男子30 km跑后尿液蛋白質組差異性表達的研究

林文弢，藺海旗，楊 玲，徐國琴，翁錫全

尿液是血液經腎小球濾過、腎小管和集合管重吸收、排泄及分泌產生的終末代謝產物，較血液等其他體液具有采樣簡便、無創(chuàng)傷、可重復取材的特點。自1878年VON.LEUBE[1]在士兵行軍時發(fā)現尿蛋白以來，國內外在運動性蛋白尿方面進行了諸多研究[2-3]。在運動訓練中，尿蛋白不僅有量的改變且存在組份的差異[4-5]。受傳統(tǒng)的蛋白質分離與鑒定技術所限，現研究多局限于尿總蛋白、Alb、β2-MG 等幾個已知蛋白，難以對尿蛋白組進行高通量、快速的并行研究及全面、系統(tǒng)地闡釋運動對機體影響的分子機制和內在規(guī)律。雙向凝膠電泳（2-DE）和質譜（MS）技術的聯(lián)合使用與飛速發(fā)展給蛋白質組學研究提供了很好的技術平臺。T.MARSHALL等[6]指出尿蛋白組學是采用蛋白組學技術與方法，系統(tǒng)的分析與鑒定尿液中蛋白質分子，進一步探究其生物學功能。目前尿蛋白組研究在正常人和醫(yī)學領域已取得一定成果，研究[7]顯示，正常人尿液中已鑒定出3280種蛋白質，豐富了人類尿蛋白組數據庫。在體育科學領域，有關尿液蛋白質組學的研究報道甚少，M.KOHLER 等[8]利用雙向凝膠電泳+質譜（2-DE+MS）技術，研究不同項目（團體、耐力、力量）運動員運動后尿液蛋白質組份，發(fā)現不同運動項目之間的尿蛋白組份和2-DE 圖譜表達存在差異。最近，研究團隊[9-10]綜述了蛋白組學研究在體育科研領域的應用進展和未來前景。

鑒于此，本研究從蛋白質組學整體的角度，探討30 km 跑對尿液蛋白質組圖譜差異性表達的影響，篩選對評價運動負荷和身體機能具有意義的目標尿蛋白，分析其功能及特點，為運動訓練監(jiān)控尋找一種無創(chuàng)、系統(tǒng)化的評價方法提供試驗借鑒和理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗器材

微量移液器購自法國Gilson 公司、高速冷凍離心機（Beckman）、等電聚焦儀（GE ETTAN IPGPHOR3）、垂直電泳槽（GE ETTAN DALTsix）、ImageMaster 2D platinum 5.0（GE）、MALDITOF-TOF 質譜儀（Bruker Dalton）。蛋白酶抑制劑PMSF、丙烯酰胺（Acylamide）、二硫蘇糖醇（DTT）購自Amresco 公司；IPG Buffer pH 4～7（GE）、胎牛血清標準品BSA、NH4HCO3購自Sigma公司；N，N，N’，N’-四甲基乙二胺、碘乙酰胺IAA購自Amersham公司；考馬斯亮藍G250購自Bio Basic公司；乙腈和十二烷基磺酸鈉分別購自Fisher和Promega。

1.2 尿液采集

以參加30 km挑戰(zhàn)賽10名男子為研究對象，身體健康且無泌尿系統(tǒng)疾病，具有一定長跑經驗，基本情況見表1。研究對象以賽事規(guī)定線路繞星湖綠道跑2圈，15 km/圈。氣溫19 ℃，濕度約50%，微風。

表1 受試者基本情況（n=10）Table1 the Basic Information of the Subjects（n=10）

尿樣采集：（1）晨尿的采集：睡前排空尿液，晨起前不再排尿。無菌瓶收集晨尿，并記錄尿液容積以及睡前和晨起的采尿時間。隨后根據各自尿液容積將30～50 mL 尿液分裝于50 mL無菌Corning管，為避免蛋白酶解，每100 mL尿液加入1 mL PMSF（1 mmol/L），-80 ℃保存；（2）運動后尿樣的采集：賽前排空，運動后15 min收集尿液，其他操作同（1）。

