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    清醬香型白酒陶壇發(fā)酵細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)多樣性分析

    2020-04-25 05:37:28胡小霞黃永光朱家合
    食品科學(xué) 2020年8期
    關(guān)鍵詞:醬香型釀造清香

    胡小霞,黃永光,,*,蔣 想,朱家合,金 磊

    (1.貴州大學(xué)釀酒與食品工程學(xué)院,貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,貴州 貴陽 550025;2.貴州巖博酒業(yè)有限公司,貴州 盤州 553523;3.無錫市振太酒業(yè)有限公司,江蘇 無錫 214092)

    中國(guó)白酒是世界上最古老的蒸餾酒之一[1],在其發(fā)展進(jìn)程中,基于釀酒原料、釀造工藝、自然環(huán)境、糖化發(fā)酵劑等因素的差異,逐漸形成了各具特色、風(fēng)格典型的醬香、濃香、清香等12 種香型白酒[2]。隨著消費(fèi)需求發(fā)展,白酒釀造工藝和科技也隨之進(jìn)步,白酒香型不斷創(chuàng)新,清醬香型白酒正是香型創(chuàng)新的代表產(chǎn)物,目前在全國(guó)已獲得廣大消費(fèi)者認(rèn)可和青睞。清醬香型人民小酒采用本地產(chǎn)糯高粱為原料,高溫水泡糧煮糧,小曲糖化培菌、大曲堆積發(fā)酵生香,陶壇發(fā)酵或窖池長(zhǎng)期發(fā)酵,分級(jí)取酒,分類貯存,陳釀勾兌而成。其釀造工藝有機(jī)融合了清香型、醬香型白酒釀造之精華,酒體風(fēng)格“清亮透明,清醬協(xié)調(diào),香氣幽雅,醇厚豐滿,細(xì)膩柔順,回味悠長(zhǎng),空杯留香”,既滿足了清香型白酒的幽雅、凈爽,又富有醬香白酒的醇厚、細(xì)膩、回味悠長(zhǎng)風(fēng)格[3]。

    眾所周知,白酒釀造的產(chǎn)質(zhì)量與釀造過程微生物菌群結(jié)構(gòu)及其代謝密不可分,清醬香型白酒風(fēng)格之所以不同于典型的清香型和醬香型白酒,除在釀造工藝上的創(chuàng)新和不同外,更根本原因在于其釀酒微生物結(jié)構(gòu)的差異和釀造環(huán)境的獨(dú)特。目前研究普遍認(rèn)為,在白酒釀造微生物體系中,細(xì)菌有產(chǎn)酶和產(chǎn)香的能力[4],通過代謝產(chǎn)生豐富的風(fēng)味物質(zhì)決定白酒的香型和品質(zhì)[5-6]。白酒釀造過程中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)也一直是白酒界的研究熱點(diǎn)[7-9]。

    清醬香白酒作為創(chuàng)新香型白酒,還處于發(fā)展起步階段,釀造過程的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)體系尚不明確,這在一定程度上制約了它的發(fā)展。因此,為揭示釀酒微生態(tài)、功能微生物多樣性結(jié)構(gòu)對(duì)清醬香型人民小酒釀造及其酒體風(fēng)格影響的機(jī)理以及清醬香型白酒釀造過程中重要發(fā)酵微生物的調(diào)節(jié)機(jī)制,本研究通過高通量測(cè)序策略并結(jié)合數(shù)理統(tǒng)計(jì)系統(tǒng),分析清醬香型白酒陶壇發(fā)酵過程中的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu),并進(jìn)一步研究其主要細(xì)菌群落在發(fā)酵過程中的變化規(guī)律及調(diào)控機(jī)制,以期推動(dòng)清醬香型白酒的創(chuàng)新發(fā)展。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    1.1.1 樣品

    樣品采集自貴州省YB酒業(yè)有限公司2 個(gè)陶壇發(fā)酵生產(chǎn)車間(分別記為YB1和YB2,其入壇發(fā)酵時(shí)間和發(fā)酵工藝一致)2018年6—7月生產(chǎn)發(fā)酵酒醅,發(fā)酵期為21 d。每個(gè)車間同一天有50 壇酒醅入壇發(fā)酵,從中隨機(jī)抽取10 壇進(jìn)行跟蹤取樣,由于陶壇質(zhì)地、糟醅入壇溫度、水分、酸度、糟醅疏松度等相關(guān)因素影響,酒醅上層、中層、下層及內(nèi)層、外層微生物分布存在一定差異,因此,每次采集酒醅上、中、下3 個(gè)發(fā)酵酒醅層次的發(fā)酵酒醅樣品,每個(gè)發(fā)酵酒醅層采集中間和邊緣位置(圖1),然后將6 個(gè)點(diǎn)樣品均勻混合為一個(gè)樣品以消除取樣誤差,混合后取200 g存于無菌自封袋中。再將從10 個(gè)發(fā)酵壇中采集的樣品各取20 g混合為綜合樣。每次采集酒醅樣品樣均采用專業(yè)的取樣器定時(shí)定位取樣,取樣器消毒滅菌后,瞬間打開封壇蓋膜,取樣器刺穿到糟醅層面,迅速、嚴(yán)格進(jìn)行取樣操作,因取樣器直徑很小,只會(huì)留下1 個(gè)小孔,且取樣時(shí)間很短,取樣完畢后則立即將小孔密封,封壇。根據(jù)前期基礎(chǔ)研究和生產(chǎn)實(shí)際,由于發(fā)酵10 d后,發(fā)酵進(jìn)入穩(wěn)定階段,因此取樣時(shí)間定為發(fā)酵第1、5、10、20天。綜合樣分別記為YB1的1F 1 d、1F 5 d、1F 10 d、1F 20 d和YB2的2F 1 d、2F 5 d、2F 10 d、2F 20 d。樣品采集完畢則即時(shí)進(jìn)行DNA提取。

