植物糖原-槲皮素復(fù)合物的制備及特征

韋倩倩，樊金玲*，朱文學(xué)，白喜婷，任國艷

（河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，河南 洛陽 471023）

槲皮素（quercetin，Qu）是一種天然存在的多羥基黃酮醇（3,3’,4’,5,7-五羥基黃酮），是黃酮中最強(qiáng)的抗氧化劑之一，廣泛存在于人類的日常飲食中，在萵苣、洋蔥、葡萄酒、漿果和茶中含量尤為豐富[1-2]，具有抗氧化、抗炎、抗病毒、抗腫瘤、抗糖尿病、保護(hù)心血管等多種生理活性[3-5]。但是Qu在水中的溶解度低（2.84～8.28 μg/mL）[6-8]；低溶解度一方面是槲皮素在體內(nèi)的吸收效率差、生物利用率低的重要原因[9]；另一方面也極大程度限制了其在水溶性基質(zhì)的食品和藥品等相關(guān)領(lǐng)域的應(yīng)用。因此，提高Qu的水溶性是保證其生物學(xué)效應(yīng)、開發(fā)其潛在應(yīng)用價值的重要途徑。

目前提高Qu溶解度的材料和體系主要有：基于脂質(zhì)體的微乳液、納米乳劑、固體脂質(zhì)體納米顆粒[10]、納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體[11]、自乳化體系[12]；基于人工合成或天然聚合物的膠束[13]、納米顆粒；形成分子復(fù)合物，如環(huán)糊精包合物[14-15]、磷脂復(fù)合物[16]。但是上述方法多數(shù)不適用于食品，例如：脂質(zhì)體制備需要大量的表面活性劑；大多數(shù)天然高分子聚合物通常需要修飾，而合成聚合物的生物相容性低等；此外，還存在體系穩(wěn)定性差、制備過程復(fù)雜及成本過高等問題。

植物糖原（phytoglycogen，PG）是由α-1,4和α-1,6糖苷鍵連接的可溶性α-D-葡聚糖[17]，廣泛存在于植物的su1突變體胚乳中。PG是支鏈淀粉的結(jié)構(gòu)類似物，但與后者相比，PG的平均鏈長更短、分支度更高；具有外緊內(nèi)松的球形樹枝狀分支模式，易溶于冷水[18-20]。王攀等[21]以PG為載體負(fù)載姜黃素（curcumin，CCM）制備了PG-CCM復(fù)合物，成功提高了CCM在水體系中的溶解度。Chen Hua等[8]以PG負(fù)載葉黃素和Qu，顯著提高了葉黃素和Qu的溶解度；但其方法存在乙醇用量大（占總體系體積的25%）、負(fù)載效率低（僅4.53%）、超聲效果不易控制等缺陷，制備體系的乙醇濃度高，不僅增加了制備成本，而且得到的 PG-Qu復(fù)合物溶液不能直接應(yīng)用于食品體系；同時，高濃度乙醇也增加了對后續(xù)操作中干燥設(shè)備的影響和要求；負(fù)載效率低則意味著Qu用量大，制備成本高。本研究采用低濃度乙醇體系（體積分?jǐn)?shù)1%），并省去超聲處理，制備PG-Qu復(fù)合物。本方法具有制備簡單、不添加任何表面活性劑、體系安全無毒等優(yōu)點。

本實驗著重研究了PG、Qu、體系pH值和鹽對Qu表觀溶解度、負(fù)載能力、負(fù)載效率的影響規(guī)律；在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研究了PG-Qu復(fù)合物的抗氧化活性和癌細(xì)胞抑制能力；并采用動態(tài)激光光散射法、透射電子顯微鏡（transmission electron microscope，TEM）、傅里葉紅外變換光譜（Fourier transform infrared spectrometer，F(xiàn)TIR）儀、X射線衍射（X-ray diffraction，XRD）儀對PG-Qu復(fù)合物的粒徑、形貌、分子相互作用等結(jié)構(gòu)表征進(jìn)行了分析。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

