非小細(xì)胞肺癌化療患者Nrf2表達(dá)與遠(yuǎn)期療效臨床分析

程治強(qiáng)，崔恩華，白衛(wèi)云

（1.河南省直屬機(jī)關(guān)第一門診部胸外科，河南 鄭州 450000；2.河南省榮軍醫(yī)院腫瘤科，河南 新鄉(xiāng)453000；3.河南省第二人民醫(yī)院腫瘤科，河南 新鄭 451191）

非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NS CLC）的五年生存率較低，中位生存時(shí)間較短，遠(yuǎn)期生存預(yù)后不佳[1]。流行病學(xué)研究顯示,NSCLC的發(fā)病率可達(dá)0.006%～0.012%左右,且在部分地區(qū)NSC LC的發(fā)病率呈現(xiàn)出一定的上升趨勢(shì)[1]。在對(duì)于NS CLC發(fā)病過(guò)程中相關(guān)生物學(xué)機(jī)制的研究發(fā)現(xiàn)，不同生物學(xué)因子的激活可以通過(guò)提高癌細(xì)胞的增殖活性、促進(jìn)其對(duì)于淋巴結(jié)的浸潤(rùn)而加劇病情的進(jìn)展[2]。核因子E2相關(guān)因子2（nuclear factor E2 related factor 2，Nrf2）是協(xié)同刺激分子，其可以通過(guò)對(duì)于氧化應(yīng)激反應(yīng)的誘導(dǎo)作用,促進(jìn)癌細(xì)胞的持續(xù)性擴(kuò)增，導(dǎo)致其遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等的風(fēng)險(xiǎn)增加。相關(guān)研究已經(jīng)證實(shí)，Nrf2的表達(dá)在促進(jìn)卵巢癌、甲狀腺癌等上皮細(xì)胞惡性腫瘤中發(fā)揮重要作用,認(rèn)為高表達(dá)的NRF2能夠促進(jìn)癌細(xì)胞增殖速度的改變[3]，但對(duì)于Nrf2的表達(dá)與肺癌臨床病理特征的關(guān)系研究仍鮮有報(bào)道。為了進(jìn)一步揭示Nrf2在促進(jìn)NSCLC發(fā)生發(fā)展中的作用，本研究通過(guò)檢測(cè)Nrf2在NSCLC患者中的表達(dá)變化,并分析探討其與患者中位生存時(shí)間的關(guān)系,以期為臨床肺癌患者的預(yù)后評(píng)估提供一定的參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2014年2月至2016年4月在我院接受化療治療的NSCLC患者87例，其中男性52例,女性35例;年齡49～71歲,平均年齡(61.20±5.43)歲；鱗癌 48例,腺癌 30例,大細(xì)胞癌 9例；Ⅲ期39例，Ⅳ期48例。納入標(biāo)準(zhǔn)：⑴經(jīng)支氣管鏡活檢或CT穿刺肺組織后病理確診為NSCLC；⑵符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)制定的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)[4]；⑶均接受含鉑的雙藥化療方案；⑷預(yù)計(jì)生存期＞3個(gè)月；⑸患者及家屬知情同意并簽署同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：⑴既往有惡性腫瘤史、接受過(guò)放化療者；⑵預(yù)計(jì)生存期＜3個(gè)月。

1.2 檢測(cè)方法 采用石蠟切片脫蠟至水，切片厚度3μm，3%H2O2室溫孵育 5 min，采用去離子水沖洗3次，每次3min，用濃度為1%BSA封閉液（南京碧云天生物有效公司）封閉,室溫孵育 5min,加入Nrf2抗體(鼠源,南京碧云天生物科技有限公司),37℃ 孵育2h,PBS緩沖液沖洗3次,每次5min,滴加HRP標(biāo)記的二抗(兔源,羅氏檢測(cè)公司),37℃ 孵育30min,PBS沖洗3次,每次5min,加入NBT/BCIP色劑顯色5min，復(fù)染，脫水，于透明玻片封片，鏡下觀察。OLIPICS光學(xué)顯微鏡購(gòu)自上海精密儀器有限公司，配套試劑購(gòu)自南京泰康生物科技有限公司。