    圖 1 陶壇發(fā)酵酒醅取樣圖Fig. 1 Schematic of sampling positions of fermented grains from the pottery jar during fermentation

    1.1.2 試劑

    DNA Marker 寶生物工程(大連)有限公司;磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline,PBS)、引物合成上海生物工程股份有限公司;E.Z.N.A. Soil DNA Kit美國(guó)Omega BioTek公司;異丙醇(分析純)、TAE(Tris acetate-EDTA)緩沖液 北京索萊寶科技有限公司;瓊脂糖 南京生興生物技術(shù)有限公司;Goldview染料 上海賽百盛有限公司;rTaqDNA聚合酶試劑盒北京全式金生物技術(shù)有限公司。

    1.2 儀器與設(shè)備

    Zealway G154DW高壓蒸汽滅菌鍋 致徽(廈門)儀器有限公司;臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 德國(guó)Sigma公司;GeneAmp?9700型聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)儀 美國(guó)ABI公司;DYY-8C型電泳儀北京六一儀器廠;JS-680C凝膠成像儀 上海培清科技有限公司;MiSeq測(cè)序儀 美國(guó)Illumina公司;QuantiFluorTM-ST藍(lán)色熒光定量系統(tǒng) 美國(guó)Promega公司。

    1.3 方法

    1.3.1 樣品預(yù)處理[6,10-11]及DNA提取

    分別取1.1.1節(jié)最后混勻的8 個(gè)綜合樣各16 g于100 mL離心管中,用30 mL滅菌后的0.1 mol/L PBS懸浮,加入3~5 顆玻璃珠,旋渦振蕩7 min,400 r/min離心5 min,取上清液。沉淀用PBS洗滌,旋渦振蕩4 min,400 r/min離心5 min,收集上清液。將沉淀用PBS洗滌,旋渦振蕩2 min,400 r/min離心5 min,收集上清液。全部上清液于12 000 r/min離心5 min,棄上清液,收集細(xì)胞沉淀。預(yù)處理結(jié)束后,根據(jù)E.Z.N.A.?soil DNA Kit的操作說明提取各樣品中的微生物總DNA。

    1.3.2 16S rRNA基因擴(kuò)增及Illumina MiSeq測(cè)序

    應(yīng)用引物338F(5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’)和806R(5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’)擴(kuò)增V3和V4高變區(qū)。PCR體系及反應(yīng)條件見黃蘊(yùn)利等[12]的方法;每個(gè)樣本做3 個(gè)重復(fù)。將同一樣品的PCR產(chǎn)物混合后用1.1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),使用AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒切膠回收PCR產(chǎn)物,Tris-HCl洗脫;1.1%瓊脂糖電泳檢測(cè)。

    參照電泳初步定量結(jié)果,將PCR產(chǎn)物用QuantiFluorTM-ST藍(lán)色熒光定量系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)并定量,再按照每個(gè)樣本的測(cè)序量要求,進(jìn)行相應(yīng)比例的混合。連接“Y”字形接頭,使用磁珠篩選去除接頭自連片段,利用PCR擴(kuò)增進(jìn)行文庫模板富集,氫氧化鈉變性,產(chǎn)生單鏈DNA片段,制備MiSeq PE文庫。再在Illumina MiSeq(PE300)平臺(tái)上機(jī)測(cè)序。

    1.4 數(shù)據(jù)及圖像處理

    采用Microsoft Office Excel 2016進(jìn)行數(shù)據(jù)計(jì)算,IBM SPSS Statistics進(jìn)行顯著性分析,R語言繪制氣泡圖和群落差異分析圖,Cytoscape繪制共線性網(wǎng)絡(luò)分析圖和相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)圖。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 陶壇發(fā)酵過程細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析

    對(duì)兩組樣品細(xì)菌的高通量測(cè)序結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,圖2為清醬香型白酒陶壇發(fā)酵過程的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)氣泡圖。

    圖 2 發(fā)酵過程細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)多樣性在屬水平上的分布圖(相對(duì)豐度>1%)Fig. 2 Distribution of microbial community at the genus level(relative abundance > 1%)

