ASC-US患者HPV感染與Th17/Treg細(xì)胞及炎癥因子的變化分析

馬梅 ，張德陽 ，許德清 ，蔣蕾 ，薛芬 ，薛峰

（1.南陽市臥龍區(qū)計(jì)劃生育宣傳技術(shù)服務(wù)站婦科，河南 南陽473000；2.南陽市第二人民醫(yī)院病理科，河南 南陽473000；3.南陽市第二人民醫(yī)院產(chǎn)一科，河南 南陽 473000；4.南陽市醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校第一附屬醫(yī)院放射科，河南 南陽 473000；5.南陽市第一人民醫(yī)院康復(fù)科，河南 南陽 473000；6.南陽市宛城區(qū)疾病控制中心，河南 南陽 473000）

流行病學(xué)研究證實(shí),非典型鱗狀細(xì)胞(ASC-US)的發(fā)病率可達(dá)283～593/1萬人左右[1]。臨床上ASCUS的發(fā)生能夠增加患者宮頸高級(jí)別病變的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn),提高遠(yuǎn)期宮頸惡性腫瘤的發(fā)生率[2]。在探討A SC-US的發(fā)生或者病情進(jìn)展機(jī)制的過程中發(fā)現(xiàn)，人乳頭瘤狀病毒（HPV）的感染，能夠通過促進(jìn)宮頸柱狀上皮細(xì)胞的損傷和DNA的擴(kuò)增，進(jìn)而促進(jìn)宮頸病變的發(fā)生[3]；輔助性T淋巴細(xì)胞（T17）是T淋巴細(xì)胞亞群的重要成員,其能夠通過促進(jìn)體內(nèi)炎癥因子的釋放，加劇宮頸上皮組織的炎癥性損傷，進(jìn)而促進(jìn)宮頸病變的發(fā)生[4]；調(diào)解性T細(xì)胞（Treg）是CD4 T淋巴細(xì)胞亞群的重要成員,其能夠通過對(duì)于T淋巴細(xì)胞免疫的調(diào)控作用導(dǎo)致細(xì)胞免疫功能的紊亂，導(dǎo)致免疫抑制和免疫逃逸的發(fā)生[5]。部分研究者探討了高危型HPV病毒感染與ASC-US的關(guān)系,認(rèn)為高危型HPV病毒感染是促進(jìn)ASC-US病情進(jìn)展的重要因素[6]，但對(duì)于Th17、Treg細(xì)胞與宮頸病變的關(guān)系研究不足。為了深入揭示Th17、Treg細(xì)胞與ASC-US的關(guān)系,從而為臨床上宮頸病變的預(yù)防和治療提供參考,本次研究選取我院婦科門診2017年3月至2017年12月收集的200例ASCUS患者，探討了HPV病毒亞型、Th17、Treg細(xì)胞表達(dá)情況，報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2017年3月至2017年12月于我院婦科門診收集的200例ASC-US患者，根據(jù)宮頸活檢組織學(xué)診斷將其分為宮頸炎性病變患者52例 (炎性組)、宮頸上皮內(nèi)瘤變患者133例（CIN組）、宮頸癌患者15例（宮頸癌組）。炎性組，年齡29～68歲，平均37.6±11.7歲。CIN組，年齡26～65歲，平均39.0±12.2歲，其中CINⅠ級(jí)39例、CINⅡ級(jí)60例、CINⅢ級(jí)34例。宮頸癌組,年齡31～66歲,平均40.2±10.8歲。三組患者的年齡比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。納入標(biāo)準(zhǔn)：⑴宮頸炎、CIN患者、宮頸癌患者的診斷標(biāo)準(zhǔn)參考《婦產(chǎn)科學(xué)》人民衛(wèi)生出版社第八版中的標(biāo)準(zhǔn);⑵所有研究對(duì)象均接受了薄層液基細(xì)胞學(xué)（TCT）、宮頸活組織病理學(xué)檢查；⑶納入研究對(duì)象的年齡19～69歲;⑷本研究獲得研究對(duì)象的知情同意、醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。排除標(biāo)準(zhǔn)：⑴既往具有宮頸手術(shù)史；⑵盆腔及卵巢惡性腫瘤；⑶急慢性感染性疾病；⑷免疫系統(tǒng)疾病。

1.2 HPV檢測方法 采用美國Digene公司二代雜交捕獲試驗(yàn)(hybrid capture,HC-II)的采樣工具,宮頸管采集標(biāo)本,進(jìn)行HC-II檢測操作并作出分析。檢測目前已知的13種高危型HPV。HPV≥1.0 ng/L為檢測陽性。