1.3 免疫組化結(jié)果判斷 在高倍鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù),每個(gè)視野計(jì)數(shù)200個(gè)腫瘤細(xì)胞，染色強(qiáng)度分為：無(wú)染色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；陽(yáng)性細(xì)胞比例分為0～100%。參照陳杰[5]的免疫組化評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)將細(xì)胞核染色強(qiáng)度和陽(yáng)性比例乘積進(jìn)行評(píng)價(jià),乘積大于0.25為Nrf2陽(yáng)性表達(dá)，小于0.25為陰性。

1.4 療效評(píng)價(jià) 近期療效以化療4個(gè)周期后按照實(shí)體瘤療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)1.1版評(píng)價(jià)[6]，分為完全緩解(complete response,CR)、部分緩解(partial response,PR)、疾病穩(wěn)定(stable disease,SD)和疾病進(jìn)展(progressive disease,PD);遠(yuǎn)期療效采用總生存期(overall survival,OS)評(píng)價(jià)，OS指化療開始至死亡或隨訪終點(diǎn)時(shí)間。末次隨訪時(shí)間為2017年2月1日。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 數(shù)據(jù)分析應(yīng)用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,計(jì)數(shù)資料采用百分比或頻數(shù)表示,組間比較使用χ2檢驗(yàn),Kaplan-Meier法進(jìn)行生存曲線分析,比較采用Log-rank檢驗(yàn),多因素分析采用Cox回歸分析,P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Nrf2表達(dá)與患者臨床特征的關(guān)系≥60歲患者Nrf2陽(yáng)性表達(dá)率為53.19%,明顯高于＜60歲患者的12.50%,Ⅳ期患者Nrf2陽(yáng)性表達(dá)率為47.92%,明顯高于Ⅲ期患者的17.95%（P＜0.05）；不同性別、病理類型、分化程度、化療方案及近期療效患者Nrf2陽(yáng)性表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見表1。

2.2 Nrf2表達(dá)與遠(yuǎn)期療效關(guān)系 隨訪期間，Nrf2表達(dá)陽(yáng)性和陰性患者分別死亡18例和28例，Kaplan-Meier生存分析顯示，Nrf2表達(dá)陽(yáng)性患者中位OS 為 13 個(gè)月(95%CI：11.80～14.20)，Nrf2 表達(dá)陰性患者中位 OS 為 19 個(gè)月（95%CI：16.67～21.33），差異比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=8.460，P=0.004），見圖 1。

圖1 Kaplan-Meier生存曲線圖

2.3 多因素分析 COX多因素分析結(jié)果顯示,病理類型及Nrf2表達(dá)為NSCLC患者預(yù)后的預(yù)測(cè)因素。與肺鱗癌患者相比，腺癌患者死亡風(fēng)險(xiǎn)降低（OR=0.462，95%CI=0.183～0.953），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；與Nrf2陰性患者相比，Nrf2陽(yáng)性患者死亡風(fēng)險(xiǎn)升高(OR=1.806，95%CI=1.123～3.592)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表1 Nrf2表達(dá)與患者臨床特征的關(guān)系

3 討論

NSCLC的發(fā)生,主要與吸煙、遺傳基因突變或者家族史等有關(guān)，NSCLC容易早期發(fā)生淋巴結(jié)或者血行的轉(zhuǎn)移，臨床預(yù)后較差[7]。臨床回顧性分析研究表明，NSCLC的五年生存率不足35%，中位生存時(shí)間不足32個(gè)月[8],迄今臨床上缺乏對(duì)于NSCLC患者的早期診斷或者預(yù)后的相關(guān)評(píng)估指標(biāo)。本次研究通過(guò)對(duì)相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行研究,為臨床上NSCLC術(shù)后重點(diǎn)人群隨訪提供參考。