    從YB1中檢出11 個(gè)門,從YB2中檢出9 個(gè)門,YB1和YB2酒醅樣品中共檢出Firmicutes、Proteobacteria、Actinobacteria、Bacteroidetes、Cyanobacteria、Deinococcus-Thermus、p_unclassified_k__norank、Fusobacteria、Saccharibacteria、Planctomycetes、Acidobacteria 11 個(gè)門,其中優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門(平均相對(duì)豐度>10%)為Firmicutes(67.09%)和Proteobacteria(31.42%),這與清香型[11,13]和醬香型[7,14]白酒發(fā)酵過程的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門一致。Firmicutes在清醬香型白酒發(fā)酵酒醅中占絕對(duì)主導(dǎo)地位,在清香型和醬香型白酒發(fā)酵酒醅中同樣如此,但豐度占比有所差異[7,11]。

    從YB1中檢出166 個(gè)屬,從YB2中檢出146 個(gè)屬,YB1和YB2酒醅樣品中共檢出178 個(gè)屬。如圖2所示,有21 個(gè)屬相對(duì)豐度至少在一個(gè)樣品中超過1%,分別是:Weissella、Staphylococcus、Lactobacillus、Oceanobacillus、Bacillus、Lentibacillus、Kroppenstedtia、Pediococcus、Leuconostoc、g_unclassified_o_Bacillales、Gluconobacter、Pseudomonas、Acetobacter、Enterobacter、Komagataeibacter、Acinetobacter、Kozakia、Pantoea、Psychrobacter和g_unclassified_c_Alphaproteobacteria、Chryseobacterium。

    上述21 個(gè)細(xì)菌屬中,Weissella、Leuconostoc、Lactobacillus和Pediococcus屬于乳酸菌。乳酸菌在發(fā)酵過程可通過產(chǎn)乳酸、乙酸等有機(jī)酸,直接影響酒體風(fēng)味。同時(shí),乳酸和乙酸是白酒中重要風(fēng)味成分乳酸乙酯和乙酸乙酯的前體。乳酸菌還可通過代謝有機(jī)酸、競(jìng)爭(zhēng)營(yíng)養(yǎng)成分、產(chǎn)生抗菌素等抑制其他微生物的生長(zhǎng),從而調(diào)節(jié)發(fā)酵過程的微生物群落結(jié)構(gòu),間接影響酒體的品質(zhì)。此外,乳酸菌還能為酵母發(fā)酵過程的酯化作用提供前體物質(zhì),具有促進(jìn)釀酒發(fā)酵和美拉德反應(yīng)及維持釀酒微生態(tài)環(huán)境等作用[15-17]。Gluconobacter、Acetobacter、Komagataeibacter和Kozakia屬于醋酸菌[18]。醋酸菌是一類嚴(yán)格好氧的革蘭氏陰性細(xì)菌,能氧化葡萄糖或乙醇生成乙酸,是乙酸代謝的主要來源。乙酸是白酒中主要風(fēng)味成分之一。少量的乙酸對(duì)改善白酒風(fēng)味、促進(jìn)酒體清香有重要作用[6]。Weissella和Leuconostoc可啟動(dòng)發(fā)酵,Leuconostoc還可利用葡萄糖進(jìn)行異型乳酸發(fā)酵產(chǎn)生D-型乳酸和乙酸[19]。Gluconobacter能產(chǎn)生乙酸[20]。Acetobacter能產(chǎn)細(xì)菌纖維素[21],具有氧化乙醇生成乙酸并進(jìn)一步氧化乙酸的能力[22]。Fan Guangsen等[20]在清香型大曲中檢測(cè)到一種Acetobacter orientalis,該細(xì)菌將葡萄糖發(fā)酵成乙醇,將乙醇轉(zhuǎn)化成乙酸,通過生產(chǎn)乙酸異戊酯和2-苯基乙酸乙酯等酯類對(duì)酒體風(fēng)味有積極作用。Komagataeibacter的部分菌株可產(chǎn)生細(xì)胞纖維素,可以由甘油產(chǎn)生二羥基丙酮,可以氧化葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、乙醇產(chǎn)生有機(jī)酸等[22],Komagataeibacter在葡萄酒和有機(jī)蘋果酒浸泡醋生產(chǎn)中,被確定為葡萄酒醋和蘋果醋發(fā)酵中的主要微生物[23],但尚未在白酒發(fā)酵中見到報(bào)道。Kozakia能利用蔗糖或D-果糖生產(chǎn)類似果聚糖的黏性物質(zhì),也能氧化乙酸鹽和乳酸鹽,利用乙醇生產(chǎn)食醋[18]。Oceanobacillus是大曲中的主要微生物[24],具有產(chǎn)乳酸的功能[25]。Bacillus是醬香型白酒生產(chǎn)中的主要功能菌,能在55 ℃及以上高溫下生長(zhǎng),促進(jìn)以葡萄糖、甘氨酸和氯化鈉為原料的美拉德反應(yīng)迅速發(fā)生,生成乙酸、乙酸乙酯、乙醛、乙縮醛、丁二醇等風(fēng)味物質(zhì),是重要的產(chǎn)酸和產(chǎn)香菌,促進(jìn)濃郁的醬香風(fēng)味形成;并且Bacillus還能代謝酶水解淀粉、蛋白質(zhì)等,產(chǎn)生丁酸和己酸等,還有助于雙乙酰等芳香物質(zhì)和吡嗪、醛類、酮類、醇類等揮發(fā)性化合物形成[6]。Enterobacter存在于大曲和小曲中[26]。Wang Peng等[27]發(fā)現(xiàn)在大曲發(fā)酵8 d后,Enterobacter便成為優(yōu)勢(shì)微生物。黃瑩娜等[28]認(rèn)為Enterobacter是白云邊窖泥中特有的優(yōu)勢(shì)菌屬,對(duì)其濃醬兼香風(fēng)格的形成有重要貢獻(xiàn)。且Enterobacter中的某些菌可產(chǎn)纖維素酶和乳酸[29-31]。Acinetobacter是具有呼吸和發(fā)酵代謝作用的細(xì)菌[31],以葡萄糖和其他碳水化合物代謝產(chǎn)酸,是醬香型[31]和清香型[32]白酒酒醅中的主要微生物。酸類物質(zhì)具有平衡酒味、協(xié)調(diào)香氣的作用。同時(shí)酸類物質(zhì)也是形成酯類化合物的前體物質(zhì),而酯類化合物是構(gòu)成清醬香型人民小酒揮發(fā)性香氣的重要物質(zhì)[3]。綜上表明,上述微生物具有促進(jìn)清醬香白酒風(fēng)味物質(zhì)富集的作用。

