1844例新型冠狀病毒核酸檢測及生物安全防護實踐

周丹，何進才，黃濤，李惠貞，張德明，谷大偉，羅勝華

（深圳市中醫(yī)院檢驗科,廣東 深圳 518033）

新冠肺炎（corona virus disease 19,COVID-19）是由新型冠狀病毒[1，2]（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2,簡稱新冠病毒）感染所致的肺部炎癥，人群普遍易感，自2019年12月在武漢被發(fā)現(xiàn)以來，迅速蔓延至全中國乃至全球，截至2月28日24時，31個?。ㄗ灾螀^(qū)、直轄市）以及新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團累計確診病例79251例[3]。新冠病毒是冠狀病毒β屬的新成員，屬于單鏈RNA病毒，可引起人類呼吸道感染，其基因特征與重癥急性呼吸綜合征（SARSr-CoV）和中東呼吸綜合征（MERSr-CoV）有明顯區(qū)別[4]。新冠肺炎診療方案（試行第六版）中提到，病原學證據(jù)是新冠肺炎診斷的金標準。臨床病例或疑似病例具備實時熒光RT-PCR新冠病毒核酸陽性或病毒基因測序與已知的新冠病毒高度同源,即為確診病例[4]。然而病毒測序?qū)嶒炇壹夹g(shù)、人員、設(shè)備等要求較高，因此熒光RT-PCR是目前新冠肺炎確診中使用最廣泛的方法?，F(xiàn)將實時熒光RT-PCR在本院病例檢測中的應(yīng)用情況及實踐經(jīng)驗報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病例來源 選取2020年1月30日－2020年2月28日就診于本院發(fā)熱門診的患者 （包括發(fā)熱患者、湖北旅居者以及密切接觸者、外地返深人員）,共 1844 例。

1.1.2 試劑與儀器 試劑采用湖南圣湘生物科技有限公司生產(chǎn)的核酸提取試劑盒及新型冠狀病毒核酸檢測試劑盒。儀器使用安捷倫MX3000P熒光定量PCR儀和羅氏cobas z480熒光定量PCR儀。

1.2 方法

1.2.1 樣本采集 采用預(yù)約模式集中采樣,每天分兩個時段，上午和下午各一批，由發(fā)熱門診經(jīng)過生物安全培訓合格并穿戴生物安全三級防護的醫(yī)生進行采樣，每個病例采集口咽拭子。對多次檢測陰性或高度疑似的患者,由臨床醫(yī)生根據(jù)需要采集鼻咽拭子、肺泡灌洗液、痰液或肛拭子等。

1.2.2 樣本包裝、運送及接收 樣本采集后放入帶螺旋蓋有墊圈、耐冷凍的病毒保存管，擰緊，管外貼條形碼。樣本管噴灑75%酒精消毒后放入密封袋，每袋限一份樣本。收集樣本后豎置放于樣本運送盒,蓋緊蓋子，置于感染性樣本運輸箱進行運輸，運輸箱上標明“新冠檢測”。樣本由經(jīng)過生物安全培訓合格的專人送至實驗室。接收人員用75%酒精噴灑樣本運輸箱外表面后打開,再用75%酒精噴灑樣本運送盒,最后取出樣本運送盒放入生物安全柜中打開，核對樣本數(shù)量，檢查樣本有無泄漏。

1.2.3 樣本核酸提取及擴增 采用磁珠法提取核酸RNA，試劑盒包含裂解液、磁珠結(jié)合液、磁珠洗滌液、磁珠、洗脫液等。核酸擴增以新冠病毒開放讀碼框 1ab（open reading frame,ORF1ab）及編碼核衣殼蛋白（nucleoprotein,N）基因的特異性的保守序列為靶區(qū)域，設(shè)計雙靶標基因。配以PCR反應(yīng)液，于熒光定量PCR儀上通過熒光信號的變化實現(xiàn)RNA的檢測。

