卵清分離蛋白-亞麻籽油高濃度乳液的制備及膠體性質(zhì)表征

方艾虎，李凌云，楊宗蘊(yùn)，徐幸蓮，王越溪，王 鵬

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 肉品加工與質(zhì)量控制教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210095）

蛋白質(zhì)是參與、形成穩(wěn)定水包油乳液的一類重要物質(zhì)。乳液的內(nèi)部結(jié)構(gòu)關(guān)系到食品的保質(zhì)期、質(zhì)地和口感等[1]，而乳液中液滴的絮凝直接影響乳液結(jié)構(gòu)，以及乳液中的界面穩(wěn)定和液滴合并。影響液滴絮凝的一些變量包括油相體積分?jǐn)?shù)、蛋白質(zhì)/油的比率、平均粒徑等[2]。在高濃度乳液體系中，液滴絮凝擠壓作用和液滴間吸引力互相協(xié)調(diào)，引起的結(jié)構(gòu)化使得乳液表現(xiàn)出塑性或黏彈性[3]。

亞麻籽油是常用的營養(yǎng)脂質(zhì)來源，含有高達(dá)50%以上的α-亞麻酸[4]。此外，α-亞麻酸作為一種主要的n-3脂肪酸對大腦發(fā)育、視覺視力和免疫系統(tǒng)都起著重要的作用[5]。因此，近些年國內(nèi)研究學(xué)者對亞麻籽油的加工利用進(jìn)行了研究[6-7]。

國內(nèi)[8]已經(jīng)有部分學(xué)者對高濃度乳液內(nèi)部的油滴絮凝與乳化劑[9-10]的交聯(lián)進(jìn)行研究，主要集中在低濃度乳液到高濃度乳液（油相質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%～60%）過程中乳液的流變性質(zhì)與微觀結(jié)構(gòu)的變化，國外[11-12]部分學(xué)者也為乳液內(nèi)部一定的多糖、蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)造成乳液內(nèi)部液滴絮凝對乳液的穩(wěn)定性與性能的進(jìn)行了研究。然而國內(nèi)對較高油相質(zhì)量分?jǐn)?shù)的高濃度乳液的性質(zhì)與結(jié)構(gòu)研究較少。因此本研究以亞麻籽油作為分散相，卵清分離蛋白溶液作為連續(xù)相對高濃度乳液（油相質(zhì)量分?jǐn)?shù)為69%～85%）的結(jié)構(gòu)性質(zhì)進(jìn)一步測定，包括流變性質(zhì)、粒徑分布、電導(dǎo)率以及激光共聚焦觀察等，旨在為高濃度乳液的制備及其在酸奶、加工肉制品等中的應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，從而為高質(zhì)量、高穩(wěn)定性的乳狀食品開發(fā)及卵清分離蛋白的新利用方式提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

卵清分離蛋白粉（水分≤8.0%；蛋白質(zhì)≥78.0%） 吉林金翼蛋品有限公司；亞麻籽油（壓榨一級，2.456 L）錫林郭勒盟紅井源有限責(zé)任公司；十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS） 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；Nile Red和Nile Blue（硫酸耐爾藍(lán)） 美國Sigma-Aldrich公司。

1.2 儀器與設(shè)備

MCR301高級旋轉(zhuǎn)流變儀 奧地利Anton Paar公司；Mastersizer 3000激光粒度儀 英國Malvern公司；PD500-TP高性能分散勻漿機(jī) 英國Prima公司；激光共聚焦顯微鏡 德國徠卡公司；SensoDirect Con 200型電導(dǎo)率儀 德國Tintometer GmbH公司；MX-F固定式混勻儀 大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器（北京）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 卵清分離蛋白-亞麻籽油高濃度乳液的制備

