應(yīng)用16S rRNA基因序列分析鑒定從痰培養(yǎng)中分離的假肺炎鏈球菌

賴希希，蔡鵬威，王軍軍，屈平華

（1.福建省立金山醫(yī)院檢驗(yàn)科，福建 福州 350028；2.廣東省中醫(yī)院檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)部，廣東 廣州 510006）

假肺炎鏈球菌 （S.pseudopneumoniae）是Arbique[1]等2004年命名的菌種。該菌是一種草綠色鏈球菌，屬于緩癥-口腔鏈球菌復(fù)合群，其在遺傳學(xué)上與肺炎鏈球菌十分接近，并因故而命名。在生物學(xué)特征上，假肺炎鏈球菌不含肺炎鏈球菌莢膜，不溶于膽汁,在5%CO2氣體環(huán)境中對奧普托辛（OP）紙片耐藥或不確定的敏感性，但在大氣中培養(yǎng)時(shí)敏感，可與肺炎鏈球菌進(jìn)行鑒別[1]。我們最近通過痰涂片和質(zhì)譜鑒定技術(shù),確定了一例假肺炎鏈球菌的臨床感染，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 病例摘要

患者，男，76歲，既往有心臟病和慢性阻塞性肺病病史。入院一周前不慎受涼，期間反復(fù)低熱，因突發(fā)胸悶、氣促、痰多而入院。入院檢查，血常規(guī)提示中性粒細(xì)胞升高，CRP（24.9mg/l）、PCT（0.1ng/ml）等炎癥指標(biāo)升高，胸部CT提示肺部炎癥、肺結(jié)構(gòu)改變，血?dú)夥治觯貉鹾系停?0mmHg）、二氧化碳不高（40mmHg），聽診雙肺啰音明顯，診斷Ⅰ型呼吸衰竭、慢性阻塞性肺病急性加重、肺部感染明確，痰涂片革蘭陽性菌可見吞噬，鹽酸莫西沙星靜滴（0.4g）經(jīng)驗(yàn)性抗感染，吸氧，霧化治療。治療第二天，患者咳嗽、咳痰減輕，改口服鹽酸莫西沙星片（0.4g），痰培養(yǎng)結(jié)果為假肺炎鏈球菌，青霉素敏感，左氧氟沙星敏感，繼續(xù)目前抗感染方案。第四天，患者少許咳痰，無發(fā)熱，血象正常，停用抗生素。

2 細(xì)菌培養(yǎng)鑒定

深部痰標(biāo)本接種哥倫比亞血瓊脂平板、巧克力平板和麥康凱平板,放入37℃5%CO2孵育箱中培養(yǎng)24小時(shí)，原始痰涂片鏡檢為合格標(biāo)本，其中多形WBC>25/LP，SEC<10/LP，大量革蘭陽性球菌，菌體似矛頭狀，成雙或成短鏈狀排列的雙球菌，形似肺炎鏈球菌，且白細(xì)胞空泡內(nèi)有菌體(見圖1)。痰培養(yǎng)結(jié)果為草綠色鏈球菌生長 （3+)，其菌落較干燥，與典型的肺炎鏈球菌的菌落形態(tài)存在差異（見圖2）。以配置0.5麥?zhǔn)暇和坎加诰d羊血瓊脂平板，并將奧普托辛紙片置于平板的中心，分別放置在37℃5%CO2和大氣環(huán)境中孵育過夜。試驗(yàn)結(jié)果顯示，CO2環(huán)境的抑菌圈直徑大小為15mm,大氣環(huán)境的抑菌圈直徑大小為25mm（見圖3）。對該菌進(jìn)行了Vitek MS質(zhì)譜鑒定,質(zhì)譜鑒定結(jié)果顯示為假肺炎鏈球菌,可信度99.9%。為保證鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性，我們還進(jìn)行了16S rRNA基因測序鑒定。采用16S rRNA基因通用引物，27F（5'-AGA GTTT GATYMTGGCTCAG-3')和1492R(5'-GGTTACCTT GTTACGACT T-3'）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序，測序序列進(jìn)行比對[2]，結(jié)果顯示該菌與肺炎鏈球菌的相似度99.63%,與假肺炎鏈球菌的相似度99.75%（見圖4）,與假肺炎鏈球菌的相似度更高，結(jié)合表型鑒定結(jié)果，可進(jìn)一步確定分離株為假肺炎鏈球菌。藥敏試驗(yàn)：VITEK2 GP68重復(fù)2次,且延長孵育時(shí)間至48h，但均未生長。手工藥敏,青霉素：35mm，萬古霉素：26mm，克林霉素：30mm，紅霉素：31mm，四素素：30mm，復(fù)方新諾明：21mm，苯唑西林：18mm，左旋氧氟沙星：25mm。