    Pseudomonas是清香型白酒酒醅中的主要微生物[28]。Liu Xiu等[33]在大曲發(fā)酵的風(fēng)干階段檢測(cè)到Pseudomonas。Staphylococcus為醬香型酒曲和部分堆積前、中期酒醅中的優(yōu)勢(shì)菌群,文獻(xiàn)報(bào)道[17]部分Staphylococcus在香腸、火腿等發(fā)酵食品生產(chǎn)過程可產(chǎn)生獨(dú)特的風(fēng)味物質(zhì)。Pantoea、Kroppenstedtia和Lentibacillus都是大曲中的主要微生物[26,34]。清醬香型白酒采用大小曲共同發(fā)酵,發(fā)酵工藝和酒體風(fēng)格融合了清、醬香型白酒二者之優(yōu)勢(shì)。因此,清香型或醬香型白酒發(fā)酵過程中的主要微生物,如果在清醬香型白酒中的相對(duì)豐度較高(相對(duì)豐度>1%),對(duì)清醬香型白酒發(fā)酵也有一定影響作用。

    高通量測(cè)序結(jié)果表明,Weissella、Gluconobacter、Lactobacillus、Staphylococcus、Pseudomonas、Acetobacter、Bacillus、Kroppenstedtia、Oceanobacillus、Lentibacillus、Pediococcus、Enterobacter和Komagataeibacter在酒醅中的平均相對(duì)豐度大于1%,Acinetobacter、Leuconostoc、Kozakia和Pantoea在發(fā)酵結(jié)束階段平均相對(duì)豐度大于1%。以上微生物在清醬香型白酒陶壇發(fā)酵過程中的相對(duì)豐度及其功能作用表明,Weissella、Gluconobacter、Lactobacillus、Staphylococcus、Pseudomonas、Acetobcter、Bacillus、Kroppenstedtia、Oceanobacillus、Lentibacillus、Pediococcus、Enterobacter、Komagataeibacter、Acinetobacter、Leuconostoc、Kozakia和Pantoea共17 種屬是清醬香型白酒發(fā)酵過程的主要細(xì)菌屬。其中優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬(平均相對(duì)豐度>10%)為Weissella(20.61%)、Staphylococcus(14.19%)、Lactobacillus(12.08%)和Gluconobacter(14.17%)。而前人研究表明,清香型白酒中的主要細(xì)菌屬是Lactobacillus、Streptpcoccus、Pediococcus、Aerococcus、Bacillus、Acetobacter、Pseudomonas、Kroppenstedtia、Weissella、Acinetobacter和Leuconostoc[6,11,32,35]。如圖3所示,Weissella、Lactobacillu、Pseudomonas、Acetobacter、Bacillus、Kroppenstedtia、Pediococcus、Acinetobacter和Leuconostoc是清香型和清醬香型白酒酒醅共有的主要細(xì)菌屬,Streptpcoccus和Aerococcus在清香型白酒釀造中是主要細(xì)菌屬,但Streptpcoccus在清醬香型白酒發(fā)酵過程中未檢出,Aerococcus在清醬香型白酒發(fā)酵過程中含量很低(在各樣品中相對(duì)豐度均低于0.01%)。醬香型白酒酒醅中的主要細(xì)菌屬為Acidithiobacillus、Kroppenstedtia、Lactobacillus、Acetobacter、Pediococcus、Bacillus、Pantoea、Weissella、Thermoactinomyces、Enterobacter、Pseudomonas、Stenotrophomonas、Phyllobacterium、Shewanella、Chryseobacterium、Escherichia-Shigella、Clostridium、Sensu stricto1、Streptococcus、Actinobacillus、Bifidobacterium、Peptoclostridium、Citrobacter、Acinetobacter、Lactococcus、Staphylococcus、Enhydrobacter、Burkholderia、Desmospor[10,14,31,36-37]。其中Weissella、Lactobacillus、Staphylococcus、Pseudomonas、Acetobacter、Bacillus、Kroppenstedtia、Pediococcus、Enterobacter、Acinetobacter、Pantoe是醬香型和清醬香型白酒酒醅共有的主要細(xì)菌屬,Acidithiobacillus、Thermoactinomyces、Stenotrophomonas、Phyllobacterium、Shewanella、Chryseobacterium、Escherichia-Shigella、Clostridium、Sensu stricto1、Streptococcus、Actinobacillus、Bifidobacterium、Peptoclostridium、Citrobacter、Lactococcus、Enhydrobacter、Burkholderia、Desmospora、Serpens是醬香型白酒酒醅中的主要細(xì)菌屬,但Acidithiobacillus、Phyllobacterium、Shewanella、Clostridium、Sensu stricto1、Actinobacillus、Peptoclostridium、Citrobacter、Burkholderia、Desmospora和Serpens在清醬香型白酒發(fā)酵過程中未檢出,Thermoactinomyces、Stenotrophomonas、Chryseobacterium、Escherichia-Shigella、Streptococcus、Actinobacillus、Bifidobacterium、Lactococcus和Enhydrobacter在清醬香型白酒發(fā)酵過程中含量很低(在各樣品中平均相對(duì)豐度介于0%~0.35%)。與清香型和醬香型白酒相比,Gluconobacter、Oceanobacillus、Lentibacillus、Komagataeibacter、Kozakia是清醬香型白酒酒醅中特有的主要細(xì)菌屬。正是由于發(fā)酵菌群結(jié)構(gòu)的差異,其發(fā)酵動(dòng)力和風(fēng)味動(dòng)力上也會(huì)存在差異,從而導(dǎo)致了醬香、清香、清醬香白酒發(fā)酵產(chǎn)率及其酒體風(fēng)格特征上的差異。