卵清分離蛋白粉（6%）與去離子水定量混合，通過混勻儀將蛋白粉均勻分散在去離子水中，靜置1 h使其充分水合溶解；此溶液作為高濃度乳液的連續(xù)相。向連續(xù)相中分別加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為65%、70%、75%、80%、85%的亞麻籽油，用振蕩器將兩相均勻混合；用分散勻漿機(jī)以13 500 r/min的轉(zhuǎn)速剪切2.5 min（每30 s間隔10 s）制成高濃度乳液[13]，所得乳液樣品放入冰桶中迅速降至室溫。

1.3.2 乳液表觀黏度的測定[13]

使用MCR301高級旋轉(zhuǎn)流變儀測定乳液的表觀黏度。將乳液均勻涂布在50 mm的平板上，除去涂抹時(shí)產(chǎn)生的氣泡，測試平板間的上下狹縫為0.5 mm，待穩(wěn)定30 s，測試溫度達(dá)到25 ℃后開始測試。總剪切時(shí)間330 s，記錄在0.1～1 000 s-1剪切速率下卵清分離蛋白高濃度乳液的表觀黏度變化。

1.3.3 乳液儲能模量和損耗模量的測定

利用MCR301高級旋轉(zhuǎn)流變儀測定乳液的儲能模量G’和損耗模量G’’。測試平板的直徑為50 mm，上下平板間距為1 mm，測試溫度為25 ℃，應(yīng)力為1%，角頻率為1～100 rad/s，樣品為在4 ℃冷庫中放置12 h的卵清分離蛋白高濃度乳液[14]。

1.3.4 乳液的粒徑分布

利用Mastersizer 3000激光粒度儀對高濃度乳液的粒徑大小分布進(jìn)行測定。取1 mL的蛋白乳液加入3 mL質(zhì)量濃度為1 g/100 mL的SDS溶液中，用渦旋振蕩器一擋渦旋溶液10 s后測定乳液粒徑分布。在此測試中，分散劑為水且折射率為1.330；顆粒折射率參數(shù)為1.414；顆粒吸收率為0.001；顆粒的分析模式為球形[15-16]。

1.3.5 乳液電導(dǎo)率的測定

使用SensoDirect Con 200型電導(dǎo)率儀分別對亞麻籽油質(zhì)量分?jǐn)?shù)為65%、70%、75%、80%、85%的卵清分離蛋白高濃度乳液進(jìn)行電導(dǎo)率的測定，記錄不同油相質(zhì)量分?jǐn)?shù)下乳液電導(dǎo)率的變化情況[17]。

1.3.6 乳液的外觀

使用SONY ILCE-6000L照相機(jī)對乳液進(jìn)行拍照。

1.3.7 乳液的微觀形態(tài)結(jié)構(gòu)

采用共聚焦顯微鏡對乳液進(jìn)行觀察。蛋白乳液樣品是用0.1%的Nile Bule A和0.02%的Nile Red進(jìn)行染色，其中Nile Blue A對蛋白進(jìn)行染色，Nile Red對油脂進(jìn)行染色。染色時(shí)，每50 g乳液加入各1.2 mL的兩種染色劑，染色過程需避光。染色后的乳液需避光在4 ℃冷庫進(jìn)行振蕩過夜，以保證乳液的充分染色。將染色后的乳液取一部分小心加到載玻片上，并覆蓋蓋玻片。載玻片上的樣品要涂抹均勻，除去不小心產(chǎn)生的氣泡。將制好的樣品放在載物臺上，物鏡轉(zhuǎn)換為40×油鏡，迅速在488 nm與633 nm激發(fā)光波長處采集圖像，防止熒光焠滅[18]。得到的圖片使用Image J V1.47進(jìn)行處理，用Image J V1.47中的粒徑分析功能進(jìn)行測定，得到乳液油滴的費(fèi)雷特直徑與平均粒徑[19]。

1.4 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，結(jié)果以 ±s表示。采用Origin 8.0進(jìn)行作圖與分析，運(yùn)用SAS V8軟件中的ANOVA進(jìn)行方差分析，比較樣品數(shù)據(jù)間的顯著性差異，P＜0.05，差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 油相質(zhì)量分?jǐn)?shù)對乳液表觀黏度的影響