1.2.4 結(jié)果解讀分析 實驗采用的PCR檢測體系包含內(nèi)源性的內(nèi)標引物（IC），通過檢測內(nèi)標是否正常來監(jiān)測樣本采集、核酸提取及擴增過程，避免假陰性結(jié)果。每批次實驗中設(shè)置3個陰性質(zhì)控和1個臨界陽性質(zhì)控，隨機插入樣本中同步檢測，監(jiān)控實驗結(jié)果是否有效。結(jié)果分析時應(yīng)先查看陰、陽性質(zhì)控品結(jié)果,陰性質(zhì)控品FAM、ROX通道均無Ct值或Ct＞40；陽性質(zhì)控品FAM、ROX通道及內(nèi)標（HEX）通道Ct≤35，若質(zhì)控品的結(jié)果均滿足以上要求,此批次實驗有效,否則實驗無效,需重新檢測。

每個檢測樣本的結(jié)果需參照試劑盒說明書要求，結(jié)果分析如下：⑴對于FAM或ROX通道檢測到典型的S型擴增曲線，且Ct≤40，可報告為樣本SARS-CoV-2核酸陽性。⑵對于FAM且ROX通道均未檢測到典型的S型擴增曲線（No Ct），或Ct＞40，HEX通道有擴增曲線，且Ct≤40的樣本，可判斷為樣本SARS-CoV-2核酸陰性。⑶對于FAM、ROX、HEX通道均未檢測到典型的S型擴增曲線（No Ct）或 Ct＞40，表示樣本細胞含量太低或者有干擾物質(zhì)抑制反應(yīng)，該樣本檢測結(jié)果無效，需查找并排除原因，并對此樣本重新采樣進行重復(fù)試驗。

1.2.5 實驗室生物安全防護 實驗室生物安全管理嚴格按照國家衛(wèi)生健康委員會公告 （2020年第1號）規(guī)定要求[5]，新型冠狀病毒肺炎納入法定傳染病乙類管理，采取甲類傳染病的防控措施。在開展新冠核酸檢測前，根據(jù)《新型冠狀病毒感染的肺炎實驗室檢測技術(shù)指南》[6]、《2019新型冠狀病毒肺炎臨床實驗室檢測的生物安全防護指南》[7]等文件,我們對實驗室進行了充分的評估,精心設(shè)計檢測流程，做到每一個環(huán)節(jié)都有相應(yīng)的防護措施。

1.2.5.1 單位資質(zhì) 醫(yī)院為三級醫(yī)院,實驗室為經(jīng)二級生物安全實驗室備案和省級臨床基因擴增檢驗實驗室備案,有生物安全三級實驗室防護裝備儲備。

1.2.5.2 個人資質(zhì) 檢測人員取得市級以上病原微生物實驗室生物安全培訓證書和臨床基因擴增檢驗技術(shù)人員上崗證書，并經(jīng)過新冠病毒核酸檢測培訓合格并授權(quán)。

1.2.5.3 人員防護 樣本采集和核酸檢測人員采用三級生物安全防護,樣本運送及接收人員采用二級生物安全防護。

1.2.5.4 核酸檢測 核酸檢測每批次由兩名實驗人員來完成，一名進行核酸提取，一名進行反應(yīng)體系的配制及核酸擴增上機。核酸提取人員在清潔區(qū)穿戴三級生物安全防護用品，并由另一人員檢查，確保防護有效后進入實驗區(qū)進行核酸提取。核酸提取全程在生物安全柜中操作，動作應(yīng)輕柔緩慢，避免產(chǎn)生氣溶膠;標本離心后將離心機轉(zhuǎn)子放置到生物安全柜中再打開;混勻器放置于生物安全柜中進行震蕩混勻。生物安全柜內(nèi)放置小型垃圾桶，套黃色垃圾袋,并倒入適量2000mg/L有效氯消毒液，所有加樣后的槍頭等廢棄物均丟棄在含消毒液的垃圾桶中。