MCF-7細(xì)胞 ATCC細(xì)胞庫；A549細(xì)胞 國家實驗細(xì)胞資源共享服務(wù)平臺（北京總部）；玉米種子（加強(qiáng)甜型，‘中甜8號’） 北京金農(nóng)科種子科技有限公司；槲皮素（純度≥95%，色譜純） 美國Sigma公司；乙醇（國產(chǎn)分析純） 天津市德恩化學(xué)試劑有限公司；磷鎢酸 天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；碳支持膜（400 目） 中鏡科儀（北京）膜科技有限公司；DMEM高糖培養(yǎng)基 美國HyClone公司；胎牛血清江蘇恩莫阿賽生物技術(shù)有限公司；0.25%胰酶（含0.02%EDTA） 美國Biosharp公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純，購自天津市德恩化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

L5S紫外-可見分光光度計 上海儀電分析儀器有限公司；H2050R高速冷凍離心機(jī) 湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；SCIENTZ-10N真空冷凍干燥機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司；Nano-ZS90動態(tài)散射激光粒度儀 英國馬爾文儀器有限公司；TENSPOR27 FTIR儀、D8ADVANCE XRD儀 德國Bruker儀器公司；JEM-2100 TEM 日本電子公司；E191IR恒溫培養(yǎng)箱 美國西蒙公司；CKX41SF倒置電子顯微鏡日本OLYMPUS公司；SW-CJ-2FD雙人單面凈化工作臺蘇州凈化設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 PG的提取

PG的提取參照王攀等[21]的方法。將su1突變體‘中甜8號’玉米種子粉碎后，加4 倍體積去離子水，4 ℃冰箱中靜置浸提4 h，過濾，收集濾液，濾渣重復(fù)浸提2 次，合并濾液并調(diào)節(jié)pH值至4.8；于4 ℃冰箱中靜置2 h，離心（5 000×g、30 min）收集上清液，靜置24 h，二次離心（5 000×g、30 min）后收集上清液，并調(diào)節(jié)其pH值至7；高壓滅菌鍋中高溫（121 ℃、20 min）處理后再次離心（10 000×g、20 min）。取上清液，加3 倍體積的無水乙醇沉淀PG，布氏漏斗抽濾，至濾液無色，收集漏斗中的PG置于通風(fēng)櫥中揮干，以除去殘余的乙醇，得到PG固體粉末。PG平均得率為10.4%。分別采用二硝基水楊酸法[22]和考馬斯亮藍(lán)法[23]測得PG中還原糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.88%，蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.12%。

1.3.2 PG負(fù)載Qu的方法

取4.95 mL不同質(zhì)量濃度的PG水溶液（或鹽溶液），加入0.05 mL不同質(zhì)量濃度的Qu乙醇溶液，在氣浴恒溫振蕩器（200 r/min、25 ℃）中振蕩平衡30 min，離心（10 000×g、30 min），棄去不溶的Qu沉淀，上清液即為PG-Qu的負(fù)載液。將PG-Qu負(fù)載溶液進(jìn)行真空冷凍至粉狀，置于干燥器中，4 ℃冰箱中保存，備用。

1.3.3 影響PG負(fù)載Qu的因素探討

分別按要求配制溶液，按照1.3.2節(jié)中所述方法負(fù)載Qu，研究PG質(zhì)量濃度、Qu質(zhì)量濃度、PG溶液的pH值和鹽離子對負(fù)載的影響，按表1進(jìn)行操作。

表1 影響PG負(fù)載Qu的因素試驗設(shè)計Table 1 Experimental design of factors affecting Qu loading onto PG

1.3.4 表觀溶解度、負(fù)載能力及負(fù)載效率的測定

Qu質(zhì)量濃度測定的標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：用體積分?jǐn)?shù)80%乙醇配制2.5、5、7.5、10、12.5、15、17.5、20 μg/mL的Qu標(biāo)準(zhǔn)溶液，于372 nm波長處測定吸光度并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。Qu質(zhì)量濃度在0～20 μg/mL的范圍內(nèi)與吸光度呈良好的線性關(guān)系，線性回歸方程為：y＝0.075 35x－0.004 29，R2＝0.999 91。