在高質(zhì)量分?jǐn)?shù)乳化體系中，由于油相質(zhì)量分?jǐn)?shù)很高，油滴間間距很小，會產(chǎn)生類似于膠體粒子的絮凝現(xiàn)象。但乳液液滴之間主要通過油滴界面層蛋白之間的氫鍵等作用，產(chǎn)生相互影響[20]。在較高的油相比例且均一分散時(shí)，強(qiáng)烈的絮凝作用下甚至可能呈現(xiàn)緊密壓縮的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)[21]。但當(dāng)剪切速率過大時(shí)，過高的能量輸入會對已聚集液滴的擾動使得緊密壓縮結(jié)構(gòu)破壞，造成黏度降低[22]。

圖 1 不同油相質(zhì)量分?jǐn)?shù)的高濃度乳液樣品黏度分布Fig. 1 Viscosity distribution of high-concentration emulsions with different oil phase concentrations

如圖1所示，在剪切速率0.1～1 000 s-1范圍內(nèi)，卵清分離蛋白高濃度乳液的表觀黏度隨剪切速率的增大而下降，即發(fā)生了剪切變稀現(xiàn)象。從圖1可以發(fā)現(xiàn)，在亞麻籽油質(zhì)量分?jǐn)?shù)為65%、70%、75%時(shí)，乳液的黏度隨著乳化物中亞麻籽油質(zhì)量分?jǐn)?shù)的提高而增加。一方面，隨著亞麻籽油質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，乳液由于相鄰油滴的絮凝形成網(wǎng)絡(luò)而具有更高的黏度；在較高的油質(zhì)量分?jǐn)?shù)下，油滴之間較大的接觸表面積阻礙了剪切場中乳液的自由流動，增加了乳液黏度。另一方面，隨著乳液中水分比例的減少，連續(xù)相中蛋白比例升高，乳液中蛋白質(zhì)之間相互作用增強(qiáng)，這極大地提高了連續(xù)相的黏度，乳化油滴不能在高黏度網(wǎng)絡(luò)中自由的移動，從而提高了乳液的黏度與穩(wěn)定性[23-24]。實(shí)驗(yàn)參考Kato等[25]的方法，采用ANS熒光探針法測定蛋白表面疏水性。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)量濃度在1～6 g/100 mL范圍內(nèi)，連續(xù)相在激發(fā)波長390 nm、發(fā)射波長460 nm處的熒光強(qiáng)度從3 800增長到17 096（圖略）。隨著連續(xù)相中蛋白質(zhì)量濃度增大，疏水基團(tuán)暴露較多，連續(xù)相的疏水性增大，表面電荷數(shù)增多，乳液更加穩(wěn)定，即連續(xù)相中的蛋白質(zhì)分子之間的連接更加緊密，使得連續(xù)相黏度增大，乳液表觀黏度增大[26]。在亞麻籽油質(zhì)量分?jǐn)?shù)為80%時(shí)，乳液連續(xù)相比例的進(jìn)一步降低導(dǎo)致乳液中蛋白絮凝程度增加，油滴從其正常的球形變形擠壓成為多邊形，聚集乳液油滴，乳液呈現(xiàn)凝膠狀態(tài)，其黏度降低。亞麻籽油質(zhì)量分?jǐn)?shù)為85%的乳液黏度遠(yuǎn)低于其他亞麻籽油的乳液黏度，這是由過量的卵清分離蛋白聚集，破壞了乳液的結(jié)構(gòu)化，導(dǎo)致了空缺絮凝，從而大部分的油沒有得到乳化造成的。

2.2 乳液的G’和G’’

應(yīng)用G’和G’’進(jìn)行不同油相質(zhì)量分?jǐn)?shù)高濃度乳液的變形流變特性研究。G’反映乳液的彈性性質(zhì)，G’’反映乳液的黏性性質(zhì)[27]。

圖 2 不同油相質(zhì)量分?jǐn)?shù)的高濃度乳液樣品G’和G”分布Fig. 2 Storage and loss modulus distribution of high-concentration emulsions with different oil phase concentrations

