泡菜自然發(fā)酵中乳酸菌的分離鑒定及生物學(xué)特性的研究

戚家莉，王海潮

（1.安徽省壽縣第一中學(xué)，安徽 壽縣 232200；2.宿州學(xué)院 生物與食品工程學(xué)院，安徽 宿州 234000）

泡菜能為人體提供所需的多種營(yíng)養(yǎng)元素，其水分、碳水化合物、維生素、鈣、鐵、磷等[1-2]，泡菜富含0.4%～8.0%乳酸，經(jīng)過(guò)乳酸菌的發(fā)酵，蔬菜的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)不僅沒(méi)有被破壞，而且乳酸菌利用原料中可溶性物質(zhì)代謝產(chǎn)生大量的乙酸、乳酸和多種氨基酸、酶、維生素等，提高了發(fā)酵蔬菜的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[3-5]。泡菜具有保持腸道保健和消炎殺菌的功能，從泡菜中分離的乳酸菌含量很高，乳酸菌是參與調(diào)節(jié)人體腸道微生態(tài)平衡的主要菌系[6-7]。泡菜中的乳酸菌菌體及其代謝產(chǎn)生的維生素和有機(jī)酸對(duì)人體有多種功能，可幫助消化，促進(jìn)胃腸道蠕動(dòng)，代謝產(chǎn)物有機(jī)酸可使腸道內(nèi)的滲透壓增高，水分分泌亢進(jìn)，糞便中水分增高而緩解便秘[8]；乳酸菌產(chǎn)生的有機(jī)酸對(duì)食品中微生物也具有較好的抑制作用。此外，泡菜中的乳酸菌有降低膽固醇、提高免疫力的功效[9-11]。

我國(guó)是蔬菜生產(chǎn)大國(guó)，蔬菜品種、人均消費(fèi)和出口均居世界前列，每年的蔬菜產(chǎn)量為數(shù)億噸，而發(fā)酵泡菜是蔬菜深加工的一種重要形式，目前國(guó)內(nèi)外泡菜的加工工藝研究的熱點(diǎn)主要集中在接種和發(fā)酵這個(gè)環(huán)節(jié)上，如發(fā)酵工藝條件的優(yōu)化、乳酸菌菌種的選擇等，直接影響著泡菜加工后的口感、色澤、滋味等品質(zhì)及產(chǎn)品產(chǎn)量，是當(dāng)今泡菜加工研究的熱點(diǎn)[12-14]，而對(duì)自然發(fā)酵研究較少。傳統(tǒng)自然發(fā)酵法是在一定的溫度下將新鮮的蔬菜加入適當(dāng)食鹽及其他輔料，利用原料中原有的酶及所處環(huán)境內(nèi)乳酸菌、耐酸性酵母等微生物進(jìn)行發(fā)酵而制得最終發(fā)酵產(chǎn)品，最典型的產(chǎn)品就是泡菜。

試驗(yàn)以白貝自然發(fā)酵黃瓜、蘿卜、胡蘿卜等為原料進(jìn)行自然發(fā)酵制作泡菜，從中分離得到性能優(yōu)良的乳酸菌，并通過(guò)生理生化試驗(yàn)，對(duì)分離得到的乳酸菌進(jìn)行鑒定，并對(duì)其生物學(xué)特性進(jìn)行分析，為提高發(fā)酵泡菜的品質(zhì)及其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值奠定一定的基礎(chǔ)。

1 試驗(yàn)部分

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 材料

黃瓜、蘿卜、胡蘿卜、食鹽，均為市售。

1.1.2 儀器

YP202N型電子天平，上海精密科技儀器有限公司產(chǎn)品；電子萬(wàn)用爐，天津市泰斯特儀器有限公司產(chǎn)品；GI54DWS型高壓滅菌箱，致微（廈門(mén)） 儀器有限公司產(chǎn)品；SHP-250型生化培養(yǎng)箱，上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；SW-CJ-IFD型超凈工作臺(tái)，蘇凈集團(tuán)安泰公司產(chǎn)品；DHG-9053A型恒溫干燥箱，上海一恒科技有限公司產(chǎn)品；泡菜壇、燒杯、玻璃棒、三角燒瓶、試管、培養(yǎng)皿、接種環(huán)、接種針、顯微鏡、酒精燈、載玻片、香柏油、膠頭滴管、移液管、洗耳球、玻璃涂布器、稱(chēng)量紙、pH試紙、脫脂棉、紗布、牛皮紙、細(xì)繩子、濾紙等。

