• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    出芽短梗霉發(fā)酵液中聚蘋果酸定量近紅外模型的建立與應(yīng)用

    2020-04-25 05:37:34張英昊薛照陽趙廷彬殷海松喬長晟
    食品科學(xué) 2020年8期
    關(guān)鍵詞:蘋果酸發(fā)酵液校正

    張英昊,薛照陽,趙廷彬,殷海松,喬長晟,,4,

    (1.天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院,天津 300457;2.天津慧智百川生物工程有限公司,天津 300457;3.天津現(xiàn)代職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物工程學(xué)院,天津 300350;4.天津市食品綠色制造及安全校企協(xié)同創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)室,天津 300457)

    聚蘋果酸是一種水溶性脂肪族聚酯,由蘋果酸單體以酯基聚合而成[1],在食品、藥品、化妝品、生物醫(yī)學(xué)材料、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域具有廣泛應(yīng)用前景。微生物發(fā)酵法現(xiàn)已成為生產(chǎn)聚蘋果酸的主要方式,其中出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)由于產(chǎn)量相對其他微生物高且具有胞外分泌的優(yōu)勢逐步成為了主要生產(chǎn)菌種[2-6]。

    發(fā)酵液中聚蘋果酸的傳統(tǒng)測量方法是利用高溫酸水解的方式先將聚蘋果酸水解成L-蘋果酸單體,然后對單體進(jìn)行測量。常用的測量方法有Goodban比色法[7]、酶試劑盒法[8]和液相色譜法,其中液相色譜法是目前最成熟的測量方式[9-10]。酸水解過程具有高能耗、高污染的缺陷;Goodban法副反應(yīng)嚴(yán)重,影響測量精度;酶方法所需的酶試劑盒價(jià)格較貴,不易保存,對操作環(huán)境要求也較高;液相色譜法雖然是最成熟的方式,但是具有測量耗時(shí)、對樣品具有破壞性、儀器設(shè)備昂貴笨重等缺陷。因此有必要開發(fā)新的檢測技術(shù)。

    近紅外檢測分析技術(shù)主要利用有機(jī)物中含氫化學(xué)鍵,如C—H、N—H、O—H、S—H等的倍頻與合頻吸收,對特定組分以快速無損、不需要化學(xué)試劑的方式進(jìn)行定量分析或定性判別[11]。近紅外光譜具有峰形嚴(yán)重重疊,峰強(qiáng)度較弱,信息冗余、雜峰多等特征,因此原始光譜難以用肉眼直接分析,需要以計(jì)算機(jī)軟件為工具對光譜進(jìn)行預(yù)處理,使用化學(xué)計(jì)量學(xué)方法建立數(shù)學(xué)模型計(jì)算待測物質(zhì)濃度,而偏最小二乘回歸(partial least square regression,PLSR)算法由于其良好的擬合精度,優(yōu)秀的泛化能力和相對而言較小的運(yùn)算量逐漸成為最常用的近紅外檢測數(shù)學(xué)建模算法,并在發(fā)酵制品的測量中得到廣泛應(yīng)用。例如董芹[12]利用近紅外檢測發(fā)酵液中透明質(zhì)酸的濃度和分子質(zhì)量;張樹明等[13]利用近紅外檢測葡萄酒發(fā)酵過程中的常用參數(shù);郭宇飛等[14]建立利用近紅外測量發(fā)酵液中L-色氨酸濃度的模型;Li Mengyao等[15]建立近紅外檢測生物反應(yīng)器培養(yǎng)CHO細(xì)胞過程中抗體濃度,細(xì)胞密度以及營養(yǎng)物質(zhì)濃度的模型。

    鑒于聚蘋果酸的價(jià)值以及近紅外檢測技術(shù)的優(yōu)勢,本實(shí)驗(yàn)選擇利用PLSR方法建立出芽短梗霉發(fā)酵液中聚蘋果酸濃度的近紅外定量模型,并進(jìn)一步驗(yàn)證此模型在單因素培養(yǎng)基優(yōu)化和誘變菌種篩選2 類實(shí)際應(yīng)用情景中對發(fā)酵液樣品的預(yù)測精度,以期為近紅外檢測模型在發(fā)酵工業(yè)中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    1.1.1 菌種

    出芽短梗霉CGMCC No.3337,保藏于天津北洋百川生物技術(shù)有限公司。

    1.1.2 培養(yǎng)基

    斜面保藏使用標(biāo)準(zhǔn)PDA固體培養(yǎng)基。種子培養(yǎng)基:蔗糖140 g/L、酵母粉3 g/L、丁二酸2 g/L、硫酸銨1 g/L、碳酸鉀0.4 g/L、磷酸二氫鉀0.1 g/L、硫酸鎂0.1 g/L、硫酸鋅0.05 g/L、碳酸鈣20 g/L(單獨(dú)滅菌)、玉米漿1 mL/L?;A(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基:蔗糖180 g/L、蛋白胨35 g/L、硝酸鈉2 g/L、硫酸鎂0.3 g/L、氯化鉀0.5 g/L、磷酸二氫鉀0.1 g/L、硫酸錳0.05 g/L、碳酸鈣20 g/L(單獨(dú)滅菌)。

    1.2 儀器與設(shè)備

    Antaris II傅里葉變換中近紅外光譜分析儀 美國賽默飛世爾科技有限公司;1100高效液相色譜分析儀 美國安捷倫科技有限公司;Sky2102搖床 上海蘇坤實(shí)業(yè)有限公司;YJ-875S醫(yī)用超凈臺(tái) 蘇州凈化設(shè)備廠;SPK-250B-Z生化培養(yǎng)箱 上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;LD5-10高速離心機(jī) 北京醫(yī)用離心機(jī)廠。

