林玉蘭,許立萍,孔祥臣
(1.焦作煤業(yè)(集團)有限責任公司中央醫(yī)院一分院內(nèi)二科;2.焦作煤業(yè)(集團)有限責任公司中央醫(yī)院呼吸二科,河南 焦作454000)
有數(shù)據(jù)顯示,肺癌5年生存率≤15%,且80%肺癌患者為非小細胞肺癌 (non-small cell lung cancer,NSCLC),同時由于NSCLC早期癥狀不具有典型性,導致≥50%肺癌患者確診時已處于局部進展或遠處轉(zhuǎn)移時期[1]。臨床早期篩查NSCLC的主要方式為電子計算機斷層掃描(CT)檢查及胸部,而CT檢查雖準確度較高,但其費用昂貴,輻射較強,患者難以接受;胸片檢查敏感性、準確性較低,難以達到臨床預(yù)期效果。近年來由于影像學檢查敏感性較低,造成NSCLC病死率升高≥5%,因此提高晚期NSCLC診斷敏感性,有助于完全切除腫瘤病灶,改善患者5年生存率,挽救患者生命[2]。有學者指出,血清癌胚抗原(CEA)、糖類抗原199(CA 199)、糖類抗原 125(CA125)水平在早期及中晚期NSCLC診斷中雖具有一定診斷價值,但其漏診率仍高達29%[3]。循環(huán)腫瘤細胞(circulating tumor cell,CTC)與腫瘤血行轉(zhuǎn)移與腫瘤復發(fā)存在緊密聯(lián)系。本研究選取84例經(jīng)病理結(jié)果確診為晚期NSCLC患者,通過分析對比,觀察CTC聯(lián)合血清CE A、CA199、CA125水平檢測的臨床診斷效能?,F(xiàn)報告如下。
1.1 一般資料 選取2016年10月-2018年7月我院53例經(jīng)病理結(jié)果確診為晚期NSCLC患者為NSCLC組,31例肺部良性病變患者為肺部良性病變組,并選取56例同期健康體檢者為健康對照組。其中NSCLC組男32例,女21例,年齡45~75歲,平均年齡(60.15±7.04)歲,29 例腺癌,24 例鱗狀細胞癌,臨床分期:35例III B期,18例IV期;肺部良性病變組男19例,男12例,年齡46~76歲,平均年齡(59.98±6.92)歲,其中 4 例肺炎、8 例肺結(jié)核、10例支氣管擴張、4例肺纖維化、5例結(jié)核性胸膜炎。健康對照組男30例,女26例,年齡44~77歲,平均年齡(60.07±6.98)歲。 3 組基本資料(年齡)均衡可比(P>0.05)。本研究符合《世界醫(yī)學協(xié)會赫爾辛基宣言》相關(guān)要求。
1.2 選取標準 ⑴納入標準:患者及家屬知情并簽署同意書;NSCLC組均經(jīng)CT、磁共振成像(MRI)等檢查確診為NSCLC,均處于III B~IV期;⑵排除標準:合并心肝腎等嚴重功能不全;伴有其他惡性腫瘤;伴有凝血功能異常;合并自身免疫系統(tǒng)疾??;嚴重精神疾病或認知障礙。
1.3 方法
1.3.1 CTC檢測具體步驟如下 ⑴主要試劑:人淋巴細胞分離液(上海江林生物科技有限公司提供)、小鼠抗人細胞角蛋白單克隆抗體 (北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院提供)、4,6-二脒基-2苯基吲哚(購自上海譜振生物科技有限公司)、異硫氰酸熒光素標記羊抗小鼠IgG(購自北京百奧萊博科技有限公司)。⑵收集標本:消毒后,以真空采血針取穿刺后肘正中7.5ml靜脈血,并加入肝素抗凝混勻,24h后富集腫瘤細胞。⑶富集腫瘤細胞(密度梯度離心法):取抗凝全血(7.5ml)+磷酸鹽緩沖液(PBS,7.5ml)混勻,并以2:1比例加至細胞分離液層面上;在室溫條件下,2000r/min,離心時間持續(xù)20min,另外吸取環(huán)狀乳白色單核細胞層+PBS(5ml)洗滌,重復 2 次,2000r/min 離心 15min。 ⑷染色(免疫熒光法):采用載玻片將單個核細胞懸液均勻涂抹,室溫下靜置30min后,采用多聚甲醛(4%)對抗原進行固定,10min,PBS清洗,持續(xù)5min,重復3次,玻片干燥后統(tǒng)一置于-80℃冰箱進行染色;室溫下采用Triton X-100(0.1%)通透包膜15min,PBS清洗5min,重復3次;將牛血清清蛋白(5%)封閉于37℃室溫下30 min,PBS清洗5min,重復3次;滴加1:100小鼠抗Pan-細胞角蛋白,并置于 4℃條件下12h,PBS清洗 5min,重復3次;滴加1:100 FITC標記羊抗小鼠IgG,室溫條件下孵育2h,PBS清洗5min,重復3次;最后在細胞區(qū)添加DAPI染細胞核(7μl),對玻片加蓋封固,并利用免疫熒光顯微鏡對上述步驟進行觀察與照相。
1.3.2 血清CEA、CA199、CA125水平檢測 采用全自動電化學發(fā)光免疫分析儀 (產(chǎn)自北京西化儀科技有限公司)檢測血清CEA、CA199、CA125水平,嚴格按照儀器說明書操作。
1.4 陽性判定標準 ⑴CTC:長徑10μm;細胞形狀為橢圓形、圓形;經(jīng)光鏡可觀察細胞核及細胞形態(tài)完整;細胞質(zhì)經(jīng)Pan-細胞角蛋白染色被染成黑色或藍色。 ⑵CEA>10U/ml,CA125>35U/ml,CA199>30.9U/ml。
1.5 觀察指標 ⑴比較兩組血清血清CEA、CA199、CA125 水平。 ⑵CTC、CEA、CA199、CA125及四者聯(lián)合檢測結(jié)果。⑶CTC、CEA、CA199、CA125及四者聯(lián)合準確性(ACC)、靈敏性(SEN)、特異性(SPE)、陰性預(yù)測值及陽性預(yù)測值。
1.6 統(tǒng)計學分析 采用SPSS24.0軟件分析數(shù)據(jù),計量資料用(x±s)表示,行 t檢驗,計數(shù)資料用 n(%)表示,行χ2檢驗,P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
2.1 兩組血清CEA、CA199、CA125水平 三組血清CEA、CA199、CA125水平比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);NSCLC 組血清 CEA、CA199、CA125 水平高于肺部良性病變組、健康對照組(P<0.05),見表1。
表1 兩組血清CEA、CA199、CA125水平(x±s)
表2 CTC、CEA、CA199、CA125及四者聯(lián)合檢測結(jié)果
2.2 CTC、CEA、CA199、CA125 及四者聯(lián)合檢測結(jié)果 CTC檢出真陽性38例,真陰性29例,漏診15例,誤診2例;CEA檢出真陽性32例,真陰性28例,漏診21例,誤診3例;CA199檢出真陽性35例,真陰性26例,漏診18例,誤診5例;CA125檢出真陽性30例,真陰性27例,漏診23例,誤診4例;四者聯(lián)合檢出真陽性51例,真陰性25例,漏診2例,誤診6例,見表2。
2.3 CTC、CEA、CA199、CA125 及四者聯(lián)合診斷價值 四者聯(lián)合ACC、SEN、陰性預(yù)測值高于CTC、CE A、CA199、CA125(P<0.05);四者聯(lián)合與 CTC、CEA、CA199、CA125陽性預(yù)測值、SPE無顯著差異(P>0.05),見表 3。
表 3 CTC、CEA、CA199、CA125 及四者聯(lián)合診斷價值 n(%)