樣品中Qu表觀溶解度的測定：取1.3.2節(jié)中的上清液（負(fù)載液）1 mL（或?qū)G-Qu凍干粉復(fù)溶于去離子水中配制一定質(zhì)量濃度的復(fù)溶液，取復(fù)溶液1 mL），以體積比1∶4的比例加入無水乙醇，混勻后離心（10 000×g、30 min），取上清液，測其在372 nm波長處的吸光度。按照公式（1）～（3）分別計算Qu的表觀溶解度、負(fù)載能力和負(fù)載效率。

1.3.5 抗氧化活性的測定

樣品準(zhǔn)備：分別配制一定質(zhì)量濃度的VC水溶液、Qu-乙醇溶液和PG-Qu水溶液3 組樣品，3 組樣品按以下方法進(jìn)行實驗，體系中Qu的終質(zhì)量濃度均為0～80 μg/mL。

總還原力測定：參考黃曉霞[24]的方法并做適當(dāng)修改，取0.5 mL樣品液于試管中，加入1.5 mL、10 mg/mL鐵氰化鉀（K3Fe(CN)6）溶液，50 ℃水浴保溫20 min；冷卻后加入2.5 mL、100 mg/mL三氯乙酸溶液；取混合液2.5 mL，依次加入2.5 mL去離子水和0.5 mL、1 mg/mL FeCl3溶液，充分混勻，靜置10 min后，于700 nm波長處測定吸光度。用等體積去離子水或無水乙醇代替樣品分別作VC（去離子水）、PG-Qu（去離子水）和Qu（無水乙醇）的空白對照，用去離子水調(diào)零。總還原力以樣品吸光度減對應(yīng)的空白對照吸光度的差值表示。以樣品終質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度差值為縱坐標(biāo)進(jìn)行作圖。以VC作陽性對照。吸光度差值越大表示還原能力越強(qiáng)。

羥自由基清除能力按水楊酸法測定。取0.25 mL樣液于試管中，加入1 mL 6 mmol/L的硫酸亞鐵（FeSO4）溶液和0.25 mL 6 mmol/L的水楊酸乙醇溶液，最后加入1 mL 6 mmol/L的H2O2溶液啟動反應(yīng)，37 ℃水浴2 h，于513 nm波長處測定吸光度，記為A1；用等體積去離子水或無水乙醇代替樣品分別作VC（去離子水）、PG-Qu（去離子水）和Qu（無水乙醇）的空白對照，用去離子水調(diào)零，測得吸光度A0；用等體積去離子水代替H2O2作背景組，以減去Qu的本底吸光度。以樣品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，羥自由基清除率為縱坐標(biāo)繪圖，其中PG-Qu組樣品清除率為PG-Qu中Qu的清除率。以VC作陽性對照。樣品對羥自由基的清除率按式（4）計算。

1.3.6 癌細(xì)胞抑制作用

樣品準(zhǔn)備：將Qu分散至DMEM培養(yǎng)基中配制Qu懸濁液，記為Qu/H2O組；將Qu溶于二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）中配制成質(zhì)量濃度為1 mg/mL的母液，再以DMEM培養(yǎng)基稀釋得到不同質(zhì)量濃度的樣品（DMSO體積分?jǐn)?shù)控制在1%以下），記為Qu/DMSO組；將PG-Qu復(fù)合物凍干粉復(fù)溶于DMEM培養(yǎng)基中配制不同質(zhì)量濃度PG-Qu樣品液，記為PG-Qu組；上述3 組樣品濃度以Qu計，均為0～100 μmol/L。同時，將PG溶于DMEM培養(yǎng)基配制與PG-Qu組相同PG質(zhì)量濃度的樣品，記為PG組。