1.3 Th17/Treg細(xì)胞檢測 采集患者清晨空腹血5ml，置于肝素鈉抗凝管中，采用流式細(xì)胞儀雙標(biāo)法進(jìn)行CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的檢測。相關(guān)標(biāo)記操作于5ml抗凝管中進(jìn)行，100μl全血與CD4-FITC/CD25-PE抗體室溫反應(yīng)25min,采用紅細(xì)胞裂解液optiLYse C溶血素溶解紅細(xì)胞，PBS液體洗滌三遍，每次5min，生理鹽水重新懸浮細(xì)胞，上機(jī)檢測。(FACS calibur流式細(xì)胞儀購自美國BD公司，threg檢測試劑盒購自羅氏檢測公司）。

采用ficoll法分離人外周血T淋巴細(xì)胞，取20μl細(xì)胞混合液加入錐蟲藍(lán),加入離子霉素后植入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1h，加入莫能霉素，繼續(xù)培養(yǎng)5h。取200μl細(xì)胞懸浮液,加入 10μl固定液，加入 30μl細(xì)胞裂解液,反應(yīng)20min之后1000r/min離心5min(離心半徑15cm),加入25μl IL-17 FITC/CD4 PE抗體進(jìn)行標(biāo)記，孵育30min后上機(jī)檢測。（th17檢測試劑盒購自南京凱基生物科技有限公司）

1.4 炎癥因子檢測 采集入院后靜脈血，1000r/min離心5min，離心半徑10cm，離心后收集上清液，采用免疫發(fā)光法檢測 IL-17、TGF-β、IL-23水平，加入檢測試劑，檢測儀器為美國Bio-Bad全自動(dòng)酶標(biāo)儀,配套試劑盒購自羅氏檢測公司,微型離心機(jī)HIT ETIC購自上海精密儀器有限公司。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)、分析應(yīng)用SPSS16.0，應(yīng)用(x±s)表示計(jì)量數(shù)據(jù)，計(jì)量數(shù)據(jù)的比較分析采用單因素方差分析法,組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)；P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組患者HPV感染型別分析 宮頸癌組患者的HPV16型、HPV52型均顯著高于CIN組和炎性組（P<0.05），CIN 組患者的 HPV16型、HPV52型均顯著高于炎性組（P<0.05）；宮頸癌組、CIN組和炎性組患者的HPV18型、HPV58型感染率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；見表 1。

表1 三組患者HPV感染型別分析[n（%）]

2.2 三組患者Th17/Treg細(xì)胞比較 宮頸癌組患者的外周血中CD4+IL17+Th17、CD4+CD25+Foxp3+Treg、Th17/Treg細(xì)胞均顯著的高于CIN組和炎性組（P<0.05），CIN 組患者的 CD4+IL17+Th17、CD4+CD25+Foxp3+Treg、Th17/Treg均顯著的高于炎性組（P<0.05）；見表 2。

表2 三組患者Th17/Treg細(xì)胞比較（x±s）

2.3 三組患者血清細(xì)胞因子比較 宮頸癌組患者的血清IL-17、TGF-β、IL-23均顯著高于CIN組和炎性組(P<0.05),CIN組患者的血清IL-17、TGF-β、IL-23均顯著高于炎性組（P<0.05）；見表3。

表3 三組患者血清細(xì)胞因子比較（x±s）

3 討論

宮頸柱狀上皮細(xì)胞的持續(xù)性異常分裂,能夠促進(jìn)宮頸惡性腫瘤的發(fā)生，特別是在合并有HPV16、HPV18及HPV52等感染的患者中，宮頸癌的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)更高[7]。臨床上的長期觀察認(rèn)為，宮頸癌的五年生存率不足35%,包括手術(shù)在內(nèi)的相關(guān)綜合性治療措施治療后的無瘤生存時(shí)間不足36個(gè)月[8]。免疫靶向治療能夠在惡性腫瘤的診療過程中發(fā)揮重要的作用，其能夠抑制腫瘤的復(fù)發(fā)，提高患者的整體生存預(yù)后水平。而本次研究對(duì)于宮頸癌患者體內(nèi)的相關(guān)因子的表達(dá)分析,能夠?yàn)榕R床上宮頸癌的免疫靶向治療提供理論基礎(chǔ)。