    圖 3 不同香型白酒主要細(xì)菌屬水平分布Venn圖Fig. 3 Venn map of main bacterial genera in Chinese liquors of different flavors

    上述結(jié)果表明,在門水平,清醬香、清香、醬香型白酒釀造微生物差異不大,都是Firmicutes和Proteobacteria為優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門,且Firmicutes占主導(dǎo)地位。在屬水平,清醬香型白酒釀造過程主要細(xì)菌屬與清香型、醬香型白酒堆積發(fā)酵過程的主要細(xì)菌屬有很大重合,但又有各自特有的主要細(xì)菌屬。說明清醬香型白酒釀造過程的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與清香型白酒、醬香型白酒釀造均有一定的相似性,但又不同于清香型白酒和醬香型白酒釀造細(xì)菌群落結(jié)構(gòu),具有其自身獨(dú)特性。清醬香型白酒釀造過程的主要細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)兼具了清香和醬香白酒釀造主要細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。

    2.2 發(fā)酵起始和結(jié)束階段細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)

    2.2.1 發(fā)酵起始和結(jié)束階段酒醅樣品與物種共線性分析

    為獲得細(xì)菌在發(fā)酵起始和結(jié)束階段的表型差異和共存在關(guān)系,必須對(duì)清醬香型白酒陶壇發(fā)酵過程細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析,進(jìn)一步認(rèn)識(shí)其調(diào)控作用,對(duì)兩車間發(fā)酵1 d和發(fā)酵20 d酒醅樣品的細(xì)菌進(jìn)行相關(guān)性分析,結(jié)果見圖4。

    圖 4 發(fā)酵1 d和20 d酒醅樣品與物種共線性網(wǎng)絡(luò)分析圖Fig. 4 Collinearity analysis of bacterial genera in 1 d and 20 d fermented grains

    對(duì)比YB1發(fā)酵起始(1F 1 d)和發(fā)酵結(jié)束(1F 20 d)時(shí)的酒醅,從圖4a可看出,有Candidatus_Saccharimonas等6 個(gè)屬只出現(xiàn)在發(fā)酵1 d酒醅中,發(fā)酵結(jié)束時(shí)未檢出,說明這6 個(gè)屬受發(fā)酵條件調(diào)控明顯。這6 個(gè)屬在發(fā)酵1 d時(shí)相對(duì)豐度和占0.03%,在發(fā)酵過程所占菌群結(jié)構(gòu)比例很小。此外,有56 個(gè)屬在發(fā)酵1 d未檢出,但在發(fā)酵結(jié)束階段檢出(相對(duì)豐度和占0.48%),這些屬與發(fā)酵工藝變化存在協(xié)同性,并富集于發(fā)酵過程。值得注意的是,有79 個(gè)屬同時(shí)出現(xiàn)在發(fā)酵開始和結(jié)束階段,其中有73 個(gè)屬同時(shí)出現(xiàn)在YB1的4 個(gè)采樣階段,在各階段的豐度和分別占99.96%、98.91%、99.38%和98.05%,表明這些屬在發(fā)酵過程起主導(dǎo)性作用。對(duì)比YB2酒醅在發(fā)酵開始(2F 1 d)和發(fā)酵結(jié)束(2F 20 d)階段的菌群結(jié)構(gòu)(圖4b)可知,有26 個(gè)屬只出現(xiàn)在發(fā)酵1 d,發(fā)酵結(jié)束時(shí)未檢出,這部分屬在發(fā)酵1 d的相對(duì)豐度和占0.20%。此外,有33 個(gè)屬在于發(fā)酵1 d未檢出,但在發(fā)酵結(jié)束時(shí)有檢出,其相對(duì)豐度和占0.20%。同時(shí)出現(xiàn)在發(fā)酵開始和結(jié)束階段的有79 個(gè)屬,其中有66 個(gè)屬同時(shí)出現(xiàn)在YB2樣品的4 個(gè)采樣階段,這66 個(gè)屬在各階段的豐度和分別占99.68%、99.54%、99.60%和97.83%,同樣表明這些屬在發(fā)酵過程具有重要作用。