采用噻唑藍(lán)（3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide，MTT）法研究樣品對MCF-7細(xì)胞和A549細(xì)胞增殖的抑制作用。具體為：MCF-7和A549細(xì)胞用含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清、100 U/mL雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)，37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細(xì)胞80%鋪滿瓶底；貼壁細(xì)胞用0.25%胰酶（含0.02% EDTA）消化1 min后，棄去胰酶，用DMEM培養(yǎng)基將細(xì)胞吹打下來，制成細(xì)胞懸液，以1×105個/mL的細(xì)胞濃度接種至96 孔板，每孔200 μL，培養(yǎng)24 h。棄去舊培養(yǎng)基，加入200 μL新鮮培養(yǎng)基或樣品液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。棄去舊培養(yǎng)基，磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffered saline，PBS）清洗兩次，每孔加入200 μL新鮮培養(yǎng)基和10 μL MTT（5 mg/mL），繼續(xù)培養(yǎng)4 h。利用酶標(biāo)儀測490 nm波長處樣品吸光度，記為A2，加等體積培養(yǎng)基的吸光度記為A1，加等體積PBS的孔中溶液吸光度記為A0，根據(jù)式（5）計算抑制率，PG-Qu組抑制率為扣除PG組抑制率之后的數(shù)據(jù)，n＝6。

1.3.7 PG-Qu的結(jié)構(gòu)表征

1.3.7.1 粒徑分布的測定

配制4、5、6、8、10 mg/mL的PG溶液分別和6 mg/mL的Qu溶液，按照1.3.2節(jié)中的方法進(jìn)行負(fù)載，得到不同PG質(zhì)量濃度的PG-Qu復(fù)合物負(fù)載液。負(fù)載液分別用去離子水稀釋至PG終質(zhì)量濃度為2 mg/mL，漩渦振蕩器混勻，使用Nano-ZS90動態(tài)光散射激光粒度儀測定其粒徑分布、聚合物分散指數(shù)（polymer dispersity index，PDI）。

1.3.7.2 TEM分析樣品內(nèi)部結(jié)構(gòu)

將PG-Qu復(fù)合物溶于0.02 mol/L的醋酸鈉緩沖溶液（pH 5.5）中，配制成0.01 g/100 mL的PG-Qu復(fù)合物溶液，取一滴滴在碳涂層上，干燥后再次重復(fù)上一步操作；用15 mg/mL的磷鎢酸染液滴一滴在加有樣品的銅網(wǎng)上進(jìn)行負(fù)染，2 min后用濾紙吸去多余的染色液，樣品在室溫下干燥過夜后進(jìn)行TEM成像處理[25]。

1.3.7.3 FTIR光譜的測定

精確稱取Qu和PG，并以1∶100質(zhì)量比混合均勻，制成Qu與PG的物理混合物，分別稱取Qu、PG、Qu與PG的物理混合物和PG-Qu復(fù)合物凍干粉4 種樣品各1～2 mg，將樣品分別與100 mg溴化鉀（KBr）粉末加入研缽中并研磨均勻，用壓片機(jī)壓片，用不加樣的KBr壓片作為背景空白，掃描范圍500～4 000 cm－1，分辨率4 cm－1，掃描32 次。

1.3.7.4 XRD圖譜測定

工作條件：Cu靶，掃描速率8°/min，測定管壓40 kV，管流40 mA，掃描范圍5°～35°（2θ）。分別對Qu、PG、PG和Qu的物理混合物以及PG-Qu復(fù)合物進(jìn)行XRD測定。

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計

所有實驗重復(fù)3 次，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示；利用DPS軟件中實驗統(tǒng)計-完全隨機(jī)設(shè)計-單因素試驗統(tǒng)計分析進(jìn)行數(shù)據(jù)的差異顯著性分析（P＜0.05）；用Origin 8.5軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同因素對PG負(fù)載Qu的影響

本研究將少量高質(zhì)量濃度（6 mg/mL）的Qu乙醇溶液分散于一定質(zhì)量濃度的PG溶液中，使體系中Qu處于過飽和狀態(tài)，乙醇體積分?jǐn)?shù)為1%。此時，即存在Qu分子相互聚集從而生成沉淀的過程，同時也存在Qu與PG分子相互作用形成PG-Qu復(fù)合物的過程，兩個過程彼此競爭；通過離心操作除去Qu沉淀，得到可溶性PG-Qu復(fù)合物。

