基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討三葉糖脂清治療2型糖尿病的作用機制*

晏一淇 ，黃 明 ，于亞君 ，李 霖 ，胡 珍 ，韓國英 ，張 晗

（1．天津中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院，天津 301617；2．天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，天津 300381）

糖尿病是一種以血漿葡萄糖水平升高為特征的內(nèi)分泌代謝紊亂疾病，是臨床常見的慢性病[1]。2017年全球約有4．25億糖尿病患者，中國約有1．18億，占全球27%，居全球首位[2]。糖尿病人群中約90%的患者為2型糖尿?。═2DM）[3]。T2DM是由胰島素調(diào)控葡萄糖代謝能力下降并伴隨胰島β細(xì)胞功能缺陷所導(dǎo)致的胰島素分泌減少而引起的脂肪、碳水化合物和蛋白質(zhì)代謝異常，以血糖異常為主要特征的內(nèi)分泌代謝性疾病[4]。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為T2DM屬“消渴病”范疇，其基本病機為虛、瘀、痰、濁互結(jié)，其中瘀、痰、濁均屬內(nèi)生之毒，內(nèi)生之毒郁而化熱，造成熱毒郁結(jié)、耗傷[5]。三葉糖脂清來源于臨床經(jīng)驗方，由桑葉、荷葉、丹參、赤芍和山楂葉5味中藥組成，具有升清降濁，化痰除痞的功效[6]。研究表明糖脂清可以治療T2DM[7]。但目前對三葉糖脂清治療T2DM的主要有效成分、作用靶點和機制尚未明確。

本研究整合已發(fā)現(xiàn)的三葉糖脂清的化學(xué)成分，基于計算機和生物信息技術(shù)，篩選三葉糖脂清的活性成分，構(gòu)建三葉糖脂清的“多成分-多靶點-多途徑”的網(wǎng)絡(luò)模型，探索三葉糖脂清影響T2DM的潛在基因與相關(guān)信號通路，為揭示其治療T2DM的物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機制提供了預(yù)測信息。

1 方法

1.1 篩選三葉糖脂清活性成分 借助中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺（TCMSP）運用藥物動力學(xué)參數(shù)篩選算法分析，分別篩選三葉糖脂清中5味中藥符合ADME條件的所有化學(xué)成分，即為三葉糖脂清的活性成分。TCMSP由中國藥典注冊的499種中藥組成，含有29 384種成分，3 311個靶點和837種相關(guān)疾病，并對每個化合物提供了較全面的用于藥物篩選和評價的藥代動力學(xué)性質(zhì)相關(guān)數(shù)據(jù)，主要有口服生物利用度（OB）、小腸上皮通透性（Caco-2）、類藥性（DL）、血腦屏障通透性（BBB）、藥物半衰期（HL）、溶解度和藥物成藥五原則等[8]。OB指的是藥物的有效成分或活性基團(tuán)被吸收到達(dá)體循環(huán)的速度與程度；DL指藥物包含一些特定的功能基團(tuán)或者具有與大多數(shù)藥物相同或相似的物理特征；BBB指的是藥物成分可透過血腦屏障的能力。這3個參數(shù)是藥物動力學(xué)篩選過程中的常用參數(shù)。本文設(shè)置篩選符合（OB≥30%、DL≥0．18、BBB≥-0．3）的化合物作為三葉糖脂清的活性成分。

1.2 預(yù)測三葉糖脂清相關(guān)靶點 得到三葉糖脂清的活性成分之后，繼續(xù)在TCMSP中“Related Targets”下預(yù)測各個化合物成分所對應(yīng)的靶點信息。部分活性成分未能搜集到對應(yīng)靶點信息。再使用Perl語言結(jié)合uniprot數(shù)據(jù)庫后臺對應(yīng)信息，將三葉糖脂清靶點名稱轉(zhuǎn)換為標(biāo)準(zhǔn)基因名。

1.3 預(yù)測T2DM相關(guān)靶點 在HPO數(shù)據(jù)庫和Genecard數(shù)據(jù)庫中以“T2DM”為檢索詞，連接數(shù)據(jù)庫后臺文獻(xiàn)數(shù)據(jù)，獲取T2DM的相關(guān)靶點，并用R語言“VennDiagram”程序包與三葉糖脂清相關(guān)靶點進(jìn)行交叉對比得到重疊靶點。

1.4 構(gòu)建三葉糖脂清活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò) 通過上文方法可獲取三葉糖脂清的活性成分與重疊靶點。由于活性成分與靶點具有對應(yīng)關(guān)系，使用Cytoscape 3．7．1軟件，可繪制出三葉糖脂清活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖。

1.5 構(gòu)建三葉糖脂清-T2DM重疊靶點蛋白互作網(wǎng)絡(luò)（PPI） 將重疊靶點信息輸入STRING數(shù)據(jù)分析平臺，利用靶點之間作用關(guān)系的強弱構(gòu)建三葉糖脂清PPI。將PPI網(wǎng)絡(luò)信息以“TSV”格式導(dǎo)入Cytoscape 3．7．1中，對其進(jìn)行互作網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治?，進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)可視化處理并使用R語言進(jìn)行統(tǒng)計，明確關(guān)鍵靶點。