    1.3 方法

    1.3.1 培養(yǎng)條件

    搖瓶發(fā)酵:從PDA斜面挑取菌體接種于種子培養(yǎng)基中,在25 ℃、200 r/min條件下振蕩培養(yǎng)40 h,然后將種子液按體積分?jǐn)?shù)10%的比例接種于基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中,在25 ℃、200 r/min條件下振蕩培養(yǎng)144 h,期間每隔12 h取一次樣以產(chǎn)生不同的聚蘋果酸濃度。

    1.3.2 誘變篩選步驟

    按照文獻(xiàn)[16]的方法進(jìn)行紫外誘變菌種篩選,經(jīng)搖瓶培養(yǎng)120 h后取樣做相關(guān)測量。

    1.3.3 聚蘋果酸濃度的測定

    取10 mL發(fā)酵液,15 000 r/min離心10 min,收集上清液,吸取1 mL上清液于水解反應(yīng)釜中,加入4 mL水與5 mL濃度2 mol/L的硫酸溶液,于110 ℃水解7 h,將聚蘋果酸完全水解為L-蘋果酸。高效液相色譜法測定水解前后的L-蘋果酸含量并依據(jù)稀釋倍數(shù)換算為發(fā)酵液原液中的濃度,兩者之差即為發(fā)酵液聚蘋果酸含量。

    高效液相色譜檢測條件:J&K C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm);流動(dòng)相:25 mmol/L磷酸二氫鉀溶液(用磷酸調(diào)節(jié)pH值至2.5);柱溫25 ℃;恒定流速1 mL/min;進(jìn)樣量3 μL;紫外檢測器波長210 nm。

    1.3.4 發(fā)酵液近紅外光譜掃描

    應(yīng)用透射光譜模塊,以空氣作為掃描背景,室溫下每個(gè)樣品做3 次光譜采集,求平均光譜,每次采集掃描32次,掃描波長范圍4 000~10 000 cm-1,采樣間隔設(shè)置為2 cm-1。測試樣品為不同批次不同培養(yǎng)時(shí)間點(diǎn)取樣的發(fā)酵離心上清液。

    1.3.5 數(shù)據(jù)分析與建模

    1.3.5.1 樣本劃分

    建模共涉及109 個(gè)樣本,利用Kennard-Stone方法[17]劃分校正集和內(nèi)部驗(yàn)證集,其中校正集82 個(gè),內(nèi)部驗(yàn)證集27 個(gè),另用完全未參與建模的發(fā)酵液樣品50 個(gè)作外部驗(yàn)證集,驗(yàn)證模型對完全未知樣品的預(yù)測精度。

    分別取單因素優(yōu)化培養(yǎng)基樣品14 個(gè)以及紫外誘變菌株樣品集27 個(gè)作為外部驗(yàn)證集,驗(yàn)證模型在培養(yǎng)基優(yōu)化和誘變篩菌兩類應(yīng)用中的預(yù)測精度。其中單因素優(yōu)化樣品使用初始菌株,在基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中額外添加了2~10 g/L的硝酸鈉后經(jīng)搖瓶獲得樣品;誘變菌株樣品集使用誘變菌株接種培養(yǎng),在基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中經(jīng)搖瓶獲得樣品。

    1.3.5.2 特征波段的選擇

    分別以間隔偏最小二乘回歸(interval-partial least square regression,i-PLSR)法和移動(dòng)窗口偏最小二乘回歸(moving window-PLSR,mw-PLSR)法選擇特征波段[18-19],以交叉驗(yàn)證均方根誤差(root mean square error of cross validation,RMSECV)作為波段選擇依據(jù),對應(yīng)于最小的RMSECV的波段為最佳擬合波段。交叉驗(yàn)證的計(jì)算方法參考文獻(xiàn)[20]。本研究所有交叉驗(yàn)證均使用留一法。

    1.3.5.3 光譜預(yù)處理與聚蘋果酸定量建模

    光譜的一階導(dǎo)數(shù)、二階導(dǎo)數(shù)、多元散射校正(multiplicative scatter correlation,MSC)、標(biāo)準(zhǔn)正規(guī)變換(standard normal variation,SNV)等原理和計(jì)算公式參考文獻(xiàn)[21]。具體的實(shí)現(xiàn)方式,MSC依照其數(shù)學(xué)原理用R軟件自行編程,其他的處理利用R軟件prospectr包進(jìn)行[17];PLSR由R軟件PLS包實(shí)現(xiàn)[22],以RMSECV值作為PLSR算法中因子數(shù)選擇的標(biāo)準(zhǔn),對應(yīng)于最小RMSECV值的因子數(shù)具有最佳擬合精度。以內(nèi)部和外部驗(yàn)證集的均方根誤差(root mean square error of prediction set,RMSEP),以及液相色譜測量值與模型計(jì)算值間的相關(guān)系數(shù)R作為模型質(zhì)量的評價(jià)指標(biāo),RMSEP值越小且R越接近于1說明模型的定量擬合效果越好。RMSEP和R的計(jì)算公式如下,n為驗(yàn)證集中的樣本數(shù)。

    1.3.5.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

    使用SPSS軟件對校正集、內(nèi)部驗(yàn)證集和全部的外部驗(yàn)證集作配對t檢驗(yàn)以驗(yàn)證液相色譜測量值與模型計(jì)算值之間差異的顯著性,并計(jì)算測量值、模型預(yù)測值間的誤差置信區(qū)間;從外部驗(yàn)證集中挑選10 個(gè)樣本,分別以每個(gè)樣品掃描的3 次光譜平行代入模型算出濃度后進(jìn)行單樣本t檢驗(yàn),以驗(yàn)證模型對同一樣品測量的穩(wěn)定性。

    1.3.5.5 校正集樣品光譜代表性評價(jià)

    全部樣品集,對其特征波段范圍內(nèi)的近紅外光譜進(jìn)行主成分分析,并選擇方差貢獻(xiàn)率最大的前2 位主成分,作出主成分得分圖。主成分分析由R軟件內(nèi)置基本函數(shù)計(jì)算。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 液相色譜測定結(jié)果