1.2.5.5 檢測后樣本保存及處理 核酸檢測陽性樣本送至市疾控復(fù)核；陰性樣本視為高危醫(yī)療廢物，放入高壓滅菌袋，經(jīng)121℃30min高壓滅菌后再按一般醫(yī)療廢物移出實驗室。

1.2.5.6 醫(yī)療廢物處理 所有垃圾均視為有疑似新冠高危醫(yī)療廢物,固體廢物裝入黃色垃圾袋并用鵝頸結(jié)封口,套入高壓滅菌袋,在標本制備區(qū)進行121℃30min高壓滅菌后再沿一般醫(yī)療廢物通道移出實驗室。核酸提取過程中產(chǎn)生的廢液,采用2000mg/L的有效氯消毒液浸泡過夜后,排入下水道。

1.2.5.7 實驗室消毒 ⑴實驗前,打開實驗室空氣消毒機消毒1h。⑵每天新鮮配制消毒液，消毒液有效時間＜24h。⑶每次實驗前后，用75%酒精擦拭生物安全柜，切忌不能噴灑。⑷實驗結(jié)束后，臺面用1000mg/L的有效氯消毒液或75%酒精擦拭消毒；地面采用1000mg/L的有效氯消毒液拖地消毒。⑸臺面地面消毒后，打開生物安全柜紫外消毒燈，消毒時間＞60min；打開實驗室固定紫外燈,消毒時間＞60min。⑹消毒完畢后，再打開窗戶進行通風。⑺若檢測到陽性樣本,采用7.5%過氧化氫噴霧對實驗室進行終末消毒。⑻工作結(jié)束時將所有消毒措施記錄于實驗室消毒登記表中。

1.3 統(tǒng)計分析 本研究為觀察性研究，描述性報道事件計數(shù)，無統(tǒng)計檢驗。

2 結(jié)果

2.1 樣本檢測結(jié)果 受檢的1844例樣本中,其中咽拭子1836例,肺泡灌洗液4例，鼻拭子1例，肛拭子3例。新冠核酸陽性2例，均為咽拭子樣本，其中男性1例，女性1例，且都有新冠患者密切接觸史。Ct值分別為35.72和38.60。見圖1、圖2。

圖1 兩例陽性樣本內(nèi)標擴增曲線

圖2 兩例陽性樣本ROX及HEX通道擴增曲線

2.2 可疑結(jié)果處理 1844例樣本共進行了59批次實驗,在第50批次實驗中有1例患者首次取樣結(jié)果FAM熒光通道有S型擴增曲線，但 Ct＞40，擴增曲線見圖3，結(jié)果可疑。遂與臨床醫(yī)生溝通后，讓患者留觀隔離，下午重新留取咽拭子及痰液樣本檢測，擴增曲線見圖4，結(jié)果為陰性，最終患者解除隔離。

2.3 質(zhì)控失控處理 在第52批次實驗中陽性質(zhì)控品ROX和FAM通道未出現(xiàn)S型擴增曲線，HEX通道有S型擴增曲線，陽性質(zhì)控品失控，顯示本批次實驗無效，見圖5。將本批次樣本復(fù)測，復(fù)測后陰性、陽性質(zhì)控品在控，樣本結(jié)果為陰性，見圖6。

圖3 FAM通道有擴增的疑似樣本擴增曲線（典型S型擴增曲線為陽性質(zhì)控品）

圖4 重留咽拭子及痰液復(fù)測擴增曲線（S型曲線為陽性質(zhì)控品）

圖5 陽性質(zhì)控品ROX和FAM通道無S型擴增曲線

圖6 復(fù)測后陽性質(zhì)控品及樣本結(jié)果

3 討論

實時熒光定量PCR被廣泛用于各種病原體的核酸檢測，具有敏感性高、特異性好等特點。一個月內(nèi),我院采用實時熒光定量RT-PCR方法完成了1844例樣本的篩查，檢測出2例陽性樣本，且經(jīng)市疾控復(fù)核亦為陽性。2名核酸陽性患者在第一時間轉(zhuǎn)入了我市定點治療醫(yī)院，避免了擴大感染。核酸檢測的開展，為大范圍的核酸篩查提供了便利，大大緩解了市疾控的檢測壓力,有效的縮短了就診患者檢測等候時間,實現(xiàn)了在接診6小時內(nèi)出具核酸檢測報告。