1.1.3 試劑

牛肉膏、蛋白胨、氯化鈉、瓊脂粉、葡萄糖、甲基紅、95%乙醇、磷酸氫二鉀、磷酸二氫銨、硫酸鎂、檸檬酸鈉、溴香草酚藍(lán)乙醇液、硫代硫酸鈉、醋酸鉛、30%過(guò)氧化氫、對(duì)二甲基氨基苯甲醛、濃鹽酸、乙醚、氫氧化鉀、草酸銨、結(jié)晶紫、碘片、碘化鉀、蕃紅、明膠等。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 泡菜的制作

選擇含糖豐富且質(zhì)地嫩脆的蘿卜、胡蘿卜、黃瓜等蔬菜作為腌制泡菜的原料。用刀把不適于腌制的部分去除，如蘿卜的菜葉及粗皮，并把蘿卜、胡蘿卜、黃瓜切成小塊，方便裝壇內(nèi)進(jìn)行腌制。整形后，把清洗干凈的蔬菜晾曬3～4 h。在蔬菜裝壇前直接用食鹽腌制或是放入25%的食鹽溶液，使蔬菜部分脫水變軟。把處理過(guò)的蔬菜分別裝入壇內(nèi)，壓緊，再使用蒸餾水配置好的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6%～8%的食鹽水倒入罐內(nèi)，食鹽水一定要淹沒(méi)蔬菜，鹽水離壇口3～5 cm，防止泡菜腌制后鹽水溢出影響泡菜的品質(zhì)。然后蓋上壇蓋，并用保鮮膜裹緊，在厭氧條件下乳酸菌可以生長(zhǎng)良好，同時(shí)也可以抑制好氧細(xì)菌及霉菌的生長(zhǎng)。把裝有原料的泡菜壇置于陰涼通風(fēng)處，在溫度10℃左右腌制10～15 d備用。

1.2.2 培養(yǎng)基的配制

（1） 牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基。牛肉膏3 g，蛋白胨10 g， NaCl 5 g， 瓊脂 15～20 g， 水 1 000 mL， pH 值7.0～7.2。

（2） 檸檬酸鹽培養(yǎng)基。NH4H2PO41 g，K2HPO41 g，NaCl 5 g， MgSO40.2 g， 檸檬酸鈉 2 g， 瓊脂 15～20 g，蒸餾水1 000 mL，1%溴香草酚藍(lán)乙醇液 10 mL，將上述各成分加熱溶解后，調(diào)節(jié)pH值至6.8，然后加入指示劑，搖勻，用脫脂棉過(guò)濾。制成后為黃綠色。

（3） 蛋白胨水培養(yǎng)基。 蛋白胨10 g，NaCl 5 g，蒸餾水1 000 mL，pH值7.6。

（4） 葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基。葡萄糖5 g，蛋白胨5 g，K2HPO42 g，蒸餾水1 000 mL，將上述各成分溶于 1 000 mL水中，調(diào)pH值7.0～7.2，過(guò)濾。

（5）醋酸鉛培養(yǎng)基。pH值7.4的牛肉膏蛋白胨瓊脂100 mL，硫代硫酸鈉0.25g，10%的醋酸鉛水溶液1 mL，將牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基100 mL加熱溶解，待冷卻到60℃時(shí)加入硫代硫酸鈉0.25 g，調(diào)pH 值7.2。

（6） 明膠培養(yǎng)基。牛肉膏蛋白胨液100 mL，明膠 12～18 g，pH值7.2～7.4，在水浴鍋中將上述成分溶化，不斷攪拌。溶化后調(diào)pH值7.2～7.4。