有數(shù)據(jù)顯示,每年肺癌死亡人數(shù)約占全國死亡人數(shù)的20%,對患者生命安全造成嚴重威脅[4]。目前臨床診斷晚期NSCLC的手段主要有影像學檢查、血清腫瘤標志物、肺穿刺活檢等,其中血清腫瘤標志物具有創(chuàng)傷小、操作簡單、費用便宜等顯著優(yōu)勢,同時其SEN及ACC較高,可有效用于指導臨床晚期NSCLC診治。杜軍華等[5]研究發(fā)現(xiàn),血清CEA、CA199、CA125水平升高與晚期NSCLC疾病進展生存期有密切聯(lián)系,可有效指導臨床對晚期NSCLC療效及預(yù)后進行評估與判斷。
CEA是一種酸性糖蛋白,屬于腫瘤相關(guān)抗原(非器官特異性),多存在于胃腸道、泌尿道等空腔臟器,而糖蛋白主要成分為肽鏈、糖鏈,多位于組織細胞(巨噬細胞、多核細胞及單核細胞)與末梢血中,是肺癌血清腫瘤標志物之一[6]。趙松林等[7]研究發(fā)現(xiàn)血清CEA是評估晚期的重要敏感指標之一,且其水平過度表達與腫瘤復發(fā)有密切聯(lián)系。本結(jié)果顯示,觀察組血清CEA水平高于健康對照組(P<0.05),且其 SEN 為 60.38%,SPE 為 90.32%。提示血清CEA診斷晚期NSCLC SPE較高,在晚期NSCLC診斷價值較高。
CA125作為高分子糖蛋白,主要由體腔上皮細胞表達,健康者血清CA125水平較低,而組織發(fā)生惡變者血清CA125水平升高[8]。CA125最早主要應(yīng)用于診斷子宮癌與卵巢癌,而近年來相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)惡性腫瘤(其他組織器官)中其水平也會提高,有數(shù)據(jù)顯示≥50%肺癌患者血清CA125水平存在升高現(xiàn)象[9]。王秋波等[10]研究發(fā)現(xiàn),血清CA125半衰期較短,對晚期NSCLC治療效果具有監(jiān)測作用,可顯著反映肺癌近期變化。CA199是一種糖類抗原,屬于低聚糖類粘蛋白,多存在于惡性腫瘤細胞表面、胚胎胃腸粘膜上皮,是臨床診斷胰腺癌及直腸癌的血清腫瘤標志物之一。近年來有學者指出,CA199具有廣譜性抗原,同時其水平在肺癌、卵巢癌等其他惡性腫瘤中也存在升高現(xiàn)象[11]。李嵐等[12]研究認為,血清CA199在NSCLC化療效果評估中具有重要意義。本文結(jié)果顯示,觀察組血清CA1 25、CA199 水平高于健康對照組(P<0.05)。 提示血清CA125、CA199對晚期NSCLC診斷具有指導意義。
NSCLC血行早期轉(zhuǎn)移會導致異常增殖 (腫瘤細胞、相關(guān)腫瘤凋亡細胞)及單核細胞顯著增多,一般認為晚期NSCLC遠處轉(zhuǎn)移的必備條件是血清中相關(guān)腫瘤細胞出現(xiàn)表達異常[13]。范凡等[14]研究發(fā)現(xiàn),CTC與惡性腫瘤(乳腺癌等)的遠處轉(zhuǎn)移密切相關(guān),可有效用于輔助盡早發(fā)現(xiàn)腫瘤微轉(zhuǎn)移及復發(fā)。另外王漢萍等[15]研究還發(fā)現(xiàn),CTC檢測可確定相關(guān)基因突變類型,為晚期NSCLC治療策略提供科學依據(jù)。此外費小東[16]研究顯示CTC聯(lián)合多種腫瘤標志物診斷晚期NSCLC,可有效提高晚期NSCLC診斷鑒別效果。本文結(jié)果顯示,四者聯(lián)合ACC、SEN、 陰性預(yù)測值高于 CTC、CEA、CA199、CA125(P<0.05),且陽性預(yù)測值、SPE 無顯著差異(P>0.05)。提示四者聯(lián)合診斷晚期NSCLC,可有效提高ACC及SEN,優(yōu)化診斷效果。
綜上所述,CTC聯(lián)合血清CEA、CA199、CA125水平檢測晚期NSCLC ACC及SEN較高,可為臨床選擇治療方案與判斷預(yù)后提供科學依據(jù)。