如圖2所示，所有卵清分離蛋白乳液樣品在本實(shí)驗(yàn)所考察的角頻率范圍內(nèi)，G’和G’’在角頻率達(dá)到20 rad/s后，隨頻率增加無顯著變化。G’遠(yuǎn)高于G’’，表明這些油相質(zhì)量分?jǐn)?shù)的卵清分離蛋白高濃度乳液都呈現(xiàn)出彈性為主的凝膠性質(zhì)[28]，可以認(rèn)為圖中所有的卵清分離蛋白高濃度乳液均形成凝膠狀乳化物，對乳液中蛋白的疏水性進(jìn)行測定時(shí)發(fā)現(xiàn)在亞麻籽油質(zhì)量分?jǐn)?shù)為65%、70%、75%時(shí)，高質(zhì)量分?jǐn)?shù)蛋白乳液稀釋到同一質(zhì)量分?jǐn)?shù)后，乳液內(nèi)蛋白熒光強(qiáng)度從6 055降低到2 813，乳液內(nèi)蛋白疏水性隨著油相質(zhì)量分?jǐn)?shù)的升高而降低，由于更多的蛋白質(zhì)與油脂發(fā)生疏水作用結(jié)合，導(dǎo)致蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)的折疊，使疏水基團(tuán)包埋[29]，因此表面疏水性下降，說明在高濃度乳液中，更多分散的油滴被包埋或整合進(jìn)乳液凝膠網(wǎng)絡(luò)中，使乳液的G’更高，乳液G’和G’’受到角頻率的影響較小，總體趨勢趨于平緩。

從圖2可以看出，在添加65%、70%、75%、80%亞麻籽油的卵清分離蛋白高濃度乳液中，G’和G’’都得到了顯著提高，這與圖1中黏度變化趨勢相符合。在65%、70%、75%、80%油相質(zhì)量分?jǐn)?shù)下，G’和G’’都隨角頻率的提高而略有提升；并且在同一頻率下，乳液的G’和G’’隨乳液中油相比例的提高而增大，這也表明油滴粒子在乳液中起到活性填充顆粒的作用[14]。

2.3 乳液的粒徑分布

乳液中的油相經(jīng)過高速剪切后，大的油滴被破碎成小的油滴，并被卵清分離蛋白包裹，使其分散在連續(xù)相之中。乳液中油滴的粒徑大小是影響乳液穩(wěn)定性及性質(zhì)的一個(gè)重要指標(biāo)，能直觀地展示乳液中油滴的狀態(tài)[30]。SDS是一種良好的抗絮凝劑，可將乳液中絮凝的油滴分散于連續(xù)液中的油滴的粒徑越小，形成的油滴絮凝更加致密緊湊，乳液的物理穩(wěn)定性越好。

圖 3 油相質(zhì)量分?jǐn)?shù)對高濃度乳液樣品粒徑分布的影響Fig. 3 Effect of different oil phase concentrations on particle size distribution of high-concentration emulsions

如圖3所示，亞麻籽油質(zhì)量分?jǐn)?shù)為65%、70%、75%、80%的高濃度乳液，其粒徑隨著油相比例的提高而減小，且都呈現(xiàn)出雙峰分布。油滴粒徑減小有利于乳液內(nèi)部油滴粒子的穩(wěn)態(tài)化，抵抗外界環(huán)境的變化而不至于聚集成大的油滴而分層。隨著油相質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，乳液油滴粒徑減小的趨勢與圖2得到的乳液G’和G’’增加具有相關(guān)性，這可能是因?yàn)樵诒狙芯康男∽冃瘟髯儨y試中，更小油滴的相互排斥或油滴的擠壓導(dǎo)致膠體體系產(chǎn)生更高的應(yīng)力[31]。