    在YB1酒醅樣品中,共檢出166 個(gè)屬,有43.96%的屬存在于發(fā)酵起始階段并穩(wěn)定遷移、維持至發(fā)酵結(jié)束階段,這些屬在各階段的相對(duì)豐度和高達(dá)98%以上。另外,有33.73%的屬在發(fā)酵起始階段未檢出,在發(fā)酵進(jìn)程中富集,但在發(fā)酵結(jié)束時(shí)相對(duì)豐度和僅占0.48%。在YB2酒醅中共檢出146 個(gè)屬,有45.21%的屬?gòu)陌l(fā)酵起始階段一直穩(wěn)定至發(fā)酵結(jié)束,其在各階段的相對(duì)豐度和高達(dá)97.83%以上。另外,有22.60%的屬在發(fā)酵起始階段未檢出,但在發(fā)酵過程得到富集,到發(fā)酵結(jié)束時(shí)相對(duì)豐度和為0.20%。上述結(jié)果表明,在清醬香型白酒(人民小酒)發(fā)酵過程中,YB1、YB2平均有10.71%的細(xì)菌發(fā)生消亡,同時(shí)平均有28.17%的新物種得到富集,但其相對(duì)豐度和均不超過1.9%,所起的調(diào)控和發(fā)酵作用不明顯,起主導(dǎo)作用的微生物菌群從發(fā)酵起始階段就存在并穩(wěn)定維持至發(fā)酵結(jié)束。雖然兩個(gè)車間的微生物存在一定差異,但調(diào)控發(fā)酵的主要微生物結(jié)構(gòu)相似度高,且穩(wěn)定性較好,部分微生物存在差異主要來源于隨發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng),發(fā)酵工藝參數(shù)變化和微生物結(jié)構(gòu)變化之間的相互影響和調(diào)控。

    2.2.2 發(fā)酵起始和結(jié)束階段主要細(xì)菌群落差異分析

    根據(jù)上述主要細(xì)菌菌群豐度數(shù)據(jù),運(yùn)用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法,對(duì)發(fā)酵1 d和發(fā)酵20 d酒醅的主要細(xì)菌屬進(jìn)行假設(shè)檢驗(yàn),評(píng)估物種豐度差異的顯著性水平,獲得發(fā)酵起始和結(jié)束階段樣品的顯著性差異物種及主要細(xì)菌屬變化結(jié)果,以進(jìn)一步解析發(fā)酵過程主要細(xì)菌屬的調(diào)控作用,結(jié)果如圖5所示。

    上述17 個(gè)主要細(xì)菌屬,在YB1(圖5a)中相對(duì)豐度高度顯著(P<0.001)下降的有Weissella、Gluconobacter和Pseudomonas3 個(gè)屬,其余14 個(gè)屬全部呈高度顯著(P<0.001)上升。在YB2(圖5b)中相對(duì)豐度下降的有Weissella、Gluconobacter、Staphylococcus、Bacillus和Lentibacillus5 個(gè)屬,其余12 個(gè)屬相對(duì)豐度呈現(xiàn)上升。其中,Weissella、Gluconobacter、Staphylococcus和Lentibacillus4 個(gè)屬相對(duì)豐度呈現(xiàn)高度顯著(P<0.001)下降,Lactobacillus、Pseudomonas、Acetobacter、Oceanobacillus、Kroppenstedtia、Pediococcus、Enterobacter、Komagataeibacter、Acinetobacter、Leuconostoc和Pantoea11 個(gè)屬相對(duì)豐度呈現(xiàn)高度顯著(P<0.001)上升,Bacillus和Kozakia無顯著性變化(P>0.01)。

    圖 5 發(fā)酵起始和結(jié)束階段主要細(xì)菌群落差異分析Fig. 5 Analysis of differences in major bacterial community at the initial and final stages of fermentation