圖1 不同因素對PG負(fù)載Qu的影響Fig. 1 Influence of different factors on Qu loading onto PG

如圖1A所示，當(dāng)體系中不存在PG時，由于Qu的溶解度很低，吸光度小于本實驗檢測方法的最低檢測限（分光光度法），無法測得準(zhǔn)確數(shù)值。當(dāng)PG質(zhì)量濃度在1～5 mg/mL范圍內(nèi)，Qu表觀溶解度隨PG質(zhì)量濃度增大而顯著增大；隨后繼續(xù)提高PG質(zhì)量濃度，表觀溶解度不再增加。PG對Qu的負(fù)載效率的影響呈類似規(guī)律，而負(fù)載能力則隨PG質(zhì)量濃度增大呈現(xiàn)減-增-減的變化趨勢。當(dāng)PG質(zhì)量濃度為5 mg/mL時，表觀溶解度、負(fù)載能力和負(fù)載效率達(dá)到最大值，分別為47 μg/mL、9.49 μg/mg和78.33%。

如圖1B所示，當(dāng)Qu質(zhì)量濃度在1～6 mg/mL范圍內(nèi)，Q u表觀溶解度和負(fù)載能力隨Q u質(zhì)量濃度增大而顯著增大，表觀溶解度提高了5.37 倍，負(fù)載效率無顯著變化（7 0.9 8%～7 9.8 8%）；隨后繼續(xù)提高Q u質(zhì)量濃度至8 m g/m L，表觀溶解度、負(fù)載能力和負(fù)載效率均呈逐步下降趨勢。由于負(fù)載體系中Qu處于過飽和狀態(tài)，同時存在Qu分子相互聚集生成沉淀以及Qu與PG分子相互作用生成可溶性PG-Qu復(fù)合物兩個過程，彼此競爭；因此，當(dāng)Qu質(zhì)量濃度較小時（小于6 mg/mL），體系中存在的PG分子數(shù)量足以用于負(fù)載Qu，即形成可溶性復(fù)合物的過程占優(yōu)勢；當(dāng)進(jìn)一步增大Qu質(zhì)量濃度時，體系中的PG分子數(shù)量相對不足，Qu分子的相互聚集生成沉淀的過程占優(yōu)勢，從而導(dǎo)致Qu表觀溶解度下降。

如圖1C所示，當(dāng)溶液pH值從2增至6時，Qu的表觀溶解度未發(fā)生顯著變化；pH值從6增至8時，Qu的表觀溶解度提高了3.9 倍。負(fù)載效率和負(fù)載能力呈類似變化規(guī)律，最大值分別可達(dá)75.82%、9.19 μg/mg。據(jù)報道，Qu的—OH的去質(zhì)子化順序為4’—OH、7—OH、3—OH、3’—OH、5—OH，對應(yīng)的pKa分別為6.41、7.81、10.91、11.53、12.91，Qu在pH 5以下的酸性環(huán)境中不會發(fā)生去質(zhì)子化[26]。本實驗中，當(dāng)體系pH值小于6時，由于Qu幾乎不發(fā)生去質(zhì)子化，Qu分子趨向于相互聚集生成沉淀；當(dāng)pH值大于6時，Qu的羥基發(fā)生去質(zhì)子化而使分子帶有部分電荷，呈電負(fù)性的Qu分子傾向于以游離的單分子形式存在，從而增大了其與PG相互作用的機(jī)率。

圖2 NaCl（A）、醋酸鹽（B）、磷酸鹽（C）濃度對PG負(fù)載Qu的影響Fig. 2 Effect of NaCl (A), acetate (B), phosphate (C) concentrations on Qu loading onto PG

NaCl和醋酸鹽濃度對負(fù)載無顯著影響（圖2A、B）。磷酸鹽濃度則顯著影響PG對Qu的負(fù)載，當(dāng)磷酸鹽濃度從0 mmol/L增至5 mmol/L時，Qu表觀溶解度急劇下降了25.20%；繼續(xù)增大磷酸鹽濃度至20 mmol/L，Qu的表觀溶解度持續(xù)下降至初始的66.57%（圖2C）。

