血清BNP、cTnl、DGCR8水平變化對診斷先天性心臟病患者病情發(fā)生發(fā)展的影響

牛會曉，謝雙霞，薛園園

（許昌市人民醫(yī)院兒童重癥監(jiān)護病房，河南 許昌 461000）

流行病學研究表明,我國部分地區(qū)先天性心臟病的發(fā)病率可接近485～686/1萬人左右[1]。臨床上先天性心臟病的發(fā)生,能夠導致患者惡性心血管結局事件的發(fā)生，增加了患者的病死率可能[2,3]?，F(xiàn)階段臨床上缺乏對于先天性心臟病病情評估的可靠性指標，而對于相關病情評估性指標的研究，能夠指導臨床上先天性心臟病患者的診療和臨床預后評估工作。腦鈉肽(BNP)是心房細胞分泌的糖蛋白，其表達濃度的上升能夠反應心臟的順應性改變，評估心肺循環(huán)障礙的發(fā)生風險[4]；肌鈣蛋白（cTnI）是反應心肌細胞膜完整性的指標,在心肌細胞損傷或者膜完整性破壞的患者中，cTnI的表達濃度可明顯的上升[5]；喬治綜合癥危象基因（DGCR8）的表達濃度的上升,能夠通過影響到心血管內皮細胞的分化成熟，促進心臟內膜下心肌細胞的發(fā)育，抑制心臟的重塑性改變,降低先天性心臟病的病情進展速度[6]。 為了揭示 BNP、cTnl、DGCR8 的表達與先天性心臟病患者的病情關系,從而為臨床上相關患者的病情評估提供參考,本次研究選擇2016年1月-2018年1月我院兒科收治的106例先天性心臟病患兒為觀察組,探討了BNP、cTnl、DGCR8的表達及其與患兒的病情關系，報告如下。

1 材料與方法

1.1 一般資料 選擇2016年1月-2018年1月我院兒科收治的106例先天性心臟病患兒為觀察組，其中男50例、女46例，年齡2個月～24個月，同期健康體檢兒童160例為對照組,其中男89例，女71例，年齡1月～12歲,兩組患者在性別、年齡等一般資料方面無明顯差異(P＞0.05)，具有可比性。觀察組患兒中室間隔缺損16例,房間隔缺損5例，房間隔合并室間隔缺損9例，房室間隔缺損2例，法洛四聯(lián)癥4例，動脈導管未閉4例。納入標準:無肝、腎功能不全、血液系統(tǒng)疾病及腫瘤；健康對照組血常規(guī)、肝腎功能、心臟超聲等檢查均無異常。排除標準：臨床資料不完整，治療后無明顯好轉或死亡。本研究經過醫(yī)院臨床研究倫理委員會批準，所有受試者監(jiān)護人自愿參與本次研究,并簽署知情同意書。

1.2 分組標準 依據改良Ross評分標準將患者分為三組，分別為無心力衰竭組（n=11），輕度心衰組（n=45），中度心衰組（n=38）和重度心衰組（n=12）。分組標準:無心力衰竭(0～2 分)，輕度心衰(3～6 分)，中度心衰(7～9 分)，重度心衰(10～12 分)，見表 1。

表1 改良Ross標準

1.3 觀察指標 觀察組患兒在入院第2天和治療后穩(wěn)定期分別采集空腹靜脈血1～2 ml,低溫300g離心3min，吸取血清，置-20℃凍存?zhèn)溆?對照組兒童取清晨空腹靜脈血1～2 ml，處理同觀察組,采用免疫發(fā)光法檢測所有受試者血清腦鈉肽 (BNP)、肌鈣蛋白（cTnI）濃度，采用RT-PCR法檢測血清中DGCR8 mRNA的表達水平。心功能參數LVEF、LVFS測量采用多普勒超聲心動圖儀，根據兩組的LVESD和LVEDD計算出左心室質量指數(LVMI)。

1.4 檢測方法 采集患者的靜脈血3ml,加入BNP、cTnl單抗，標本和標準品中的BNP、cTnl會與單抗結合,PBS液體洗滌5min。按照1：500的比例加入羊標志的一抗5ml，4℃放置過夜，PBS緩沖液洗滌3 次，每次 5min，加入鼠來源的二抗（1：1000）2ml，室溫放置2h，PBS液體洗滌5min。加入顯色底物,辣根過氧化物酶會使無色的顯色劑現(xiàn)藍色,加終止液變黃。于450nm處測OD值。

采集患者的靜脈血，加入0.2ml的氯仿，2℃～8℃ 冰凍離心機12000 g離心15min,反復一次洗滌RNA,棄上清,在管底部可見一乳白色小沉淀物，加入1 ml 75%乙醇,0.1%DEPC水溶解。加入DGCR8基因和 GAPDH上下游引物、0.1%DEPC使其終濃度均為 20pmol/μl，制備反應體系，RTPCR 擴增的條件與參數：48℃，45min，94℃，2 min；94℃ 30s，58℃ 60s，68℃ 2min 共 40 個循環(huán)； 循環(huán)完畢后 68℃ 延伸 7 min。

檢查儀器為美國飛利浦公司生產的IE33，儀器探頭設置為3.5～5.0MHZ,檢測左室射血分數（LVEF）及左室短軸收縮率（LVFS）、左心室質量指數(LVMI)。