圖1 痰涂片鏡檢（1000倍）

圖2 痰培養(yǎng)的血平板生長狀況

圖3 OP試驗(yàn)結(jié)果（左圖為CO2環(huán)境，右圖為大氣環(huán)境）

圖4 分離株的16S rRNA基因測序鑒定結(jié)果

3 討論

假肺炎鏈球菌最常見于呼吸道標(biāo)本,與慢性阻塞性肺疾病和吸入性肺炎相關(guān)[3,4]，也可從血液[5]、腹水[5]、眼結(jié)膜[5,6]以及其他無菌部位分離出。假肺炎鏈球菌不含肺炎鏈球菌莢膜,不溶于膽汁，在5%CO2氣體環(huán)境中對奧普托辛（OP）紙片耐藥或不確定的敏感性，但在大氣中培養(yǎng)時(shí)敏感，可與肺炎鏈球菌進(jìn)行鑒別,用基因探針和PCR擴(kuò)增特征性基因溶肺鏈菌素基因(ply)和錳依賴性超氧化物歧化酶基因(sodA)均不能將其與肺炎鏈球菌鑒別開。經(jīng)DN A-DNA同源性比較研究確定它是一個(gè)新種,命名為假肺炎鏈球菌[1]。假肺炎鏈球菌的抗菌素耐藥性已經(jīng)被證實(shí)，并且比肺炎鏈球菌更耐藥[3,7,8]?；仡櫼酝膱?bào)道，大部分的假肺炎鏈球菌對紅霉素、四環(huán)素和青霉素耐藥[3,5,7,8]。由于該菌的菌落為草綠色鏈球菌樣，易被臨床微生物檢驗(yàn)工作者所忽視，故國內(nèi)的臨床報(bào)道較為少見,臨床微生物工作者應(yīng)提高對原始涂片的重視[9,10,11]，避免遺漏假肺炎鏈球菌的檢出，造成臨床診斷和病情預(yù)測偏差，日常工作中若懷疑有假肺炎鏈球菌時(shí),可同時(shí)做5%CO2及大氣環(huán)境中OP試驗(yàn)，作為簡便快速的初篩試驗(yàn)。

近年來,隨著生物技術(shù)和分子生物學(xué)的不斷進(jìn)步，細(xì)菌的分類鑒定已不再囿于傳統(tǒng)的物理形態(tài)、生理生化鑒定,而是進(jìn)入到了分子基因水平[2,7,12,13]?；诩?xì)菌16S rRNA基因的PCR擴(kuò)增與測序同國際公認(rèn)的公共核酸序列數(shù)據(jù)庫比對,結(jié)合計(jì)算機(jī)的大數(shù)據(jù)分析，被證明是鑒定病原菌快速、有效、準(zhǔn)確的方法[2,7,12]。與表型特征分類方法相比,16S rRNA基因序列測定在分析鑒定細(xì)菌進(jìn)化過程、親緣性方面具有突出優(yōu)勢,令人鼓舞的是目前絕大部分的原核生物細(xì)菌已被測定,日常一部分用表型方法鑒定有困難、不明確、不能培養(yǎng)、培養(yǎng)時(shí)間久或者難以培養(yǎng)的細(xì)菌，運(yùn)用16S rRNA基因序列分析通常能進(jìn)行準(zhǔn)確地鑒定。16S rRNA基因序列分析不僅可用于分析臨床中出現(xiàn)的少見菌、疑難菌、新發(fā)傳染性細(xì)菌，甚至還可以初步鑒定細(xì)菌新種，這對于提高臨床微生物檢驗(yàn)的能力和水平大有裨益[14]。本文通過這種基因測序分析法,結(jié)合表型及生化特征分析,成功地對這株假肺炎鏈球菌進(jìn)行了鑒別。