1.6 京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析與基因功能分析（GO） 使用Perl語言結(jié)合DAVID生物信息數(shù)據(jù)庫將重疊靶點名稱全部轉(zhuǎn)換為Entrez Gene ID，以供后續(xù)操作使用；使用R軟件安裝“colorspace”和“string”安裝包，下載 R 語言的Bioconducor生物類程序包，如“DOSE”“clusterProfiler”和“pathview”。輸入轉(zhuǎn)換好的重疊靶點Entrez Gene ID，并運行R語言腳本進(jìn)行KEGG通路富集分析和GO功能分析。

2 結(jié)果

2.1 活性化合物的篩選 根據(jù) DL≥0．18、OB≥30%、BBB≥-0．3的原則，運用TCMSP檢索到三葉糖脂清中活性化合物80個。見表1。

2.2 三葉糖脂清活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)共包括90個節(jié)點（node），見圖1。圖中紅色節(jié)點代表化合物分子，共58個。綠色節(jié)點代表藥物與疾病的重疊靶點，共30個。在網(wǎng)絡(luò)分析中，節(jié)點的度數(shù)大小表示節(jié)點在網(wǎng)絡(luò)中的重要程度。根據(jù)拓?fù)鋵W(xué)性質(zhì)篩選出度值較大的節(jié)點進(jìn)行分析。在活性化合物中，β-谷甾醇和豆甾醇的網(wǎng)絡(luò)度數(shù)較高。在之前的研究中已有文獻(xiàn)報道β-谷甾醇和豆甾醇具有明顯的降糖作用[9-10]。

2.3 PPI的構(gòu)建 在HPO數(shù)據(jù)庫和Genecard數(shù)據(jù)庫中檢索“Type 2 Diabete mellitus”，其中在 Genecard數(shù)據(jù)庫中選取score值大于30的靶點。2個數(shù)據(jù)庫共得到540個疾病靶點。與三葉糖脂清82個相關(guān)靶點重疊對比，得到30個重疊靶點信息，如圖2A所示。對重疊靶點進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，并根據(jù)拓?fù)浞治鼋y(tǒng)計連接度較高的靶點。圖2B中，各個節(jié)點的顏色代表對應(yīng)靶點的Degree值，顏色越趨近紅色表示Degree值越高，越趨近綠色表示Degree值越低。圖2C中對所有重疊靶點Degree值top20進(jìn)行排序，由圖可知白蛋白（ALB）、血管內(nèi)皮生長因子A（VEGFA）、胱天蛋白酶-3（CASP-3）的 Degree值較高，可能是三葉糖脂清影響T2DM時的潛在靶點。

2.4 KEGG富集分析 利用Perl語言將重疊的30個基因名稱轉(zhuǎn)換為Entrez Gene ID，使用R包的Bioconductor運算并導(dǎo)出KEGG通路富集篩選得到52條通路（P≤0．05），選擇前20條通路信息繪制成圖。涉及多種細(xì)胞凋亡、結(jié)腸癌和甲狀腺激素等信號通路。見圖3，顏色越趨近紅色表示相關(guān)性越高。

2.5 GO富集 利用Perl語言將重疊的30個基因名稱轉(zhuǎn)換為Entrez Gene ID，使用R包的Bioconductor運算導(dǎo)出GO功能富集858條（P≤0．05），其中生物學(xué)進(jìn)程（BP）共 776條、細(xì)胞組成（CC）25條和分子功能（MF）57條。分別選取前10條信息繪制成圖。見圖4。

3 討論

本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法初步探索三葉糖脂清治療T2DM的作用機制，從化合物-靶點圖可知，三葉糖脂清中有80個活性化合物，活性成分對應(yīng)有82個靶點，說明三葉糖脂清發(fā)揮藥效具有多成分、多靶點的作用特點。

在三葉糖脂清的活性成分中，連接靶點數(shù)目最多的是β-谷甾醇和豆甾醇2個甾醇類化合物。藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，β-谷甾醇能提高細(xì)胞中的酶和非酶抗氧化劑，使其具有有效的抗糖尿病、神經(jīng)保護(hù)和化學(xué)保護(hù)作用[11]。在其他實驗中能使高脂喂養(yǎng)的T2DM大鼠胰島素水平恢復(fù)到正常水平[12]。豆甾醇是結(jié)構(gòu)類似于膽固醇的植物甾醇，廣泛存在于動植物中，在人體內(nèi)可通過影響低密度脂蛋白來影響健康狀況[13]。以往研究發(fā)現(xiàn)于豆甾醇具有抗氧化、降血糖和抑制甲狀腺的作用[14]。

表1 三葉糖脂清中活性化合物的基本信息Tab.1 Basic information of active compounds in Sanye Tangzhiqing Tablet

圖1 三葉糖脂清化合物-重疊靶點網(wǎng)絡(luò)圖Fig.1 Compound-overlapping targets network in Sanye Tangzhiqing Tablet