HPV16、HPV52等高危型病毒的感染，能夠促進(jìn)癌細(xì)胞快速跨越G0期，提高了癌細(xì)胞的持續(xù)性自我增殖的風(fēng)險(xiǎn)。高危型HPV病毒感染導(dǎo)致的宮頸柱狀上皮整合作用,能夠提高柱狀上皮細(xì)胞浸潤和突破基底膜組織的能力[9]；Th17淋巴細(xì)胞能夠通過對(duì)于炎癥性因子的調(diào)控和釋放,進(jìn)而促進(jìn)柱狀上皮細(xì)胞的病變，Th17細(xì)胞分泌的IL-17或者腫瘤壞死因子,均能夠促進(jìn)柱狀上皮細(xì)胞的持續(xù)性DN A擴(kuò)增，導(dǎo)致癌基因錯(cuò)配修復(fù)能力的下降，促進(jìn)了上皮細(xì)胞的異常分化過程[10]；Treg細(xì)胞是 CD4亞群的重要成員,其對(duì)樹突狀細(xì)胞的抗原提呈功能的調(diào)控，能夠抑制自身T淋巴細(xì)胞的免疫能力，降低其對(duì)HPV病毒顆粒的清除作用[11]。

本次研究對(duì)宮頸病變患者不同高危型HPV亞型的分析可見，在宮頸上皮內(nèi)瘤變（CIN）及宮頸癌患者中，HPV16型、HPV52型陽性率明顯上升，高于良性宮頸上皮組織,其中宮頸癌患者中的HPV 16型、HPV52型陽性率更高,提示了高危型HPV病毒感染對(duì)于宮頸病變的影響。但本次研究中并未發(fā)現(xiàn)HPV18亞型的差異,這可能考慮與不同地區(qū)的流行病學(xué)的差異有關(guān)[12]。對(duì)于免疫性指標(biāo)的相關(guān)研究可見,在CIN及宮頸癌患者中，CD4+IL17+Th17、CD4+CD25+Foxp3+Treg的百分率和 Th17/Treg比例均明顯上升,提示了免疫性因素對(duì)于宮頸病變發(fā)生的影響。通過匯集不同的相關(guān)文獻(xiàn),筆者認(rèn)為這主要與相關(guān)免疫細(xì)胞的下列作用有關(guān)[13]：⑴CD4+IL17+Th17的上升能夠通過促進(jìn)IL-17的合成和釋放，促進(jìn)了其對(duì)于宮頸上皮DNA的損傷作用，導(dǎo)致癌基因的擴(kuò)增速度明顯的上升；⑵CD4+CD25+Foxp3+Treg的上升,能夠?qū)е聇h1/th2免疫平衡的紊亂,導(dǎo)致樹突狀細(xì)胞抗原提呈作用的下降，促進(jìn)了宮頸癌上皮細(xì)胞的免疫逃逸過程。徐浩等[14]研究者也認(rèn)為，在宮頸癌患者中，Th17淋巴細(xì)胞的陽性率可平均上升30%以上,特別是在病程較長或者合并有明顯的宮旁組織浸潤的患者中，其表達(dá)陽性率可進(jìn)一步的上升。Th17/Treg的上升則提示Th17淋巴細(xì)胞的上升明顯高于Treg的上升幅度，推測Th17淋巴細(xì)胞在宮頸病變的過程中發(fā)揮了更為顯著的促進(jìn)作用。但部分研究者并不認(rèn)為CD4+CD25+Foxp3+Treg可明顯上升,認(rèn)為在宮頸癌患者中,存在明顯的免疫抑制,CD4+CD25+Foxp3+Treg可明顯下降，存在不同的臨床結(jié)論，考慮可能與宮頸癌患者的臨床分期或者指標(biāo)檢測時(shí)機(jī)的不同有關(guān)。白細(xì)胞介素17（IL-17）、轉(zhuǎn)化生長因子 β（TGF-β）及白細(xì)胞介素 23（IL-23）是炎癥性效應(yīng)因子，在CIN組及宮頸癌患者中，IL-17、TGF-β、IL-23的表達(dá)均明顯上升，特別是宮頸癌患者中的表達(dá)更為明顯，提示炎癥反應(yīng)的激活，能夠在促進(jìn)宮頸持續(xù)性病變過程中發(fā)揮重要作用。這主要由于IL-17、TGF-β、IL-23相關(guān)因子的上升,能夠影響癌細(xì)胞的生物學(xué)特征,導(dǎo)致癌細(xì)胞的浸潤和增殖能力的增強(qiáng)，進(jìn)而促進(jìn)了病情的進(jìn)展[15]。

本次研究的創(chuàng)新性在于探討了宮頸病變患者中Th17、Treg細(xì)胞的表達(dá)情況。綜上所述,宮頸癌組織中HPV16型、HPV52型感染率較高,體內(nèi)的Th17、Treg細(xì)胞明顯上升，同時(shí)存在明顯的炎癥反應(yīng)激活。