不同方法對羊水細胞培養(yǎng)成功率的影響

胡惠彬

羊水細胞培養(yǎng)為胎兒染色體核型檢查的重要手段，適用人群包括高齡妊娠（35歲以上）、唐氏篩查高風險、夫妻一方為染色體異常攜帶者、產(chǎn)前B超檢查懷疑胎兒染色體異常、近親結婚和有異常胎兒生育史、反復流產(chǎn)史、先天疾患家屬史（血友病、白血?。┑脑袐D，一般于妊娠的16～22周開展此項操作［1］。然而，該檢查屬于損傷性取樣技術，對孕婦及胎兒均會帶來一定的潛在風險，甚至引發(fā)流產(chǎn)，并且對操作人員技術要求高、影響因素多，培養(yǎng)失敗后難以再次進行，所以降低羊水細胞培養(yǎng)的失敗率成為當務之急。本研究對羊水細胞培養(yǎng)的成功率和染色體分裂相的質量予以分析，現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 研究對象 選擇2019年1 —10月在本院進行胎兒染色體核型檢查的404例孕婦作為研究對象，年齡18～46歲，平均（34.44±1.06）歲；孕周16～24周，平均（20.20±0.25）周。

1.1.1 納入標準 ① 體溫正常，無發(fā)熱者；② 檢查前無胎盤早期剝離、腹部感染化膿者。

1.1.2 排除標準 ① 妊娠時間＜16周或＞24周者；② 具有先兆流產(chǎn)征象者。

1.1.3 倫理學 本研究符合醫(yī)學倫理學標準，經(jīng)本單位倫理審批（審批號：永倫評〔2019〕8號），所有對患者的檢測均獲得過患者或家屬的知情同意。

1.2 檢查方法

1.2.1 樣本采集 囑所有孕婦排空膀胱之后取仰臥位，使用碘伏對其腹部皮膚組織進行消毒，消毒范圍以穿刺點為中心，消毒半徑≥15 cm。常規(guī)消毒鋪巾后，以7號無菌腰穿針沿垂直方向刺入腹部，進入羊膜腔后若突然感到抵抗組織消失，形成落空感后停止刺入，拔出針芯并利用注射器抽取30 mL羊水，分別置于2支離心試管中。

1.2.2 細胞培養(yǎng) 將采集的細胞樣本以1 500 r/min（離心半徑為9 cm）離心10 min，棄除上清液之后，采集1 mL羊水和沉淀細胞，加入5 mL pH 5.0～6.8的羊水培養(yǎng)基（廣州白云山試劑公司提供），輕輕吹打以促使二者充分混勻并形成細胞懸液，轉移至25 mL無菌培養(yǎng)瓶，于37 ℃溫箱中培養(yǎng)7～10 d，發(fā)現(xiàn)有大量成纖維樣或上皮樣細胞生長后更換培養(yǎng)液，1支試管采用原代培養(yǎng)法，另1支采用傳代培養(yǎng)法［2］。原代培養(yǎng)試管適時收獲，而傳代培養(yǎng)試管經(jīng)過吹打促使沉淀細胞與培養(yǎng)液充分混勻后再次置于溫箱中培養(yǎng)72 h，待羊水細胞克隆后收獲。

1.2.3 細胞收獲及染色觀察 收獲時采用秋水仙堿處理并利用1：1的檸檬酸鈉與氯化鉀進行低滲處理，5 min后加入固定液，預固定1 min，以1 500 r/min（離心半徑為9 cm）離心10 min，去除上清液并固定0.5 h后原轉速離心，重復2次后進行滴片烤片處理［3］。將滴片置于電熱干燥箱中烘烤3 h，溫度設定為75 ℃。取出后利用胰酶消化1.5 min左右，進行吉姆薩染色，持續(xù)10 min后閱片核對,通過細胞計數(shù)分析，若制作羊水細胞標本玻片中的染色體可供分析的核型數(shù)量能夠達到國家細胞遺傳學產(chǎn)前診斷技術標準所要求的分析數(shù)量，即達到100個可計數(shù)核型以上，可確定為羊水細胞培養(yǎng)成功［4］。

1.3 觀察指標 選取羊水細胞培養(yǎng)的成功率、失敗率、羊水染色體分裂相質量作為觀察指標。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 17.0軟件處理數(shù)據(jù)，計量資料以均數(shù)±標準差表示，組間比較采用t檢驗，計數(shù)資料以例（率）表示，組間比較采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 兩種羊水細胞培養(yǎng)法成功率和失敗率比較 采用傳代培養(yǎng)法的羊水細胞培養(yǎng)成功率明顯高于原代培養(yǎng)法，而失敗率明顯低于后者，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。見表1。