所有培養(yǎng)基在121℃下滅菌20 min。

1.2.3 主要染色液的配制

（1） 溴麝香草酚藍(lán)指示劑。溴麝香草酚藍(lán)0.04 g，0.01 mol/L NaOH 6.4 mL，蒸餾水93.6 mL，溴麝香草酚藍(lán)pH值6.0～7.6，顏色由黃變藍(lán)，常用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.04%。

（2） 甲基紅試劑。甲基紅0.04 g，95%乙醇60 mL，蒸餾水40 mL，先將甲基紅溶于95%乙醇中，然后加入蒸餾水即可。

（3） 吲哚試劑。 對(duì)二甲基氨基苯甲醛 2 g，95%乙醇190 mL，濃鹽酸40 mL。

（4） 草酸銨結(jié)晶紫染液。結(jié)晶紫1 g，95%酒精20 mL，草酸銨0.8 g和蒸餾水80 mL，混合，靜置48 h后使用。

（5） 盧戈氏碘液。I21.0 g，KI 2.0 g， 蒸餾水300 mL，先將碘化鉀溶解在少量水中，再將碘片溶解在碘化鉀溶液中，待碘片全溶后，加足水分即成。

（6） 蕃紅復(fù)染液。蕃紅0.25 g，95%的酒精10 mL，蒸餾水90 mL，將蕃紅溶于乙醇中，再用蒸餾水稀釋。

1.2.4 乳酸菌的分離

用移液管分別吸取少量發(fā)酵好的泡菜汁液，置于平板中心處釋放，然后用玻璃涂布器涂布均勻，并在培養(yǎng)皿外貼上標(biāo)簽，最后將培養(yǎng)皿放在37℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，觀察菌的生長(zhǎng)情況，若菌落太多形成菌苔，可對(duì)泡菜汁液進(jìn)行適當(dāng)?shù)南♂屧龠M(jìn)行涂布。對(duì)其中具有典型乳酸菌菌落特征的菌株進(jìn)行反復(fù)分離、純化至純菌落。從胡蘿卜泡菜中分離出3株乳酸菌，分別是A-1，A-2和A-3菌株。從蘿卜泡菜中分離出3株乳酸菌，分別是B-1，B-2和B-3菌株。從黃瓜泡菜中分離出4株乳酸菌，分別是C-1，C-2，C-3和C-4菌株。

1.2.5 乳酸菌的鑒定

（1） 形態(tài)鑒定。把接種的牛肉膏蛋白胨平板后，倒置放在37℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，觀察并記錄不同泡菜中乳酸菌菌落的數(shù)目、種類(lèi)、形狀、大小、顏色、有無(wú)隆起、濕潤(rùn)情況、光澤度、邊緣等形態(tài)學(xué)特征。

（2） 生理生化鑒定。將純化過(guò)的菌落進(jìn)行挑取，分別接種到蛋白胨水培養(yǎng)基、葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基、檸檬酸鹽培養(yǎng)基、醋酸鉛培養(yǎng)基、明膠培養(yǎng)基以及過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)培養(yǎng)基上，放在37℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，此操作在超凈工作臺(tái)上進(jìn)行。觀察菌的生長(zhǎng)情況，培養(yǎng)基的顏色變化和加入變色劑后培養(yǎng)基顏色變化，并記錄現(xiàn)象。