1.5 統(tǒng)計學方法 統(tǒng)計軟件采用SPSS16.0，采用均數±標準差（x±s）進行統(tǒng)計描述，組間比較采用t檢驗;計數資料組間比較采用χ2檢驗；P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義，采用pearson檢驗分析心功能參數 LVEF、LVFS、LVMI 與血清 BNP、cTnl、DGC R8水平相關性，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 先天性心臟病患兒血清BNP、cTnl、DGCR8水平變化 觀察組患兒血清BNP、cTnl水平較對照組明顯升高，DGCR8 mRNA表達較對照組顯著降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），見表 2。

2.2 不同心功能等級先心病患兒血清BNP、cTnl、DGCR8水平變化 患兒BNP、cTnl、DGCR8水平在不同心功能等級組間差異均有統(tǒng)計學意義,P均＜0.05，心功能等級越高，血清中BNP、cTnl水平越高，DGCR8 mRNA表達越低，見表3。

表2 先天性心臟病患兒血清BNP、cTnl、DGCR8水平變化

表3 不同心功能患兒組血清BNP、cTnl、DGCR8水平比較

2.3 先心病患兒血清BNP、cTnl、DGCR8水平與心功能指標相關性 先心病患兒血清BNP水平與LVEF呈顯著負相關，與LVMI呈顯著正相關；cTnl與LVFS呈顯著負相關；DGCR8 mRNA表達呈顯著負相關。見表4。

3 討論

遺傳性因素、射線及胚胎期不同病理性因素的致畸，均能夠促進先天性心臟病的發(fā)生，特別是在合并有相關心血管先天性疾病家族史的患者中，先天性心臟病的發(fā)生率可進一步的上升[7]。臨床上先天性心臟病的發(fā)生,能夠導致患兒生活質量的顯著下降,并能夠增加肺性腦病、肺動脈高血壓、多器官功能衰竭等的發(fā)生風險[3,8]?，F(xiàn)階段臨床上主要通過心臟超聲檢測評估先天性心臟病患者的病情,但一項囊括了203例樣本量的病情評估分析研究可見,依靠心臟超聲檢查評估先天性心臟病患者病情的一致性率仍然存在一定的局限性,其對于患兒遠期心力衰竭或者臨床轉歸的預測作用不足[9]。而本次研究對于先天性心臟病患者體內BNP、cTnl、DGCR8的表達分析研究，不僅能夠揭示先天性心臟病的病情進展機制,同時還能為臨床上相關患兒的病情評估提供血清學方面的參考。

BNP是反應患者心力衰竭潛在風險的指標，由于先天性心臟病患兒,其多數存明顯的心肺循環(huán)障礙,心臟泵血負荷的增加，能夠導致心房細胞分泌BNP能力的顯著上升,促進了機械性刺激下BN P的分泌速度[10]；cTnl是反應心肌細胞損傷的指標,在急性心肌梗塞或者冠脈綜合癥的患者中,cTnl的表達均可顯著上升。而在先天性心臟病患兒中，由于心臟循環(huán)負荷的增加,心肌細胞能量利用代謝的障礙,均能夠導致心肌細胞的缺氧缺血性損傷[11]；DGCR8能夠通過內質網或者線粒體的微處理器，影響到微小RNA的轉錄和合成，進而參與到心血管內皮細胞的分化和成熟過程。

本次研究探討了BNP、cTnl、DGCR8在心臟病患兒中的表達情況,發(fā)現(xiàn)在病例組患者血清中，B NP、cTnl的表達濃度明顯上升,而DGCR8的表達濃度明顯下降,提示了 BNP、cTnl、DGCR8的差異性表達,均能夠參與到兒童先天性心臟病的發(fā)生發(fā)展過程。通過匯集不同的相關文獻，筆者認為這主要由于BNP、cTnl、DGCR8的下列幾個方面的機理有關[12,13]：⑴先天性心臟病患者，心肺循環(huán)的障礙，能夠導致動脈血中血氧飽和度的下降,導致心肌細胞的缺氧缺血性損傷,進而促進了心肌細胞膜的破壞，促進了BNP、cTnl的釋放；⑵先天性心臟病患兒,其心血管內皮細胞的分化障礙和心臟間質組織細胞的發(fā)育調控異常，導致DGCR8的合成顯著的不足。杜偉等[14]研究者也認為，在心臟病患者中，BNP的表達濃度可平均上升40%以上,特別是在合并有明顯的肺動脈高壓或者肺心病的患者中，BNP的表達濃度可進一步的上升。在探討不同心衰程度的患者相關指標的表達過程中,可以發(fā)現(xiàn)在心衰組特別是重度心衰組患者中，BNP、cTnl的表達濃度明顯上升,而DGCR8的表達濃度明顯的下降，提示BNP、cTnl、DGCR8的表達與先天性心臟病患者的病情嚴重程度具有密切的關系,這主要由于心血管系統(tǒng)病情嚴重程度越高,患兒體內的心肌細胞的損傷程度越為明顯，BNP、cTnl的釋放程度越高[15]。但部分研究者并不認為cTnl的表達與兒童心衰患者的病情存在相關關系,存在不同的臨床結論主要考慮與cTnl的檢測時機或者檢測方法的不同有關。左室射血分數（LVEF）及左室短軸收縮率（LV FS）、左心室質量指數(LVMI)，是評估患兒心功能的指標,可以發(fā)現(xiàn) BNP、cTnl、DGCR8的表達與患兒的心功能水平密切相關,進一步提示了BNP、cTnl、DGCR8的表達與先天性心臟病患者的病情關系。

綜上所述，在先天性心臟病患者中，BNP、cTnl的表達濃度明顯上升，DGCR8的表達明顯下降，同時BNP、cTnl、DGCR8的表達與患兒心衰程度及心功能密切相關。

表4 先心病患兒血清BNP、cTnl水平及DGCR8 mRNA表達與心功能指標相關性