǎn)。試驗(yàn)結(jié)果表明，各治療組均表現(xiàn)出良好的降血糖效果。高、中劑量組均能夠顯著地下調(diào)GLU、提升GT、增加肝糖原和肌糖原含量、促進(jìn)胰島素分泌。而低劑量組雖能夠顯著地下調(diào)GLU、提升GT，但在增加肝糖原和肌糖原含量、促進(jìn)胰島素分泌方面作用效果較弱。

2.2 HepG2胰島素抵抗試驗(yàn)結(jié)果

各給藥組對HepG2 胰島素抵抗的影響如表3 所示。

表3 FFHQ 對HepG2 胰島素抵抗的影響Table 3 Effects of compound Huangqi hypoglycemic granules on insulin resistance of HepG2

HepG2 胰島素抵抗體外細(xì)胞試驗(yàn)是目前應(yīng)用較廣泛的研究胰島素抵抗機(jī)制的模型，可用于篩選和研究改善胰島素抵抗作用的藥物。本試驗(yàn)采用MTT比色法對最終細(xì)胞的增殖情況進(jìn)行了檢測，測定結(jié)果見表3。由表3 可知，各試驗(yàn)組測定結(jié)果沒有明顯差異，表明各試驗(yàn)組雖然在誘導(dǎo)、給藥階段的細(xì)胞培養(yǎng)液成分存在差異，但細(xì)胞數(shù)目和細(xì)胞生長活力相對一致，從而保證了采用該胰島素抵抗模型對藥物進(jìn)行篩選的準(zhǔn)確性、客觀性和有效性。

由HepG2 胰島素抵抗模型試驗(yàn)結(jié)果可知，模型組由于胰島素抵抗的產(chǎn)生，在24 h 內(nèi)，對于低濃度水平胰島素（10 9 mol/L）刺激下的葡萄糖消耗量明顯低于空白組，而其他各組的葡萄糖消耗量明顯增加，胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)的HepG2 細(xì)胞對葡萄糖的消耗量恢復(fù)至正常水平。表明，F(xiàn)FHQ具有改善胰島素抵抗的作用。

3 結(jié)論

本研究利用四氧嘧啶誘導(dǎo)建立糖尿病小鼠模型和高濃度胰島素誘導(dǎo)的HepG2 細(xì)胞的胰島素抵抗模型，對復(fù)方黃芪降糖顆粒的降血糖藥效及作用機(jī)制進(jìn)行研究。結(jié)果表明，灌胃給藥治療（30 d）后，F(xiàn)FHQ 能明顯降低糖尿病小鼠的GLU，改善GT，具有明顯降血糖的作用；通過對其作用機(jī)制的研究，結(jié)果表明FFHQ通過提高GT、促進(jìn)胰島素分泌、增加肝糖原和肌糖原含量、改善胰島素抵抗來發(fā)揮藥效。