通過共59批次試驗的檢測實踐，在核酸檢測的質(zhì)量控制及生物安全防護方面,我們也積累了以下經(jīng)驗。在第50批次實驗中有1例患者在首次取樣結(jié)果中FAM熒光通道有S型擴增曲線,但 Ct＞40，我們立即與臨床溝通,將患者暫時作為疑似病例處理，進行留觀隔離，重新采集咽拭子及痰標本進行復(fù)測，復(fù)測結(jié)果陰性，患者解除隔離。鑒于防疫工作的重要性,我們不放過任何一個可疑的結(jié)果,在不確定的情況下，建議對患者采取相應(yīng)的隔離、監(jiān)管措施。同時我們也對檢測結(jié)果負責，對有疑問的樣本使用不同廠家試劑或不同類型樣本進行復(fù)核。在第52批次實驗時,陽性質(zhì)控品ROX和FA M通道未出現(xiàn)S型擴增曲線，HEX通道有S型擴增曲線,顯示此次實驗無效。我們立即分析原因，最后發(fā)現(xiàn)是因為使用了前1天未使用完的反應(yīng)液,反應(yīng)液失效導(dǎo)致陽性質(zhì)控品ROX和FAM通道未出現(xiàn)S型擴增曲線。遂將該批次樣本復(fù)測，復(fù)測后，陰、陽性質(zhì)控品均在控，樣本檢測結(jié)果核酸陰性。此次失敗提示我們反應(yīng)體系必須現(xiàn)配現(xiàn)用。

近期有媒體報道連續(xù)多次核酸檢測才檢出陽性的病例，對核酸檢測的結(jié)果提出質(zhì)疑。通過閱讀文獻,我們知道核酸檢測結(jié)果與患者病程發(fā)展及用藥情況、采樣情況、樣本運輸和保存、檢驗技術(shù)方法等因素相關(guān)[8]。采樣部位不同，樣本病毒含量不同；不同病毒采樣管內(nèi)保存液體積、成分不同，直接影響核酸的提取效率；實驗操作人員的技能，檢測方法、儀器的靈敏度等也會影響新冠核酸的檢出率。當出現(xiàn)可疑結(jié)果時，我們首先從以上方面尋找原因，再及時與臨床的醫(yī)生溝通，結(jié)合患者臨床情況,選擇不同的樣本或者采用不同試劑和方法進行復(fù)核。

新冠核酸檢測須在三級生物安全實驗室或者二級生物安全實驗室加三級生物安全個人防護下開展。每批次實驗由兩人完成，在穿戴防護用品時可幫助檢查，確保安全有效。在結(jié)束核酸檢測工作后，對進行新冠檢測操作的安全柜、臺面及實驗室環(huán)境進行有效的消毒;同時嚴格按照要求進行防護裝備的脫卸，注意盡量避免碰到污染面，且脫卸的每一步后均應(yīng)有手消毒，防護服、醫(yī)用帽及醫(yī)用口罩等一次性物品不能重復(fù)時候用,全部脫卸完成后,進行手衛(wèi)生及消毒。進行嚴格分區(qū)的實驗室，可在清潔區(qū)或緩沖區(qū)進行三級生物防護品的穿戴，在緩沖區(qū)進行帽子和口罩的脫卸，再進行手衛(wèi)生及消毒。核酸檢測過程中產(chǎn)生的垃圾，均應(yīng)進行高壓滅菌后才能沿一般醫(yī)療廢物通道移出實驗室。

綜上,嚴格的質(zhì)量控制和有效的生物安全防護保證了新冠核酸檢測安全高效的開展,及時準確的檢測結(jié)果為新冠肺炎的早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療提供精準依據(jù)。