2.4 乳液的電導(dǎo)率分析

亞麻籽油是一種非極性溶劑，在20 ℃其電導(dǎo)率為0 μS/cm。高濃度乳液連續(xù)相用的去離子水的電導(dǎo)率大約為14.5 μS/cm。從圖4可以看出，卵清分離蛋白高濃度乳液的電導(dǎo)率遠(yuǎn)高于亞麻籽油的電導(dǎo)率，這表明實(shí)驗(yàn)中的高濃度乳液是用亞麻籽油分散在蛋白水溶液中形成的。

圖 4 油相質(zhì)量分?jǐn)?shù)對高濃度乳液樣品電導(dǎo)率的影響Fig. 4 Effect of different oil phase concentrations on conductivity of high-concentration emulsions

從圖4可以看出，在亞麻籽油質(zhì)量分?jǐn)?shù)為65%、70%、75%、80%時(shí)，高濃度乳液的電導(dǎo)率隨乳液中亞麻籽油質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加而逐漸下降，這種下降可以認(rèn)為一方面由于乳液中亞麻籽油質(zhì)量分?jǐn)?shù)升高，油滴粒徑變小，表面面積增大，油滴之間的蛋白質(zhì)薄膜越來越?。涣硪环矫嬗捎趤喡樽延秃康脑龈?，乳液中電荷流動移動難度增大[17,32]。當(dāng)乳液中亞麻籽油質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到85%時(shí)，乳液的電導(dǎo)率迅速下降到82.5 μS/cm，原因在于此時(shí)乳液中的連續(xù)相中蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)太高，出現(xiàn)蛋白質(zhì)聚集造成乳液中產(chǎn)生部分油包水與相分離現(xiàn)象。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)觀察發(fā)現(xiàn)，亞麻籽油質(zhì)量分?jǐn)?shù)為85%的乳液隨著靜置的時(shí)間延長，乳液的相分離加大，乳液底端的蛋白質(zhì)絮狀物增多，從而電導(dǎo)率值增大。

2.5 乳液的外觀形態(tài)

乳化的剪切設(shè)置、蛋白質(zhì)與油的比例，是制備細(xì)小液滴和比較窄的粒徑分布的穩(wěn)定乳液的重要影響因素[33]。如圖5所示，在乳化條件一定時(shí)，不同的油相比例所得的乳液的形態(tài)是不同的。在圖5A～D中，隨著乳液中油相比例的升高，可以看到乳液從流態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)楣虘B(tài)的表觀形態(tài)。這是由于當(dāng)乳液油相質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高時(shí)，覆蓋了蛋白膜的油滴便變成活性填充物，均勻填充分散在連續(xù)相之中，從而增強(qiáng)了高濃度乳液的硬度；此時(shí)蛋白質(zhì)的構(gòu)象也可能發(fā)生變化，其疏水殘基充分暴露，加強(qiáng)了蛋白質(zhì)與油滴之間的相互作用[34]。

而如果乳液在乳化過程中存在過量未吸附的蛋白質(zhì)，則可能形成聚集油滴。如圖5E所示，此時(shí)乳液亞麻籽油質(zhì)量分?jǐn)?shù)為85%，隨之乳液中水分比例變得很少，蛋白無法充分溶解造成乳液中出現(xiàn)中大量未參與結(jié)構(gòu)化的蛋白，從而造成了空缺絮凝，大量蛋白聚集到一起與油相分離[35]。

圖 5 不同油相質(zhì)量分?jǐn)?shù)的高濃度乳液樣品表觀形態(tài)Fig. 5 Apparent morphology of high-concentration emulsions with different oil phase concentrations

2.6 乳液的微觀形態(tài)結(jié)構(gòu)

圖 6 乳液的共聚焦顯微鏡圖Fig. 6 Confocal micrographs of emulsions with different oil phase concentrations