    如圖1所示,保留時(shí)間4.4 min左右的峰為L-蘋果酸單體,樣品中的L-蘋果酸單體峰分離良好,可以基本實(shí)現(xiàn)精確的測量。對于近紅外定量建模,校正集測量結(jié)果的準(zhǔn)確性是實(shí)現(xiàn)模型精度的基本前提。

    圖 1 L-蘋果酸標(biāo)準(zhǔn)品(a)和酸水解發(fā)酵液上清液(b)液相色譜圖Fig. 1 HPLC chromatograms of L-malic acid (a) and the acid hydrolysate of the fermentation supernatant (b)

    2.2 校正集原始近紅外光譜

    圖 2 校正集的原始近紅外光譜Fig. 2 Raw near-infrared spectra of calibration set

    如圖2所示,芽短梗霉發(fā)酵液的近紅外光譜部分波段噪聲非常大,會(huì)嚴(yán)重影響定量精度,需要避開。而且出芽短梗霉發(fā)酵液成分高度復(fù)雜,除聚蘋果酸外,多糖和蛋白質(zhì)也會(huì)作為副產(chǎn)物被分泌至胞外[23-24]。因此根據(jù)聚蘋果酸的結(jié)構(gòu)特征查近紅外吸收表確定建模波段的方法不可靠,需要用計(jì)算的方式確定建模波段。

    2.3 建模波段選擇

    表 1 i-PLSR法選擇波段結(jié)果Table 1 Results of waveband selection using i-PLSR method

    表 2 mw-PLSR法選擇波段結(jié)果Table 2 Results of waveband selection using mw-PLSR method

    依次采用i-PLSR與mw-PLSR方法尋找特征波段,如表1、2所示。利用i-PLSR法先在全波段上粗略定位特征波段所在的大致范圍,再用mw-PLSR法進(jìn)一步精確定位,RMSECV越小則說明波段的預(yù)測精度越高。綜合表1、2結(jié)果可知,5 638~6 024 cm-1波段范圍對應(yīng)于最佳的擬合精度,為特征波段。依據(jù)常見化合物近紅外區(qū)段倍頻吸收表[25],該波段主要對應(yīng)于亞甲基和次甲基中的碳?xì)滏I的二倍頻吸收,是聚蘋果酸分子中存在的結(jié)構(gòu)。因此該波段可以對聚蘋果酸進(jìn)行定量。

    2.4 光譜預(yù)處理方式選擇

    表 3 不同預(yù)處理后的RMSECV值Table 3 RMSECV values with different pre-processing methods

    預(yù)處理通常能夠消除輸入光譜中的隨機(jī)誤差或基線漂移等不利因素,對建模往往有積極影響。如表3所示,每種組合條件下交叉驗(yàn)證過程中的PLSR運(yùn)算的因子數(shù)為對應(yīng)于最小的RMSECV值的因子數(shù)。RMSECV值越小,說明對應(yīng)的預(yù)處理?xiàng)l件能使模型預(yù)測精度最高。由表3可以看出,MSC+SNV+Savitzky-Golay 55點(diǎn)平滑+一級導(dǎo)數(shù)光譜的預(yù)處理組合能使模型預(yù)測精度最佳。

    圖 3 經(jīng)過波段選擇和光譜預(yù)處理后的校正集輸入光譜波形Fig. 3 Input spectra of calibration set with selected waveband and pre-processing method

    圖3 為5 638~6 024 cm-1特征波段在經(jīng)過MSC、SNV和Savitzky-Golay 55點(diǎn)平滑一級求導(dǎo)后的波形。該波形數(shù)據(jù)直接輸入PLSR模型用于聚蘋果酸的定量。

    2.5 模型的建立與質(zhì)量評價(jià)

    欠擬合與過擬合是數(shù)學(xué)建模中2 種常見的缺陷。其中欠擬合指的是模型輸入數(shù)據(jù)中與待測組分關(guān)聯(lián)的信息利用不充分,過擬合則是輸入數(shù)據(jù)中與待測組分無關(guān)的信息也被引入模型中。2 種情況均會(huì)使模型的精度下降。PLSR算法中不同的建模因子數(shù)目代表對原始數(shù)據(jù)不同程度的信息提取,故進(jìn)行建模前要確認(rèn)合適的建模因子數(shù)以平衡欠擬合與過擬合。從圖4可以看出,前5維因子對應(yīng)的RMSECV值均最低,說明此時(shí)模型預(yù)測狀態(tài)最佳。

    圖 4 PLS因子數(shù)目選擇結(jié)果Fig. 4 Selection of the number of partial least square factors

    圖 5 模型算法對校正集、內(nèi)部驗(yàn)證集和外部驗(yàn)證集樣品的預(yù)測結(jié)果Fig. 5 Model prediction results of samples in calibration set, internal test set and external test set

    以前5維因子進(jìn)行PLSR建模并分別驗(yàn)證模型對校正集和內(nèi)部驗(yàn)證集的預(yù)測精度,結(jié)果如圖5所示。其中RMSEC為1.619,Rc為0.983 3,內(nèi)部驗(yàn)證集預(yù)測均方根誤差(root mean square error of prediction,RMSEP)為1.553,Rp為0.970 0;外部驗(yàn)證集RMSEP為1.378,Rp為0.992 4。從RMSEP值,相關(guān)系數(shù)R值以及散點(diǎn)的直觀分布來看,模型預(yù)測效果基本滿意。