Nrf2是協(xié)同共刺激分子家族成員,能夠通過(guò)影響癌細(xì)胞的生物學(xué)特征，進(jìn)而促進(jìn)癌細(xì)胞的擴(kuò)散，同時(shí)Nrf2對(duì)于癌細(xì)胞對(duì)淋巴結(jié)內(nèi)皮細(xì)胞浸潤(rùn)能力的促進(jìn)作用,可加劇癌細(xì)胞淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或者遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)[9,10]。Nrf2結(jié)構(gòu)上包含了多個(gè)重復(fù)的巰基結(jié)構(gòu),能夠通過(guò)與癌細(xì)胞膜表面的糖蛋白受體結(jié)合，促進(jìn)癌相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，引起細(xì)胞凋亡的抑制[11,12]。此外，臨床分期越晚，Nrf2陽(yáng)性表達(dá)率越高[13]。

本研究通過(guò)免疫組化分析研究Nrf2的表達(dá)與肺癌患者臨床病理特征的關(guān)系,結(jié)果發(fā)現(xiàn)Nrf2與肺癌患者的病理類型、分化程度等臨床特征并無(wú)明顯的關(guān)聯(lián),提示Nrf2可能并不會(huì)影響到癌細(xì)胞的來(lái)源,同時(shí)Nrf2的表達(dá)對(duì)于肺癌上皮細(xì)胞早期分化的調(diào)控作用也可能不明顯，這與賈小婷等[14]研究者在探討部分早期肺部浸潤(rùn)性癌的臨床免疫組化資料時(shí)報(bào)道的Nrf2表達(dá)對(duì)于癌細(xì)胞分化抑制作用并不明顯結(jié)果相符。本研究中，≥60歲、Ⅳ期患者的Nrf2陽(yáng)性表達(dá)率要分別明顯高于＜60歲年齡段、臨床TNM分期較早的患者，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），提示Nrf2可以促進(jìn)肺癌臨床分期的進(jìn)展，并可能與發(fā)病年齡具有內(nèi)在的相關(guān)性。相關(guān)研究表明[15]，臨床分期越晚，Nrf2的上升越為明顯,這些均證實(shí)了Nrf2的表達(dá)與患者臨床分期的關(guān)系。Nrf2陽(yáng)性表達(dá)對(duì)于患者臨床分期的影響，主要與Nrf2陽(yáng)性的表達(dá)對(duì)于癌細(xì)胞的侵襲或者轉(zhuǎn)移能力的改變有關(guān)[15]。在評(píng)估Nrf2對(duì)患者遠(yuǎn)期生存預(yù)后時(shí)間的影響中,本研究發(fā)現(xiàn)Nrf2的表達(dá)與患者的中位生存時(shí)間具有密切的關(guān)系，Nrf2的陽(yáng)性率越低，中位生存時(shí)間越長(zhǎng)，考慮可能與下列因素有關(guān)：Nrf2的陽(yáng)性表達(dá)，增強(qiáng)了殘留癌細(xì)胞的復(fù)發(fā)活性，導(dǎo)致癌細(xì)胞遠(yuǎn)期復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)的增加；Nrf2的高表達(dá),促進(jìn)了肺癌細(xì)胞對(duì)于臨近正常肺部組織的浸潤(rùn)，導(dǎo)致殘留肺功能的降低，患者病死率或者生存時(shí)間進(jìn)一步惡化。此外，COX多因素分析結(jié)果顯示,病理類型及Nrf2的表達(dá)是患者OS的預(yù)測(cè)因素,進(jìn)一步提示除了病理類型可以影響到肺癌患者的遠(yuǎn)期預(yù)后，Nrf2也可以有效指導(dǎo)評(píng)估患者的生存預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)。但部分研究并未發(fā)現(xiàn)Nrf2的表達(dá)與患者生存預(yù)后的關(guān)系，考慮可能與樣本量的限制、臨床資料的分布偏移等有關(guān)[16]。

綜上所述，Nrf2在NSCLC患者中異常表達(dá)，其表達(dá)與患者的臨床分期或者年齡具有密切的關(guān)系,同時(shí)Nrf2的表達(dá)可以在一定程度上指導(dǎo)肺癌患者的遠(yuǎn)期臨床預(yù)后。

表2 影響NSCLC患者OS的多因素Cox分析