表1 兩種羊水細胞培養(yǎng)法成功率和失敗率比較

2.2 兩種羊水細胞培養(yǎng)法所得羊水染色體分裂相比較 采用傳代培養(yǎng)法獲得的羊水染色體分裂相出現(xiàn)數(shù)、可計數(shù)、可分析數(shù)均明顯高于原代培養(yǎng)法，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。見表2。

表2 兩種羊水細胞培養(yǎng)法羊水染色體分裂相比較（

表2 兩種羊水細胞培養(yǎng)法羊水染色體分裂相比較（

培養(yǎng)方法 例數(shù)（例）出現(xiàn)數(shù)（個） 可計數(shù)（個）可分析數(shù)（個）傳代培養(yǎng)法 404 92.85±1.15 53.78±1.22 27.34±1.06原代培養(yǎng)法 404 50.94±1.20 30.30±1.25 14.55±1.05 t值 8.894 8.477 8.453 P值 0.000 0.017 0.021

3 討論

受有害化學物質、X線照射、環(huán)境、高齡妊娠等因素的影響，妊娠時染色體變異所引發(fā)的疾?。ㄈ缣剖暇C合征、愛德華氏綜合征、帕陶綜合征、先天性睪丸發(fā)育不全綜合征、克氏綜合征、特納綜合征、超雌綜合征和超雄綜合征等）發(fā)病率隨之提高［5］。而染色體變異會給胎兒發(fā)育帶來嚴重影響，所以產(chǎn)前診斷并及時予以干預尤為重要。羊水細胞培養(yǎng)是檢查染色體異常最有效的手段，也是產(chǎn)前診斷的重要組成部分。由于羊水細胞為胎兒發(fā)育過程中衰老及固縮的脫落細胞，相較于其他細胞而言培養(yǎng)難度更高，使得羊水細胞培養(yǎng)失敗率高，一旦失敗難以進行二次檢查，所以提高羊水細胞培養(yǎng)成功率成為困擾臨床的一個棘手問題。

目前羊水細胞培養(yǎng)多采用原代培養(yǎng)法，盡管其操作簡便、操作所致的污染也能得到有效控制，但受限于羊水細胞生長狀況的影響，往往需要數(shù)個批次收獲才能夠完成檢查，且失敗率相對較高，逐漸無法滿足此項檢查的需求。傳代培養(yǎng)法則是在原有羊水細胞培養(yǎng)基礎上作出的改良，通過細胞傳代來獲得更多的分裂相，便于觀察和計數(shù)，能達到細胞遺傳學產(chǎn)前診斷技術標準要求的必須計數(shù)2個以上獨立培養(yǎng)的培養(yǎng)甁中平均分布的20個細胞數(shù)，分析5個細胞的量，而且還能達到出現(xiàn)嵌合體時需要計數(shù)細胞的高強度額外工作的數(shù)量，對于提高羊水細胞培養(yǎng)成功率而言具有重要意義。

本研究采用傳代培養(yǎng)法的羊水細胞培養(yǎng)成功率為100.00%，明顯高于原代培養(yǎng)法的96.04%，而失敗率為0，明顯低于后者的3.96%，差異均有統(tǒng)計學意義。在獲得的羊水染色體分裂相比較中傳代培養(yǎng)法無論是出現(xiàn)數(shù)、可計數(shù)還是可分析數(shù)均高于原代培養(yǎng)法，差異均有統(tǒng)計學意義，此結果提示，在羊水細胞培養(yǎng)中傳代培養(yǎng)法可提高成功率以及羊水染色體分裂相檢測效果，降低失敗率。此外，本研究亦對失敗的羊水細胞培養(yǎng)標本進行了分析并總結經(jīng)驗如下：染色體分裂相數(shù)量直接決定了羊水細胞培養(yǎng)的成功與失敗。傳代培養(yǎng)法通過更換培養(yǎng)液以促使羊水細胞重新貼壁并更有利于生長，大幅提高了分裂相的數(shù)量及質量，而原代培養(yǎng)法雖然省去了傳代步驟，但因各種原因導致細胞貼壁生長數(shù)少，如：① 正常抽取羊水的時間為孕周16～22周，孕周太少或太大都會引起培養(yǎng)貼壁細胞少；② 高齡妊娠導致培養(yǎng)細胞少，可能跟自身抗體對外界感染產(chǎn)生變應原增多有關；③ 血性羊水也會影響細胞貼壁生長等。這些因素都會導致收獲細胞數(shù)過少，不利于核型分析，又因原代培養(yǎng)羊水細胞成熟時間存在不同程度的滯后性，使得其活性存在明顯差異，影響了分裂相數(shù)量，從而增加了羊水細胞培養(yǎng)的失敗率［6］。

綜上所述，采用傳代培養(yǎng)法的羊水細胞培養(yǎng)成功率更高，且能收獲到更多可供分析的羊水染色體核型，值得在臨床檢驗工作中推廣使用。

利益沖突 作者聲明不存在利益沖突