    2.6 模型在單因素培養(yǎng)基優(yōu)化和誘變篩菌中的應(yīng)用效果

    分別以單因素培養(yǎng)基優(yōu)化組和紫外誘變菌種篩選組的樣品經(jīng)搖瓶培養(yǎng)后的樣品,作為完全未知的外部驗(yàn)證集,用模型進(jìn)行聚蘋果酸濃度預(yù)測,結(jié)果如圖6所示。單因素培養(yǎng)基優(yōu)化樣品集的RMSEP為1.670,Rp為0.984 2;紫外誘變菌株樣品集的RMSEP為1.416,Rp為0.920 3。直觀上看這2 種情況下模型均具有尚可的預(yù)測效果。

    圖 6 模型對培養(yǎng)基單因素優(yōu)化組和誘變菌株組的預(yù)測結(jié)果Fig. 6 Model prediction results for medium composition optimization and mutant screening

    2.7 統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)結(jié)果

    以配對t檢驗(yàn)的方法分別檢驗(yàn)校正集、內(nèi)部驗(yàn)證集、外部驗(yàn)證集、單因素培養(yǎng)基優(yōu)化組和誘變菌株組的聚蘋果酸液相色譜測量值與模型預(yù)測值間的差異顯著性,并計(jì)算在95%置信度下誤差的置信區(qū)間,結(jié)果如表4所示。其中校正集、內(nèi)部驗(yàn)證集和外部驗(yàn)證集的液相色譜值和計(jì)算值間無顯著差異,而培養(yǎng)基單因素優(yōu)化組和誘變菌株篩選組則存在顯著差異,表明模型不適合在這2 類應(yīng)用中對質(zhì)量濃度進(jìn)行測量,尤其單因素培養(yǎng)基優(yōu)化組,其95%置信度下的最大誤差能達(dá)到3.8 g/L,相對于液相色譜值的范圍來說過大。內(nèi)部、外部驗(yàn)證集的測量值液相色譜值間無顯著差異,且偏差相對于液相色譜值而言小于最大值的5%,表明這種誤差是可以接受的。

    表 4 配對t檢驗(yàn)的結(jié)果Table 4 Result of paired t-test

    進(jìn)行培養(yǎng)基優(yōu)化或誘變篩菌時(shí),待測組分質(zhì)量濃度的相對大小往往比實(shí)際質(zhì)量濃度更受關(guān)注。根據(jù)單因素優(yōu)化組和誘變菌株組誤差的置信區(qū)間結(jié)果,結(jié)合置信區(qū)間的定義,可以得出2 個(gè)樣本模型計(jì)算值間的“最小差值”的計(jì)算公式,即置信區(qū)間上、下邊界之差的絕對值。2 個(gè)樣本在光譜計(jì)算結(jié)果偏差大于“最小差值”,即證明2 個(gè)樣本在給定置信度下在液相色譜值有顯著差異。因此在95%的置信水平上,單因素優(yōu)化組和誘變菌株組在模型計(jì)算值上的“最小差值”必須分別至少大于3.19 g/L和1.436 g/L才能以模型計(jì)算值的大小判斷液相色譜值,結(jié)合圖6結(jié)果,測量值與模型值間的線性較好,因此可以在滿足最小差值的條件下較可靠地由定量模型比較出組分大小。如表5所示,從外部驗(yàn)證集中抽出的10 個(gè)樣本,分別由各自同一樣品的3 個(gè)平行光譜計(jì)算質(zhì)量濃度值并進(jìn)行單樣本t檢驗(yàn),以驗(yàn)證3 次平行光譜的穩(wěn)定性。由結(jié)果可知每個(gè)樣本3 次平行經(jīng)t檢驗(yàn)的顯著性均顯著大于0.05,說明沒有差異,表明模型對同一個(gè)樣品的預(yù)測值具有很高的穩(wěn)定性。

    表 5 模型穩(wěn)定性檢驗(yàn)結(jié)果Table 5 Results of model stability test

    2.8 校正樣品光譜代表性評價(jià)

    圖 7 全體涉及樣本光譜代表性評價(jià)結(jié)果Fig. 7 Representativeness evaluation of all the samples

    對特征波段范圍的近紅外光譜進(jìn)行主成分分析評價(jià)樣品集光譜代表性,結(jié)果如圖7所示。校正集樣品的散點(diǎn)完全覆蓋了內(nèi)部和外部驗(yàn)證集,并且基本分布均勻,沒有明顯的離群點(diǎn)。內(nèi)部與外部驗(yàn)證集中也均沒有出現(xiàn)明顯偏離校正集范圍的樣本點(diǎn)。該結(jié)果說明樣品集的光譜具備代表性,可以在一定程度上代表實(shí)際運(yùn)用中常見的情況。

    3 討 論

    本實(shí)驗(yàn)雖然建立近紅外聚蘋果酸定量模型,但模型對部分樣品的預(yù)測結(jié)果相對于液相色譜測量值仍有較大誤差。因此有必要分析近紅外模型中誤差的來源。

    近紅外光譜具有信息高度重疊的特征,很難將背景組分對應(yīng)的光譜信息完全從目的組分的信息中排除,這表明近紅外檢測相對于中紅外等傳統(tǒng)光譜分析技術(shù)的外推性能較差,定量模型的精度高度受背景組分的影響。因此近紅外模型的校正集樣品要盡可能地包含各種可能出現(xiàn)的背景信息,即具備“代表性”[25]?!按硇浴钡谋憩F(xiàn)形式,即校正集樣品在光譜的主成分空間上應(yīng)該能覆蓋未知樣品,不能有明顯偏離,否則模型精度有可能降低。此時(shí)需要不斷輸入新的校正集樣品擴(kuò)大校正集的代表性,然后全體校正集樣本重新建模[25]以改善定量模型的精度(也可按照文獻(xiàn)[26]中所述方法先在主成分空間上進(jìn)行聚類,每一小類再分別建模并對類內(nèi)的未知樣品進(jìn)行預(yù)測,從而改善模型精度)。結(jié)合圖7結(jié)果看,校正集是具備代表性的。但是隨著未知樣品測量的增多,仍然需要適當(dāng)補(bǔ)充新的校正樣本。