在活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)中發(fā)現(xiàn)ALB、VEGFA、CASP-3的關(guān)聯(lián)度較高。其中ALB是判定T2DM的重要指標(biāo)，在T2DM患者體內(nèi)，ALB的含量均較高[15]。血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）是一種肝素結(jié)合的同二聚體糖蛋白，在生理和病理條件下調(diào)節(jié)血管生成和血管通透性，VEGFA基因編碼VEGF，位于6號染色體上，影響VEGF正常分泌，對T2DM及并發(fā)癥有明顯作用[16]。研究發(fā)現(xiàn)，在糖尿病大鼠的心肌細(xì)胞中CASP-3的水平比正常組水平高，高血糖誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激激活線粒體細(xì)胞色素C介導(dǎo)的CASP-3通路，從而誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡是糖尿病早期的主要細(xì)胞反應(yīng)[17]。本研究得到540個T2DM靶點，在與三葉糖脂清相關(guān)靶點重疊對比之后得到30個重疊靶點，可認(rèn)為是三葉糖脂清對T2DM起影響作用的潛在靶點。將30個重疊靶點通過KEGG通路富集，發(fā)現(xiàn)與T2DM相關(guān)的生物途徑較多，富集在結(jié)腸癌、多種生物凋亡、丙型肝炎和甲狀腺激素信號通路等途徑上的相關(guān)性較高。T2DM患者易罹患結(jié)直腸癌，若接受胰島素治療，則不僅結(jié)直腸癌發(fā)病率更高，且腫瘤進(jìn)展更加迅速。高胰島素血癥假說認(rèn)為，異常增高的胰島素及游離胰島素樣生長因子-1水平可促進(jìn)結(jié)腸細(xì)胞增殖，最終導(dǎo)致結(jié)直腸癌的發(fā)生[18]。T2DM起病時以胰島素抵抗為特征。持續(xù)的胰島素抵抗導(dǎo)致胰腺β細(xì)胞功能障礙，在極端情況下導(dǎo)致β細(xì)胞凋亡[19]。研究表明乙型肝炎病毒（HBV）/丙型肝炎病毒（HCV）共感染與血糖水平顯著相關(guān)。HBV/HCV共感染的參與者中有相當(dāng)比例患上了T2DM。雖然HBV和HCV雙重陽性感染的確切機制尚不清楚，但越來越多的證據(jù)表明HBV和HCV雙重感染與T2DM的發(fā)展密切相關(guān)[20]；研究表明，甲狀腺激素可改善糖尿病大鼠的胰島素敏感性，并作為神經(jīng)系統(tǒng)可塑性改變行為和認(rèn)知功能的介質(zhì)[21]。

圖2 PPI的構(gòu)建Fig.2 Construction of PPI

圖3 三葉糖脂清與T2DM重疊靶點KEGG富集分析Fig.3 Enrichment analysis of KEGG on the overlapping target of Sanye Tangzhiqing Tablet and T2DM

圖4 三葉糖脂清與T2DM重疊靶點GO功能富集Fig.4 GO functional enrichment of overlapping target of Sanye Tangzhiqing Tablet and T2DM

在GO功能富集中，發(fā)現(xiàn)重疊的76個靶點富集在1 068個BP、64個CC和111個MF上。將3個功能方面各取前10條信息繪制成圖。76個重疊靶點在BP中富集在六大類，分別為神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)展、膽固醇代謝、對脂多糖反應(yīng)、細(xì)胞凋亡執(zhí)行、血管生成和對轉(zhuǎn)錄的調(diào)控。

CC中突觸后膜突觸膜的整體成分和突觸后膜的組成成分關(guān)聯(lián)較高；在MF中富集在類固醇結(jié)合、核受體活性和調(diào)節(jié)特異DNA結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子活性中較多。

4 結(jié)論

綜上所述，本文運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對三葉糖脂清的活性成分、作用靶點進(jìn)行了篩選并對影響T2DM的作用途徑進(jìn)行了初步探究。根據(jù)網(wǎng)絡(luò)篩選情況分析可知，在三葉糖脂清80個活性成分中隱丹參酮、花生四希酸、黃芩素、β-胡蘿卜素、β-谷甾醇、丹參酮ⅡA、丹參酚醌、異丹參酮Ⅱ、鳶尾甲黃素和 丹 參 酮 Ⅵ 可 以 作 用 在 CCND1、CYCS、BCL2、GSK3β、CASP3、CTNNB1 和 ESR1 靶點從而激活結(jié)腸癌相關(guān)通路與甲狀腺激素信號通路，對T2DM的病程產(chǎn)生影響。從結(jié)果中可以看出三葉糖脂清影響T2DM是通過多成分、多靶點、多途徑的協(xié)同合作模式來發(fā)揮作用的。課題組后期將圍繞物質(zhì)基礎(chǔ)-藥效學(xué)評價-通路驗證等方面開展實驗研究，為三葉糖脂清影響T2DM以及后期的藥物研究提供理論基礎(chǔ)和實驗數(shù)據(jù)。