①檸檬酸鹽試驗(yàn)。把黃瓜、蘿卜、胡蘿卜等泡菜中分離出來(lái)的乳酸菌分別接種在檸檬酸鹽培養(yǎng)基上，此過(guò)程在超凈工作臺(tái)上進(jìn)行，接種完畢后，把接種后的培養(yǎng)基放在37℃的恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h，觀察檸檬酸鹽斜面培養(yǎng)基上有無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)和是否變色，藍(lán)色為陽(yáng)性，綠色為陰性。②吲哚試驗(yàn)。把黃瓜、蘿卜、胡蘿卜等泡菜中分離出來(lái)的乳酸菌分別接種在蛋白胨水培養(yǎng)基上，此過(guò)程在超凈工作臺(tái)上進(jìn)行，接種完畢后，把接種后的培養(yǎng)基放在37℃的恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h，然后在培養(yǎng)基中加入3～4滴乙醚，搖動(dòng)數(shù)次，靜置1 min，待乙醚上升后，沿管壁徐徐加入2滴吲哚試劑。在乙醚和培養(yǎng)物之間產(chǎn)生紅色環(huán)狀物為陽(yáng)性反應(yīng)。③甲基紅試驗(yàn)。把黃瓜、蘿卜、胡蘿卜等泡菜中分離出來(lái)的乳酸菌分別接種在葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基上，此過(guò)程在超凈工作臺(tái)上進(jìn)行，接種完畢后，把接種后的培養(yǎng)基放在37℃的恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h，然后在培養(yǎng)基中加入3～4滴甲基紅試劑，培養(yǎng)基變?yōu)榧t色為陽(yáng)性，變?yōu)辄S色為陰性。④硫化氫試驗(yàn)。把黃瓜、蘿卜、胡蘿卜等泡菜中分離出來(lái)的乳酸菌分別接種在醋酸鉛培養(yǎng)基上，此過(guò)程在超凈工作臺(tái)上進(jìn)行，接種完畢后，把接種后的培養(yǎng)基放在37℃的恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h，觀察黑色硫化鉛的產(chǎn)生。⑤明膠液化試驗(yàn)。把黃瓜、蘿卜、胡蘿卜等泡菜中分離出來(lái)的乳酸菌分別穿刺接種在明膠培養(yǎng)基上，此過(guò)程在超凈工作臺(tái)上進(jìn)行，接種完畢后，把接種后的培養(yǎng)基放在37℃的恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h，觀察明膠是否液化。⑥過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)。用接種針把分離純化的乳酸菌涂抹在過(guò)氧化氫中，有氣泡產(chǎn)生菌體含有過(guò)氧化氫酶。

2 結(jié)果與分析

2.1 泡菜的制作

泡菜腌制過(guò)后，顏色不太鮮亮，質(zhì)地較軟，味道爽口。蘿卜與胡蘿卜泡菜顏色變化較小，黃瓜泡菜的顏色由深綠色變成了暗綠色。3種泡菜壇的底部均有乳白色像牛奶一樣的乳酸菌落。說(shuō)明蔬菜在鹽水質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6%～8%的情況下會(huì)發(fā)酵產(chǎn)生大量的乳酸菌。

胡蘿卜、蘿卜和黃瓜泡菜見(jiàn)圖1。

2.2 乳酸菌的分離

從胡蘿卜、蘿卜、黃瓜泡菜中分離出A-1，A-2，A-3，B-1， B-2， B-3， C-1，C-2，C-3 和C-4共10株乳酸菌。胡蘿卜泡菜中含有A-1，A-2和A-3乳酸菌菌株；蘿卜泡菜中含有B-1，B-2和B-3乳酸菌菌株；黃瓜泡菜中含有C-1，C-2，C-3和C-4乳酸菌菌株。

蘿卜泡菜中乳酸菌菌落分布見(jiàn)圖2。

2.3 乳酸菌的鑒定

2.3.1 形態(tài)學(xué)鑒定

從泡菜中分離出多株乳酸菌，選取其中占優(yōu)勢(shì)的10株菌進(jìn)行鑒定，經(jīng)革蘭氏染色后在油鏡下觀察形狀結(jié)構(gòu)、菌落形態(tài)。這10株乳酸菌革蘭氏染色均為陽(yáng)性，無(wú)芽孢、無(wú)鞭毛、不運(yùn)動(dòng)，具有桿菌形態(tài)學(xué)特征。