    本實(shí)驗(yàn)所用PLSR本質(zhì)上是一種線性算法(即光譜矩陣可以經(jīng)歷一系列線性變換,或者乘上一個(gè)或幾個(gè)矩陣后得出質(zhì)量濃度矩陣)[27],用以描述光譜與質(zhì)量濃度間的換算關(guān)系;而在樣品存在散射干擾的情況下二者間的線性關(guān)系會(huì)發(fā)生偏離使預(yù)測精度不佳[28]。表3的光譜預(yù)處理方法最終確定了MSC+SNV+Savitzky-Golay 55點(diǎn)平滑+一階導(dǎo)數(shù)的預(yù)處理方式,能夠最好地改善預(yù)測精度;然而MSC+SNV(有時(shí)要進(jìn)一步結(jié)合導(dǎo)數(shù)光譜)是一種常用的消除散射因素干擾的預(yù)處理方式[21],加之出芽短梗霉發(fā)酵液黏稠、渾濁的直觀特征,暗示了出芽短梗霉中存在散射效應(yīng),并干擾了光譜與濃度間的線性關(guān)系,從而增大了誤差。因此,采用非線性算法改進(jìn)定量模型,是一個(gè)努力方向。

    液相色譜測量值的精度同樣也會(huì)增大誤差。如圖1b所示,液相色譜值質(zhì)量濃度需要對L-蘋果酸峰求峰面積計(jì)算得出。然而由于發(fā)酵液是一種高度復(fù)雜的混合物,液相色譜不一定能完全將L-蘋果酸的峰分離開,這種情況下算出峰面積會(huì)偏離實(shí)際,并進(jìn)一步在聚蘋果酸質(zhì)量濃度液相色譜測量值中引入較大的系統(tǒng)誤差。這很可能是導(dǎo)致本實(shí)驗(yàn)中誘變菌株組和單因素優(yōu)化組樣品的液相色譜、計(jì)算值間出現(xiàn)較大誤差的原因。因此合適的液相色譜測量條件對于近紅外建模的精度同樣重要。

    最后,本實(shí)驗(yàn)配對t檢驗(yàn)的結(jié)論雖然表明近紅外模型在單因素優(yōu)化和誘變篩菌中的誤差較大不能進(jìn)行測量,但是可以在2 個(gè)計(jì)算值的偏差大于“最小差值”條件下,通過比較2 個(gè)計(jì)算值的大小實(shí)現(xiàn)比較的液相色譜測量值大小的目的,且能夠排除因近紅外模型的誤差、波動(dòng)導(dǎo)致的“假陽性”現(xiàn)象,證明了近紅外模型在快速篩菌和組分優(yōu)化技術(shù)的中的應(yīng)用價(jià)值。

    4 結(jié) 論

    本實(shí)驗(yàn)首先聯(lián)合使用i-PLSR法與mw-PLSR法,確定建模波段為5 638~6 024 cm-1;隨后經(jīng)一系列優(yōu)化后依次使用MSC+SNV+Savitzky-Golay 55點(diǎn)平滑+一階導(dǎo)數(shù)光譜+前5維因子PLSR建立定量模型,模型的校正集RMSEC為1.619,Rc為0.983 3,內(nèi)部驗(yàn)證集RMSEP為1.553,Rp為0.970 0,外部驗(yàn)證集的RMSEP為1.378,Rp為0.992 4。結(jié)合統(tǒng)計(jì)分析的結(jié)果表明測量值與模型計(jì)算值間無顯著差異,誤差可以接受,模型穩(wěn)定性良好,可用于對組分的測量。進(jìn)一步驗(yàn)證模型在單因素培養(yǎng)基優(yōu)化和誘變菌種篩選應(yīng)用中的精度,并結(jié)合配對t檢驗(yàn)的置信區(qū)間結(jié)果,證明了雖然在這這2 類應(yīng)用中模型對聚蘋果酸質(zhì)量濃度的誤差較大,但可以在模型計(jì)算值的差值分別滿足大于3.19 g/L和1.436 g/L的前提下以95%的置信度比較出不同樣品中聚蘋果酸濃度大小,因此近紅外模型有應(yīng)用于誘變篩菌和培養(yǎng)基組分優(yōu)化的價(jià)值。