在上述研究結(jié)果基礎(chǔ)上，采用5 mg/mL的PG溶液和6 mg/mL的Qu乙醇溶液在pH 8不含磷酸鹽的條件下負(fù)載，制備了PG-Qu復(fù)合物溶液。將溶液凍干成粉，冷水復(fù)溶至PG質(zhì)量濃度為50 mg/mL，得到黏度低、流動性強(qiáng)、狀態(tài)穩(wěn)定的復(fù)溶液。測得此條件下Qu的表觀溶解度為509.46 μg/mL，與在水中Qu表觀溶解度（2.84 μg/mL）相比提高近180 倍，負(fù)載效率為79.88%，負(fù)載能力為9.68 μg/mg。

當(dāng)將PG-Qu復(fù)合物凍干粉復(fù)溶至PG質(zhì)量濃度20 mg/mL時，Qu的表觀溶解度雖然僅有201.56 μg/mL，與文獻(xiàn)[8]的結(jié)果相比降低，但負(fù)載效率提高了近20 倍，減少了Qu的用量，降低了制備成本。

2.2 PG負(fù)載對Qu抗氧化活性的影響

圖3 Qu、PG-Qu的總還原力（A）和羥自由基清除能力（B）Fig. 3 Total reducing power (A) and hydroxyl radical scavenging ability (B) of Qu and PG-Qu complex

如圖3A、B所示，Qu組和PG-Qu組樣品的總還原力和羥自由基清除能力均呈現(xiàn)良好的量效關(guān)系；當(dāng)Qu質(zhì)量濃度相同時，PG-Qu組樣品的總還原力和羥自由基清除能力高于Qu組，與Lee[27]、劉康[28]等分別報道的Qu/二氧化硅納米粒、Qu/殼聚糖納米粒與Qu相比，對羥自由基和的清除作用有所提高的結(jié)果相同。因此，PG負(fù)載Qu形成PG-Qu復(fù)合物納米粒后，其抗氧化活性與Qu相比增強(qiáng)，可能是因為Qu制備成納米粒后的表面積增加，使其與活性自由基接觸幾率更大。

2.3 PG負(fù)載對Qu抑制癌細(xì)胞效果的影響

圖4 Qu和PG-Qu對MCF-7（A）和A549（B）細(xì)胞的抑制作用Fig. 4 Inhibition of MCF-7 cells (A) and A549 cells (B) by Qu and PG-Qu complex

Qu可以通過調(diào)節(jié)細(xì)胞生長過程抑制結(jié)腸癌細(xì)胞、乳腺癌細(xì)胞、肺癌細(xì)胞、肝癌細(xì)胞等多種癌細(xì)胞的增殖[29-32]。如圖4所示，不同組中，Qu對MCF-7細(xì)胞和A549細(xì)胞的抑制作用均呈劑量依賴性；細(xì)胞培養(yǎng)過程中，Qu濃度為20～100 μmol/L時，各組對這兩種細(xì)胞的抑制率從大到小均依次為Qu/DMSO組＞PG-Qu組＞Qu/H2O組，且組間差異顯著。表明PG負(fù)載Qu后能顯著提高Qu對MCF-7細(xì)胞和A549細(xì)胞增殖的抑制作用。細(xì)胞實驗中常用DMSO溶解Qu，再以培養(yǎng)基稀釋制備Qu，并不是將Qu直接溶于DMEM培養(yǎng)基中，因溶劑中含有DMSO，故Qu/DMSO組的結(jié)果不能完全反映出游離Qu在水體系中的細(xì)胞抑制效果；Qu/H2O組和PG-Qu組均直接用培養(yǎng)基配制，PG-Qu組的細(xì)胞抑制率顯著高于Qu/H2O組，表明PG-Qu復(fù)合物能顯著提高Qu在水體系中的細(xì)胞抑制效果。