    同時(shí)也可看出,在發(fā)酵階段,主要細(xì)菌屬的相對(duì)豐度存在變化。兩個(gè)車間平均73.53%的主要細(xì)菌屬呈現(xiàn)高度顯著(P<0.001)上升,平均20.59%的主要細(xì)菌屬呈現(xiàn)高度顯著(P<0.001)下降,僅有2 個(gè)屬無顯著性變化。發(fā)酵結(jié)束階段,細(xì)菌群落組成結(jié)構(gòu)相對(duì)比較穩(wěn)定,沒有占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)的微生物。在YB1中僅有Gluconobacter和Staphylococcus兩個(gè)屬是優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬,相對(duì)豐度分別是18.20%和20.46%;在YB2也只有Weissella和Lactobacillus兩個(gè)屬是優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬,相對(duì)豐度分別為12.03%和25.97%。

    綜上,發(fā)酵階段會(huì)發(fā)生主要細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的內(nèi)部調(diào)控機(jī)制,平均73.53%的主要細(xì)菌屬相對(duì)豐度呈高度顯著(P<0.001)上升,20.59%的主要細(xì)菌屬相對(duì)豐度呈高度顯著(P<0.001)下降。細(xì)菌在發(fā)酵過程的含量變化主要受發(fā)酵過程發(fā)酵酒醅理化指標(biāo)變化和微生物群落結(jié)構(gòu)的雙向調(diào)控。到發(fā)酵結(jié)束階段,因酒醅理化指標(biāo)所導(dǎo)致的發(fā)酵環(huán)境相對(duì)穩(wěn)定,所以該階段的主要細(xì)菌組成結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)相對(duì)穩(wěn)定,其相對(duì)豐度均小于25.97%。

    2.3 主要細(xì)菌群落之間相關(guān)性

    上述結(jié)果表明發(fā)酵過程的主要細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)之間通過共生、競(jìng)爭(zhēng)及拮抗等關(guān)系形成復(fù)雜的相互調(diào)控機(jī)制,進(jìn)而形成一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的發(fā)酵微生物群落。為深入挖掘主要細(xì)菌群落之間的相關(guān)性及其變化規(guī)律,采用網(wǎng)絡(luò)分析方法對(duì)17 個(gè)主要細(xì)菌屬進(jìn)行了相關(guān)性分析,結(jié)果如圖6所示。

    圖 6 酒醅樣品中的主要細(xì)菌群落相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)圖(屬水平)Fig. 6 Correlation network of major bacterial genera in fermented grain samples

    從圖6可看出,發(fā)酵過程平均81.12%的細(xì)菌菌屬之間呈顯著正相關(guān)(P<0.05)。在YB1中,正相關(guān)性占總相關(guān)性的85.19%,負(fù)相關(guān)性占總相關(guān)性的14.81%。在YB2中,正相關(guān)性占總相關(guān)性的77.05%,負(fù)相關(guān)性占總相關(guān)性的22.95%。表明這些微生物菌群在發(fā)酵過程存在一定程度上相似生態(tài)位。

    Hubs種類及多少在一定程度上可反映特定環(huán)境中微生物菌群結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。從YB1的同現(xiàn)性網(wǎng)絡(luò)圖譜(圖6a)中共發(fā)現(xiàn)Komagataeibacter、Pantoea、Lentibacillus、Enterobacter、Oceanobacillus、Pediococcus、Staphylococcus和Bacillus8 個(gè)Hubs(這里指至少與其他4 個(gè)屬的微生物存在正相關(guān)的節(jié)點(diǎn))。Komagataeibacter是Proteobacteria門下的醋酸菌,與Bacillus、Kozakia、Acetobacter、Pantoea、Pediococcus和Enterobacter顯著正相關(guān)(P<0.05)。Pantoea與Leuconostoc顯著正相關(guān)(P<0.05)。Lentibacillus與Oceanobacillus、Staphylococcus和Kroppenstedtia顯著正相關(guān)(P<0.05)。Bacillus與Pantoea顯著正相關(guān)(P<0.05)。Staphylococcus與Oceanobacillu和Kroppenstedtia顯著正相關(guān)(P<0.05)。Pediococcus與Bacillus、Leuconostoc和Pantoea顯著正相關(guān)(P<0.05)。Lentibacillus與Oceanobacillu、Staphylococcus和Kroppenstedtia顯著正相關(guān)(P<0.05)。Enterobacter與Bacillus、Staphylococcus、Oceanobacillu和Lentibacillus顯著正相關(guān)(P<0.05)。從YB1的負(fù)相關(guān)網(wǎng)絡(luò)(圖6b)可發(fā)現(xiàn)Pseudomonas1 個(gè)負(fù)相關(guān)Hub(這里指至少與其他3 個(gè)屬的微生物存在負(fù)相關(guān)的節(jié)點(diǎn))。Pseudomonas與Gluconobacter、Acetobacter和Kozakia顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05),此外乳酸菌Weissella和醋酸菌Acinetobacter顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)。