    猜你喜歡
    蘋果酸發(fā)酵液校正
    劉光第《南旋記》校正
    國學(xué)(2020年1期)2020-06-29 15:15:30
    連翹內(nèi)生真菌的分離鑒定及其發(fā)酵液抑菌活性和HPLC測定
    桑黃纖孔菌發(fā)酵液化學(xué)成分的研究
    中成藥(2018年1期)2018-02-02 07:20:03
    一類具有校正隔離率隨機(jī)SIQS模型的絕滅性與分布
    機(jī)內(nèi)校正
    一種基于eNode B的主動(dòng)式頻偏校正算法
    鴨心蘋果酸脫氫酶的分離純化及酶學(xué)性質(zhì)
    HPLC與LC-MS/MS測定蛹蟲草發(fā)酵液中蟲草素的方法比較
    木瓜發(fā)酵液對小鼠四氯化碳誘發(fā)肝損傷的防護(hù)作用
    殼聚糖和氯化鈣處理對采后黃冠梨蘋果酸代謝酶和相關(guān)基因表達(dá)的影響
    午夜福利一区二区在线看| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 亚洲精品中文字幕一二三四区| 99精品久久久久人妻精品| 成年女人毛片免费观看观看9 | 伊人久久大香线蕉亚洲五| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 亚洲熟妇熟女久久| 久久久久国内视频| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 国产1区2区3区精品| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 中文字幕制服av| 欧美午夜高清在线| 亚洲av日韩在线播放| 在线观看日韩欧美| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 国产精品亚洲一级av第二区| 1024香蕉在线观看| 日韩有码中文字幕| 精品久久久久久久久久免费视频 | 亚洲欧美日韩另类电影网站| 国产在线观看jvid| 丝袜美腿诱惑在线| 久久精品国产99精品国产亚洲性色 | 国产精品亚洲一级av第二区| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 欧美精品一区二区免费开放| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 丰满饥渴人妻一区二区三| 国产一区有黄有色的免费视频| 美女高潮到喷水免费观看| 天天操日日干夜夜撸| 色婷婷av一区二区三区视频| av电影中文网址| 国产99白浆流出| 少妇被粗大的猛进出69影院| 精品福利永久在线观看| 欧美一级毛片孕妇| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 久久婷婷成人综合色麻豆| 99精品欧美一区二区三区四区| 久久久久久久精品吃奶| 色婷婷av一区二区三区视频| av电影中文网址| 一级a爱视频在线免费观看| 在线观看免费视频日本深夜| 国产av又大| 在线看a的网站| 狠狠狠狠99中文字幕| 久久国产精品大桥未久av| 欧美午夜高清在线| xxxhd国产人妻xxx| 久久 成人 亚洲| 国产亚洲精品一区二区www | 亚洲精品在线美女| 国产精品国产高清国产av | 久久久久久人人人人人| 国产精品98久久久久久宅男小说| 午夜福利影视在线免费观看| 亚洲一区中文字幕在线| 欧美日韩av久久| 黄色成人免费大全| 中文亚洲av片在线观看爽 | 69av精品久久久久久| 亚洲国产欧美一区二区综合| 1024视频免费在线观看| 大码成人一级视频| 亚洲欧美一区二区三区久久| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 精品乱码久久久久久99久播| 久久久久久久久久久久大奶| 国产精品亚洲av一区麻豆| 啦啦啦在线免费观看视频4| 激情视频va一区二区三区| 黄色女人牲交| av超薄肉色丝袜交足视频| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 老司机亚洲免费影院| 午夜精品国产一区二区电影| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 中文欧美无线码| 母亲3免费完整高清在线观看| 69av精品久久久久久| 久9热在线精品视频| 国产国语露脸激情在线看| 老司机午夜福利在线观看视频| 成人18禁在线播放| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 亚洲av成人一区二区三| 欧美不卡视频在线免费观看 | 亚洲免费av在线视频| 一级毛片女人18水好多| www.自偷自拍.com| 香蕉丝袜av| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 欧美最黄视频在线播放免费 | 在线视频色国产色| 99国产综合亚洲精品| 精品国产一区二区久久| 中文字幕av电影在线播放| 一级a爱视频在线免费观看| 成年动漫av网址| 中文字幕人妻丝袜制服| 99久久国产精品久久久| 久久青草综合色| 少妇粗大呻吟视频| 亚洲,欧美精品.| 亚洲精华国产精华精| 777米奇影视久久| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 亚洲欧美色中文字幕在线| 午夜亚洲福利在线播放| 狂野欧美激情性xxxx| 久久久久国产精品人妻aⅴ院 | 国产在线精品亚洲第一网站| 久久久久久免费高清国产稀缺| 国产一区二区三区综合在线观看| 国产亚洲欧美98| 午夜福利影视在线免费观看| 欧美精品高潮呻吟av久久| 免费观看人在逋| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 麻豆乱淫一区二区| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放 | av不卡在线播放| 亚洲第一av免费看| 亚洲一码二码三码区别大吗| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 视频区图区小说| 色综合婷婷激情| 亚洲少妇的诱惑av| 久久人妻福利社区极品人妻图片| 成人三级做爰电影| 欧美日韩亚洲高清精品| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 最新美女视频免费是黄的| 中文字幕制服av| 91av网站免费观看| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看 | 国产精品免费大片| 女同久久另类99精品国产91| 欧美在线黄色| 男女免费视频国产| √禁漫天堂资源中文www| 国产精品99久久99久久久不卡| 久久精品国产清高在天天线| 女警被强在线播放| 一边摸一边抽搐一进一出视频| 搡老岳熟女国产| 一个人免费在线观看的高清视频| 成人国产一区最新在线观看| 看免费av毛片| 韩国av一区二区三区四区| 精品高清国产在线一区| 久久精品亚洲熟妇少妇任你| 亚洲三区欧美一区| 日韩成人在线观看一区二区三区| videosex国产| 香蕉国产在线看| 亚洲精品国产色婷婷电影| 国产成+人综合+亚洲专区| 成人av一区二区三区在线看| 亚洲成人国产一区在线观看| 久久久久久久精品吃奶| 在线av久久热| 免费一级毛片在线播放高清视频 | 18在线观看网站| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 黄色成人免费大全| 一二三四社区在线视频社区8| 日本一区二区免费在线视频| 成年版毛片免费区| 精品国产一区二区三区四区第35| 十八禁人妻一区二区| 91精品国产国语对白视频| 欧美av亚洲av综合av国产av| 精品熟女少妇八av免费久了| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 亚洲在线自拍视频| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 