泡菜乳酸菌的形態(tài)學(xué)特征鑒定結(jié)果見(jiàn)表1。

2.3.2 生理生化鑒定

（1） 檸檬酸鹽試驗(yàn)。所有泡菜中乳酸菌的檸檬酸鹽試驗(yàn)的培養(yǎng)基，隨著時(shí)間的推移，由深綠色變成深藍(lán)色，說(shuō)明乳酸菌可以利用檸檬酸鹽作為碳源進(jìn)行生長(zhǎng)繁殖。

檸檬酸鹽試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

（2） 吲哚試驗(yàn)。所有泡菜中乳酸菌的吲哚試驗(yàn)反應(yīng)結(jié)果，在乙醚和培養(yǎng)物之間產(chǎn)生紅色環(huán)狀物，為陽(yáng)性反應(yīng)。

吲哚試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。

（3） 甲基紅試驗(yàn)。胡蘿卜泡菜中A-1，A-2和A-3菌株的甲基紅試驗(yàn)是陰性；蘿卜泡菜中B-1，B-2和B-3菌株的甲基紅試驗(yàn)是陽(yáng)性；黃瓜泡菜中C-1和C-2菌株的甲基紅試驗(yàn)是陽(yáng)性，C-3和C-4菌株的甲基紅試驗(yàn)是陽(yáng)性。

甲基紅試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4。

表1 泡菜乳酸菌的形態(tài)學(xué)特征鑒定結(jié)果

表2 檸檬酸鹽試驗(yàn)結(jié)果

表3 吲哚試驗(yàn)結(jié)果

表4 甲基紅試驗(yàn)結(jié)果

（4） 硫化氫試驗(yàn)。所有泡菜中乳酸菌的硫化氫試驗(yàn)反應(yīng)結(jié)果均為陰性，無(wú)黑色硫化鉛形成。

硫化氫試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 硫化氫試驗(yàn)結(jié)果

（5）明膠化試驗(yàn)。所有泡菜中乳酸菌的明膠化試驗(yàn)反應(yīng)結(jié)果均為陽(yáng)性，明膠由固體變成液體。

明膠化試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表6。

表6 明膠化試驗(yàn)結(jié)果

（6） 過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)。所有泡菜中乳酸菌的過(guò)氧化氫試驗(yàn)均產(chǎn)生大量氣泡。

過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表7。

表7 過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

根據(jù)張剛的《乳酸細(xì)菌-基礎(chǔ)、技術(shù)和應(yīng)用》[15]中所提到的乳酸桿菌的標(biāo)準(zhǔn)可以得到乳酸桿菌可以利用糖作為碳源，但不可以分解利用蛋白質(zhì)、氨基酸。但是，有個(gè)別試驗(yàn)的結(jié)果于此標(biāo)準(zhǔn)不符，例如崔艷偉等人[16]的乳桿菌的分離及鑒定試驗(yàn)。

試驗(yàn)上述個(gè)別試驗(yàn)結(jié)果與乳酸桿菌的標(biāo)準(zhǔn)結(jié)果不符，例如乳酸菌的吲哚試驗(yàn)和明膠化試驗(yàn)結(jié)果均為陽(yáng)性，可能是由于乳酸菌菌株自身的某種特性或在培養(yǎng)過(guò)程中發(fā)生變異導(dǎo)致菌株的部分糖醇發(fā)酵結(jié)果發(fā)生改變，造成了生理生化鑒定的困難；也可能是細(xì)菌微量生化鑒定管產(chǎn)生的不確定因素所導(dǎo)致的。為了對(duì)分離菌株進(jìn)行準(zhǔn)確的鑒定，試驗(yàn)可以采用16S rDNA序列同源性分析方法進(jìn)行進(jìn)一步的鑒定，從而確定乳酸菌的菌種。

4 結(jié)論

從胡蘿卜泡菜中分離出A-1，A-2和A-3菌株；從蘿卜泡菜中分離式的B-1，B-2和B-3菌株；從黃瓜泡菜中分離出C-1，C-2，C-3和C-4菌株。經(jīng)過(guò)形態(tài)特征和生理生化特征初步鑒定A-1，A-2，A-3， B-1， B-2， B-3， C-1， C-2， C-3 和 C-4 菌株屬于乳酸桿菌。