圖5 Quu/H2O、PG-Qu、Qu/DMSO處理24 h后MCF-7（A）、A549（B）細(xì)胞顯微鏡圖Fig. 5 Microscopic images of MCF-7 cells (A) and A549 cells (B) after 24 h treatment with Qu/H2 OO, PG-Qu, and Qu/DMSO

100 μmol/L的Qu/H2O、PG-Qu、Qu/DMSO和不加樣品的培養(yǎng)基分別培養(yǎng)MCF-7細(xì)胞和A549細(xì)胞24 h后，置于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，結(jié)果見圖5。對于MCF-7細(xì)胞，空白孔（圖5A1）的細(xì)胞分布均勻，細(xì)胞形態(tài)完整，細(xì)胞邊緣清晰可見；Qu/H2O組（圖5A2）細(xì)胞邊緣模糊，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化；PG-Qu組（圖5A3）細(xì)胞嚴(yán)重變形，細(xì)胞裂解成碎片；Qu/DMSO組（圖5A4）細(xì)胞凋亡嚴(yán)重，瓶底僅剩少部分細(xì)胞碎片附著。對于A549細(xì)胞，空白孔（圖5B1）的細(xì)胞分布均勻，細(xì)胞生長致密；Qu/H2O組（圖5B2）細(xì)胞間隙增大，細(xì)胞出現(xiàn)空泡；PG-Qu組（圖5B3）可見細(xì)胞數(shù)量明顯減少，現(xiàn)存的細(xì)胞嚴(yán)重皺縮變形，細(xì)胞裂解；Qu/DMSO組（圖5B4）細(xì)胞凋亡嚴(yán)重，瓶底僅剩少部分細(xì)胞碎片附著。

2.4 PG-Qu復(fù)合物的結(jié)構(gòu)表征結(jié)果

2.4.1 PG-Qu復(fù)合物的粒徑分布及Zeta電位

利用Nano-ZS90激光粒度儀測定PG負(fù)載Qu前后的粒徑分布，結(jié)果見圖6和表2。PG的平均粒徑約為71.51 nm；不同質(zhì)量濃度PG負(fù)載Qu得到PG-Qu復(fù)合物的粒徑與PG相比無顯著變化，均在68～72 nm之間；PG和PG-Qu復(fù)合物粒徑的PDI均小于0.15，表明PG和PG-Qu復(fù)合物粒徑分布均勻；PG的Zeta電位為－4.12 mV，負(fù)載Qu后PG-Qu的Zeta電位顯著下降至約－10 mV，推測可能因為在負(fù)載條件下（pH 7.74）PG帶負(fù)電荷，而Qu的羥基發(fā)生去質(zhì)子化使Qu呈電負(fù)性，故PG負(fù)載Qu后所帶負(fù)電荷顯著增加。

圖6 PG、PG-Qu復(fù)合物的粒徑分布Fig. 6 Particle size distribution of PG and PG-Qu complex in aqueous solution

表2 PG-Qu和PG的平均粒徑和PDITable 2 Average particle size and polymer dispersity index of PG-Qu complex and PG

2.4.2 TEM分析結(jié)果

圖7 PG（A）、PG-Qu復(fù)合物（B）的TEM圖像Fig. 7 TEM images of PG (A) and PG-Qu complex (B)

如圖7所示，PG表現(xiàn)為分布均勻、表面光滑的球形結(jié)構(gòu)，直徑約30～50 nm，與Huang Lei[20]和Bi Lin[33]等采用TEM測定PG納米粒的粒徑結(jié)果相近。PG-Qu復(fù)合物形貌與PG相比無明顯變化。TEM成像所測粒徑小于采用激光粒度儀測定的平均粒徑（68～72 nm）。采用TEM觀察樣品時，樣品需做干燥處理，樣品分子脫水，使測得的粒徑小于溶液狀態(tài)下水化分子時采用激光粒度儀測定的粒徑。

2.4.3 FTIR結(jié)果

圖8 Qu（a）、PG（b）、PG-Qu物理混合物（c）和PG-Qu（d）紅外譜圖Fig. 8 FTIR spectra of Qu (a), PG (b), physical mixture of PG and Qu (c)and PG-Qu complex (d)