国产黄色免费在线视频| 午夜日韩欧美国产| 两个人免费观看高清视频| 久久九九热精品免费| 亚洲精品av麻豆狂野| av线在线观看网站| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 国产激情欧美一区二区| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 国产精品久久视频播放| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 久久久国产欧美日韩av| 在线观看免费日韩欧美大片| av电影中文网址| 日韩欧美一区视频在线观看| 国产成人av教育| 精品国产国语对白av| 国产免费av片在线观看野外av| 国产av又大| 亚洲自偷自拍图片 自拍| a级片在线免费高清观看视频| 日本一区二区免费在线视频| 91精品国产国语对白视频| 丁香欧美五月| 热99re8久久精品国产| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 91麻豆av在线| 国产精品影院久久| 日韩人妻精品一区2区三区| 中文字幕最新亚洲高清| 午夜影院日韩av| 久久久久国内视频| 亚洲欧美一区二区三区久久| 欧美黄色片欧美黄色片| 亚洲免费av在线视频| 国产精品亚洲一级av第二区| 午夜亚洲福利在线播放| 亚洲精品av麻豆狂野| 精品视频人人做人人爽| 久久这里只有精品19| 成年版毛片免费区| 91av网站免费观看| 国精品久久久久久国模美| 国产精品久久久av美女十八| 国产熟女午夜一区二区三区| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 国产伦人伦偷精品视频| 色尼玛亚洲综合影院| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 啪啪无遮挡十八禁网站| 亚洲av片天天在线观看| 亚洲成人国产一区在线观看| 精品久久蜜臀av无| 91字幕亚洲| 99国产精品一区二区蜜桃av | 国产免费现黄频在线看| www.精华液| 日韩免费av在线播放| 满18在线观看网站| 美国免费a级毛片| 亚洲av美国av| 中文字幕色久视频| 亚洲av片天天在线观看| 久久精品国产清高在天天线| 老司机午夜福利在线观看视频| 身体一侧抽搐| 在线观看午夜福利视频| 女性被躁到高潮视频| 99re6热这里在线精品视频| 首页视频小说图片口味搜索| 日韩免费av在线播放| 满18在线观看网站| 亚洲成人手机| 中文字幕av电影在线播放| 色在线成人网| 亚洲人成电影免费在线| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 国产精品二区激情视频| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 欧美+亚洲+日韩+国产| 一级片免费观看大全| 精品国产国语对白av| 另类亚洲欧美激情| 中文字幕色久视频| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 两性夫妻黄色片| 欧美性长视频在线观看| 成人免费观看视频高清| 9色porny在线观看| 亚洲视频免费观看视频| 一级片'在线观看视频| 妹子高潮喷水视频| 满18在线观看网站| 91九色精品人成在线观看| 亚洲av美国av| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 无遮挡黄片免费观看| 欧美精品一区二区免费开放| 亚洲精品成人av观看孕妇| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 国产片内射在线| 男人舔女人的私密视频| 麻豆av在线久日| 高清欧美精品videossex| 岛国毛片在线播放| 亚洲在线自拍视频| 国产精品国产av在线观看| 99久久精品国产亚洲精品| 999久久久精品免费观看国产| 精品免费久久久久久久清纯 | 一夜夜www| 国产成人免费无遮挡视频| 欧美激情 高清一区二区三区| 在线av久久热| 国产在线一区二区三区精| 亚洲五月婷婷丁香| 中文亚洲av片在线观看爽 | 亚洲色图av天堂| 久久中文字幕人妻熟女| 欧美最黄视频在线播放免费 | 国产午夜精品久久久久久| 超色免费av| 精品一区二区三区av网在线观看| 一进一出抽搐gif免费好疼 | 日韩人妻精品一区2区三区| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 天天躁日日躁夜夜躁夜夜| 黄色 视频免费看| 日本a在线网址| 中文字幕最新亚洲高清| 少妇粗大呻吟视频| 一个人免费在线观看的高清视频| √禁漫天堂资源中文www| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 欧美黑人欧美精品刺激| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 亚洲 欧美一区二区三区| 亚洲伊人色综图| 国产伦人伦偷精品视频| 夫妻午夜视频| 999久久久精品免费观看国产| 日韩视频一区二区在线观看| 777米奇影视久久| 一级黄色大片毛片| 亚洲成av片中文字幕在线观看| bbb黄色大片| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 午夜福利乱码中文字幕| 亚洲熟女精品中文字幕| 亚洲av成人一区二区三| 国产一区在线观看成人免费| 欧美成狂野欧美在线观看| 韩国av一区二区三区四区| 国产av一区二区精品久久| 国产av又大| 热99国产精品久久久久久7| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 在线永久观看黄色视频| 少妇的丰满在线观看| 欧美+亚洲+日韩+国产| 久久午夜亚洲精品久久| 欧美亚洲日本最大视频资源| 男人操女人黄网站| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 久久中文字幕一级| 精品久久久精品久久久| 精品久久久久久久毛片微露脸| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 99久久综合精品五月天人人| 久久狼人影院| 中出人妻视频一区二区| 国产亚洲精品第一综合不卡| 国产精品美女特级片免费视频播放器 | 国产成人欧美在线观看 | 欧美一级毛片孕妇| 国产亚洲精品第一综合不卡| 国产极品粉嫩免费观看在线| 国产在线一区二区三区精| 午夜精品久久久久久毛片777| 亚洲三区欧美一区| a在线观看视频网站| 又紧又爽又黄一区二区| 在线观看午夜福利视频| 丰满饥渴人妻一区二区三| 午夜福利在线观看吧| 九色亚洲精品在线播放| 久久精品91无色码中文字幕| 老司机在亚洲福利影院| 久久亚洲真实| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放 | avwww免费| 狂野欧美激情性xxxx| 男人舔女人的私密视频| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 免费在线观看影片大全网站| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 日韩制服丝袜自拍偷拍| 亚洲成a人片在线一区二区| 91成人精品电影| 国产成人欧美在线观看 | 人人澡人人妻人| 亚洲熟妇中文字幕五十中出 | 欧美 日韩 精品 国产| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 纯流量卡能插随身wifi吗| av福利片在线| 亚洲精品在线观看二区| 国产成人免费观看mmmm| av在线播放免费不卡| 欧美另类亚洲清纯唯美| 18禁国产床啪视频网站| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 一二三四社区在线视频社区8| 国产激情欧美一区二区| 99精国产麻豆久久婷婷| 99国产精品一区二区三区| 国产成人精品无人区| 