如圖6所示，卵清分離蛋白高濃度乳液的微觀結(jié)構(gòu)與亞麻籽油的質(zhì)量分?jǐn)?shù)有關(guān)，隨著油相比例的升高，乳液內(nèi)油滴會發(fā)生聚集、絮凝，并有三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的形成，乳液油滴的粒徑隨著油相質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加而減小，并且油滴之間相互擠壓。圖6C中油滴由于擠壓，呈現(xiàn)出多邊形的形狀，此時(shí)的乳液的彈性相應(yīng)增加，與G’和G’’的測定結(jié)果相同；抵抗機(jī)械力和連續(xù)相分離的能力增強(qiáng)。而在圖6D中，亞麻籽油質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到80%，油滴粒徑分布很不均勻，有很多1 μm左右的油滴凝絮在一起，也有部分未被乳化的油滴。在高濃度乳液中較小的油滴具有較高的界面區(qū)域，可以為蛋白質(zhì)的吸附提供較多位點(diǎn)，從而增強(qiáng)油滴與基質(zhì)的結(jié)合作用，提高乳液的穩(wěn)定性與彈性[36]。此外，由于乳液連續(xù)相中蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)太高（圖6D），造成大量蛋白交聯(lián)在一起因此有效地阻礙了油滴的聚結(jié)，交聯(lián)聚合的蛋白質(zhì)使得乳液呈現(xiàn)凝膠狀[37]。

用Image J V1.47中的粒徑分析功能對乳液的激光共聚焦圖像進(jìn)行分析，測定乳液油滴的費(fèi)雷特直徑。如表1所示，在亞麻籽油質(zhì)量分?jǐn)?shù)65%～80%范圍內(nèi)，乳液的平均粒徑隨油相質(zhì)量分?jǐn)?shù)的提高而減小，這與圖3結(jié)果相符合。而當(dāng)乳液中蛋白質(zhì)與油脂比例改變，乳液內(nèi)部的微結(jié)構(gòu)會發(fā)生相應(yīng)變化。隨著油相質(zhì)量分?jǐn)?shù)的升高，乳液連續(xù)相中蛋白質(zhì)的比例較高時(shí)，蛋白質(zhì)會發(fā)生自聚集，部分絮凝狀態(tài)的蛋白質(zhì)聚集體未參與整體的結(jié)構(gòu)化，以及起到固定和保持高濃度乳液特征性緊密壓縮形態(tài)的作用[38]；與此同時(shí)，連續(xù)相中有效吸附蛋白的減少使油滴聚集形成大的油滴（圖6D）。

表 1 不同油相質(zhì)量分?jǐn)?shù)下乳液的平均粒徑Table 1 Average particle sizes of emulsions with different oil phase concentrations

3 結(jié) 論

本研究以卵清分離蛋白為連續(xù)相、亞麻籽油為分散相，通過高速剪切制備卵清分離蛋白-亞麻籽油高濃度乳液。亞麻籽油質(zhì)量分?jǐn)?shù)為65%～75%時(shí)，油相質(zhì)量分?jǐn)?shù)的提高可使卵清分離蛋白-亞麻籽油高濃度乳液中黏度、G’和G’’提高，乳液平均粒徑減小以及電導(dǎo)率的下降，表明蛋白質(zhì)界面膜變薄，乳液穩(wěn)定性增強(qiáng)。油相質(zhì)量分?jǐn)?shù)為80%時(shí)，乳液黏度與平均粒徑變小，但粒徑分布變寬，蛋白交聯(lián)聚結(jié)增加了乳液連續(xù)相的彈性，乳液向凝膠轉(zhuǎn)化；與此同時(shí)，部分油滴的聚集形成了粒徑較大的油滴，這也是乳液粒徑分布變寬的原因。油相質(zhì)量分?jǐn)?shù)為85%時(shí)，乳液中黏度、G’和G’’都顯著降低，乳液粒徑顯著變大；在乳液中存在大量未乳化的油滴，蛋白質(zhì)無規(guī)則聚集與油形成松散絮狀物，蛋白質(zhì)與油相分離。由此可見，在高油相質(zhì)量分?jǐn)?shù)下制備卵清分離蛋白-亞麻籽油高濃度乳液具備很好的可行性，其良好的穩(wěn)定性與高油相比例為今后高濃度乳液在食品領(lǐng)域中的應(yīng)用提供依據(jù)和參考。