如圖8所示，在PG的光譜中，峰位3 368 cm－1出現(xiàn)一寬峰，為—OH的伸縮振動。在Qu的光譜中，3 312 cm－1處的峰為—OH的伸縮振動峰，1 664 cm－1處為C環(huán)上的—C＝O的伸縮振動峰，1 612 cm－1處為C環(huán)上的—C＝C的伸縮振動峰，1 512 cm－1和1 560 cm－1處的峰分別為Qu的A環(huán)和B環(huán)的苯環(huán)特征振動峰。在Qu與PG的物理混合物光譜中，上述Qu的特征吸收峰均存在；其中，1 664 cm－1處的－C＝O伸縮振動峰移至1 662 cm－1處，1 560 cm－1的峰移至1 559 cm－1處。PG-Qu復(fù)合物紅外光譜中，Qu光譜中1 664、1 612、1 560 cm－1和1 512 cm－1處的特征吸收峰均消失，PG的—OH的伸縮振動從3 368 cm－1紅移至3 374 cm－1，表明PG與Qu發(fā)生了相互作用[8,34-35]。據(jù)文獻(xiàn)報道，氫鍵是酚類化合物與聚合物發(fā)生相互作用的主要作用力[36]。本研究中，PG-Qu復(fù)合物光譜中，Qu C環(huán)—C＝O的伸縮振動吸收峰消失，表明其可能參與了PG與Qu間氫鍵的形成。

2.4.4 XRD結(jié)果

由圖9可知，Qu在衍射角（2θ）13.18°、16.85°、22.04°和26.70°處有明顯的衍射峰存在，表明其為晶體結(jié)構(gòu)[35,37]；PG不是晶體，故其衍射光譜中沒有明顯衍射峰；Qu衍射峰在Qu與PG物理混合物的衍射圖譜中基本上都存在，表明Qu以晶體形式存在于混合物中；PG-Qu復(fù)合物衍射圖譜中所有衍射峰都消失，表明PG-Qu中Qu幾乎以無定形的狀態(tài)存在。PG可以通過形成氫鍵與Qu相互作用，從而破壞Qu的原始晶體結(jié)構(gòu)，使Qu轉(zhuǎn)化為無定形狀態(tài)。物質(zhì)的結(jié)晶狀態(tài)影響其溶解度[38-40]，Qu晶體結(jié)構(gòu)緊密，導(dǎo)致其水溶性差；而PG-Qu復(fù)合物中Qu的無定形狀態(tài)提高了其在水中的溶解度。

圖9 Qu（a）、PG（b）、PG-Qu物理混合物（c）和PG-QQuu（dd）XRD譜圖Fig. 9 XRD spectra of Qu (a), PG (b), physical mixture of PG and Qu (c) and PG-Qu complex (d)

3 結(jié) 論

PG是一種新型的載體，通過簡單的步驟負(fù)載Qu得到PG-Qu復(fù)合物，粒度分布均勻且與PG相比粒徑無顯著差異；負(fù)載液凍干后復(fù)溶至PG質(zhì)量濃度為50 mg/mL，Qu表觀溶解度可提高近180 倍，負(fù)載能力為9.68 μg/mg，負(fù)載效率為79.88%。PG負(fù)載Qu前后均呈均勻光滑的球形結(jié)構(gòu)，粒徑無顯著變化，利用激光粒度儀測定的平均粒徑為68～72 nm。Qu在PG-Qu復(fù)合物中以無定形的非晶體形式存在，氫鍵是Qu與PG發(fā)生作用的主要作用力。PG-Qu復(fù)合物與Qu相比抗氧化性和對癌細(xì)胞（MCF-7細(xì)胞和A549細(xì)胞）的抑制作用均顯著提高。綜合以上可得出，PG是一種高效的載體，可顯著提高Qu的表觀溶解度，同時可提高Qu的抗氧化性和癌細(xì)胞抑制作用，因此有望被應(yīng)用于功能食品中以促進(jìn)Qu的藥理作用。