亚洲国产精品合色在线| a级毛片在线看网站| 久久香蕉精品热| 久久午夜亚洲精品久久| av线在线观看网站| 777米奇影视久久| 国产高清激情床上av| 伦理电影免费视频| 国产一区二区三区综合在线观看| 亚洲av片天天在线观看| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 又黄又爽又免费观看的视频| 又大又爽又粗| 老熟妇仑乱视频hdxx| 日本wwww免费看| 村上凉子中文字幕在线| 窝窝影院91人妻| 90打野战视频偷拍视频| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | 最近最新中文字幕大全免费视频| 一级a爱视频在线免费观看| 欧美日韩成人在线一区二区| 日韩中文字幕欧美一区二区| 黄色片一级片一级黄色片| 日韩欧美国产一区二区入口| 中出人妻视频一区二区| 午夜免费观看网址| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 天天添夜夜摸| 手机成人av网站| 亚洲一区二区三区欧美精品| 国产精品久久久久久精品古装| 看黄色毛片网站| 国产午夜精品久久久久久| 9191精品国产免费久久| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 国产精品免费视频内射| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 免费看a级黄色片| 狂野欧美激情性xxxx| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 两个人看的免费小视频| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 超碰成人久久| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片 | 亚洲国产欧美一区二区综合| 亚洲欧美激情在线| 久99久视频精品免费| 亚洲伊人色综图| 亚洲综合色网址| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 亚洲中文日韩欧美视频| cao死你这个sao货| 婷婷成人精品国产| 两人在一起打扑克的视频| 一区福利在线观看| 亚洲精品久久午夜乱码| 免费观看人在逋| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 午夜精品在线福利| 亚洲美女黄片视频| 欧美中文综合在线视频| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 男男h啪啪无遮挡| 亚洲av日韩在线播放| 亚洲成人免费电影在线观看| 久久这里只有精品19| 亚洲国产看品久久| 亚洲情色 制服丝袜| 国产三级黄色录像| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | 亚洲国产欧美一区二区综合| 老司机靠b影院| e午夜精品久久久久久久| 日本欧美视频一区| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 天堂√8在线中文| 亚洲一区二区三区不卡视频| 交换朋友夫妻互换小说| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 久久久久国产一级毛片高清牌| 1024香蕉在线观看| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 欧美激情高清一区二区三区| 9热在线视频观看99| 成人手机av| 亚洲伊人色综图| 老司机福利观看| 高清视频免费观看一区二区| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 麻豆av在线久日| 男人舔女人的私密视频| 国产精品久久电影中文字幕 | 777米奇影视久久| 91麻豆精品激情在线观看国产 | 亚洲 国产 在线| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 欧美午夜高清在线| 99国产精品99久久久久| 精品福利永久在线观看| 久久久久久人人人人人| 大片电影免费在线观看免费| 亚洲av成人av| 亚洲国产精品合色在线| 久久性视频一级片| 久久久国产欧美日韩av| 亚洲avbb在线观看| 日韩欧美一区视频在线观看| 久久热在线av| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 手机成人av网站| 国产欧美日韩一区二区精品| 欧美在线黄色| 9色porny在线观看| 99国产综合亚洲精品| 国产视频一区二区在线看| 麻豆国产av国片精品| 国产精品影院久久| av网站在线播放免费| 18禁国产床啪视频网站| 午夜免费鲁丝| 国产av精品麻豆| 日日夜夜操网爽| 欧美日韩乱码在线| 中文亚洲av片在线观看爽 | 久久久精品免费免费高清| 国产成人免费无遮挡视频| 久久亚洲真实| 久久久久久久国产电影| 久久久国产一区二区| 在线免费观看的www视频| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 久久久久国内视频| 国产亚洲精品第一综合不卡| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 精品国产乱码久久久久久男人| 国产亚洲一区二区精品| 少妇的丰满在线观看| www.999成人在线观看| 老司机亚洲免费影院| 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 久久久国产欧美日韩av| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 亚洲一码二码三码区别大吗| 纯流量卡能插随身wifi吗| 国产成人啪精品午夜网站| 成人亚洲精品一区在线观看| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 精品国产一区二区久久| 人妻 亚洲 视频| 午夜日韩欧美国产| 欧美日韩成人在线一区二区| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 精品久久久久久久久久免费视频 | 亚洲av欧美aⅴ国产| 91字幕亚洲| 欧美精品av麻豆av| 精品国产乱码久久久久久男人| 999久久久精品免费观看国产| 777米奇影视久久| 日韩三级视频一区二区三区| 一边摸一边抽搐一进一出视频| bbb黄色大片| 欧美午夜高清在线| 亚洲专区字幕在线| 国产熟女午夜一区二区三区| 久久亚洲精品不卡| 黑人操中国人逼视频| 大香蕉久久成人网| 在线视频色国产色| 亚洲精品av麻豆狂野| 亚洲精华国产精华精| 国产日韩欧美亚洲二区| 人妻丰满熟妇av一区二区三区 | 亚洲午夜理论影院| 在线观看免费日韩欧美大片| 波多野结衣av一区二区av| 脱女人内裤的视频| 日韩人妻精品一区2区三区| 极品少妇高潮喷水抽搐| 欧美久久黑人一区二区| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 亚洲自偷自拍图片 自拍| 一区在线观看完整版| 欧美黑人精品巨大| 丝袜美足系列| 国产色视频综合| 国产不卡一卡二| 欧美最黄视频在线播放免费 | 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 美女午夜性视频免费| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 又大又爽又粗| 国产在线观看jvid| 国产成人免费无遮挡视频| 51午夜福利影视在线观看| 一边摸一边做爽爽视频免费| 热99re8久久精品国产| 亚洲第一青青草原| 成年人午夜在线观看视频| 91国产中文字幕| 99国产极品粉嫩在线观看| 多毛熟女@视频| 老司机影院毛片| 久久久久久免费高清国产稀缺| 美女扒开内裤让男人捅视频| 黄色视频,在线免费观看| 飞空精品影院首页| 欧美精品av麻豆av|