    從YB2的共現(xiàn)性網(wǎng)絡(luò)圖譜(圖6c)中共發(fā)現(xiàn)10 個(gè)Hubs,分別是Firmicutes下的Pediococcus、Lactobacillus、Kroppenstedtia、Oceanobacillus和Leuconostoc;Proteobacteria下的Komagataeibacter、Acetobacter、Enterobacter、Acinetobacter和Pantoea。這些微生物中,除Leuconostoc與Acinetobacter,Kroppenstedtia與Oceanobacillus、Pediococcus之間相關(guān)性不顯著外(P>0.05),其余全部?jī)蓛娠@著正相關(guān)(P<0.05)。從YB2的負(fù)相關(guān)網(wǎng)絡(luò)(圖6d)發(fā)現(xiàn)Staphylococcus和Pseudomonas兩個(gè)Hubs。Staphylococcus與Acetobacter、Leuconostoc、Pantoea、Enterobacter、Komagataeibacter、Kroppenstedtia、Lactobacillus和Acinetobacter顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05),這幾個(gè)微生物屬全都是正相關(guān)Hubs。而在YB1中,Staphylococcus與Lentibacillus、Enterobacter、Oceanobacillus和Kroppenstedtia顯著正相關(guān)(P<0.05)。該結(jié)果與Staphylococcus在兩個(gè)車間的含量不同有關(guān)。在YB1中,Staphylococcus總體呈上升趨勢(shì),相對(duì)豐度從起發(fā)階段的9.07%上升至發(fā)酵結(jié)束時(shí)的20.46%。而在YB2,Staphylococcus的相對(duì)豐度從起酵時(shí)的28.03%下降至發(fā)酵結(jié)束時(shí)為0.95%。在YB2中,Pseudomonas和Lentibacillus、Bacillus、Kozakia顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05),Pseudomonas在YB1中也與3 個(gè)屬的微生物存在顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)。

    從主要細(xì)菌群落在兩個(gè)車間酒醅的相關(guān)性分析結(jié)果發(fā)現(xiàn),其發(fā)酵過程平均81.12%的主要細(xì)菌菌屬之間呈顯著正相關(guān)(P<0.05),18.88%的主要細(xì)菌菌屬之間呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)。Komagataeibacter、Pantoea、Enterobacter、Oceanobacillus和Pediococcus是清醬香型白酒(人民小酒)兩個(gè)車間發(fā)酵體系中共有的正相關(guān)Hubs,對(duì)維持發(fā)酵體系的正常、穩(wěn)態(tài)發(fā)展和酒體風(fēng)味的形成起到非常重要的作用。Pseudomonas是兩個(gè)車間發(fā)酵體系中共有的負(fù)相關(guān)Hub。

    3 結(jié) 論

    清醬香型白酒發(fā)酵過程的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門與清香型、醬香型白酒相同,均為Firmicutes和Proteobacteria,主要細(xì)菌屬為Weissella、Gluconobacter、Lactobacillus、Staphylococcus、Pseudomonas、Acetobacter、Bacillus、Kroppenstedtia、Oceanobacillus、Lentibacillus、Pediococcus、Enterobacter、Komagataeibacter、Acinetobacter、Leuconostoc、Kozakia和Pantoea,優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬為Weissella、Staphylococcus、Lactobacillus和Gluconobacter。Streptpcoccus在清香型白酒釀造過程中是主要細(xì)菌屬,Acidithiobacillus、Phyllobacterium、Shewanella、Clostridium、Sensu stricto1、Actinobacillus、Peptoclostridium、Citrobacter、Burkholderia、Desmospora和Serpens在醬香型白酒酒醅中是主要細(xì)菌屬,但在清醬香型白酒發(fā)酵過程中均未檢出。與清香型、醬香型白酒釀造過程微生物對(duì)比,清醬香型白酒釀造過程的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與清香型白酒、醬香型白酒釀造均有一定的相似性,但又不同于典型的清香型和醬香型白酒釀造過程的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu),具有其自身獨(dú)特性,本研究對(duì)清醬香型白酒釀造微生物群落結(jié)構(gòu)差異分析,為探究清醬香型白酒風(fēng)味形成的微生物成因(菌系基礎(chǔ))和風(fēng)味特征凝練和品質(zhì)創(chuàng)新奠定了必要基礎(chǔ)。

    發(fā)酵過程平均有10.71%的細(xì)菌發(fā)生消亡,平均28.17%的物種得到富集,但其相對(duì)豐度都很低,相對(duì)豐度和均小于1.9%;主要細(xì)菌屬的群落組成結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化,平均73.53%的主要細(xì)菌屬呈高度顯著上升,20.59%的菌屬呈高度顯著下降。在發(fā)酵結(jié)束階段,主要細(xì)菌群落組成結(jié)構(gòu)相對(duì)穩(wěn)定,相對(duì)豐度均不超過25.97%;發(fā)酵過程,平均81.12%的主要細(xì)菌菌屬之間呈顯著正相關(guān),18.88%的主要細(xì)菌菌屬之間呈顯著負(fù)相關(guān)。Komagataeibacter、Pantoea、Enterobacter、Oceanobacillus和Pediococcus是清醬香型白酒(人民小酒)發(fā)酵體系中共有的正相關(guān)Hubs,對(duì)維持清醬香白酒發(fā)酵體系的正常、穩(wěn)態(tài)發(fā)展和酒體風(fēng)味的形成起了非常重要的作用。

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