1.3 蛋白提取

樣本復融后于4 ℃，6000 r/min，離心20 min，吸出上清，用孔徑0.45 和0.22 μm 的濾膜分別過濾一次，丙酮沉淀過夜。然后沉淀蛋白4 ℃，離心20 min，12000 r/min，傾去上清并干燥后得蛋白團塊，于-80 ℃保存。用600 μL Tris飽和酚將沉淀團塊充分裂解后，加入600 μL提取液。然后4 ℃，12000 r/min，離心20 min，吸出上層酚相，移到EP 管內，重復操作一次。然后于-20 ℃以酚5倍體積的沉淀液沉淀蛋白過夜。沉淀蛋白4 ℃，12000 r/min，離心20 min，去上清；加1 mL 甲醇后吹打洗滌蛋白，12000 r/min，離心20 min，去上清；重復一次操作。晾干后-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 雙向凝膠電泳

（1）固相等點聚焦：干燥后的蛋白質經再水化液（RB）溶解和Bradford 法定量后，加入上樣液（1% DTT、1% IPG Buffer、1×BPB、RB 至460 μL），上樣量120 μg。膠條經泡脹過夜（10～12 h）后放入等電聚焦盤中。等電聚焦程序為：300 V 0.5 h、700 V 0.5 h、1500 V 1.5 h、9000 V 3 h、9000 V 5 h，總電壓為64 kVh。

（2）SDS-PAGE垂直電泳：將平衡后的膠條移至12.5%的凝膠上端，用0.8%低熔點瓊脂糖和1.5%的普通瓊脂糖封閉。雙向電泳：2 W/gel 45 min、17 W/gel 至溴酚藍到底，大約4.5 h。

1.5 凝膠染色與圖像分析

采用考馬斯亮藍G-250 染色法按照固定、漂洗、考染、漂洗的步驟進行凝膠染色。采用UMAX Powerlook1100 凝聚圖像掃描儀對膠圖掃描，采用Image Master 2D platinum 5.0 對圖譜進行背景消減、斑點檢測和蛋白匹配等分析，比較圖譜差異蛋白點。

1.6 質譜分析

選取部分差異蛋白點進行胰蛋白酶膠內酶切。利用MALDI-TOF-TOF（Autoflex speed?）質譜分析。通過NCBI數據庫，查詢匹配蛋白，條件如下：物種來源：human；肽質量：800～4000 Da；一級質譜質量誤差范圍：50 ppm；二級質譜質量誤差范圍：0.5 Da；表觀pI 與表觀Mr 的誤差范圍：無限制；酶解片段不完全：1 個；電荷：+1；固定修飾：Carbamidomethy；同位素峰：monoisotopic；可變修飾：Oxsidation；鑒定分值（Score）＞66（P＜0.05）。

2 結 果

2.1 雙向凝膠電泳（2-DE）圖譜特征

30 km 跑前、后尿液2-DE 電泳表達圖譜見圖1。如圖所示，從左至右pH 值為4～7 逐漸增加，從下往上分子量遞增，在10～130 kD 之間。從圖中呈現的蛋白質分子量分布范圍看，蛋白質分子量主要集中在20～80 kD 之間，大于80 kD 和小于20 kD 的蛋白質分子很少，各點染色深淺和面積有一定差異，表明蛋白質含量不同；從蛋白質的等電點來看，蛋白質的等電點多集中在4.5～6 之間，同時可見，左側斑點較多，右側斑點偏少，極堿性蛋白很少，說明尿液中酸性蛋白質（圖譜左側）多于堿性蛋白質（圖譜右側）。對運動前、后2-DE 圖譜經軟件分析和人工確認比較，顯示運動前、后尿液蛋白質存在差異，主要表現在2-DE 圖譜斑點的增減、面積大小及染色的深淺上。

圖130 km運動前（左）與運動后（右）尿液蛋白質2-DE圖譜Figure1 Representative 2-DE gel Images After Staining with Silver Nitrate for the Urine Sample from Athletes Before（Left）and After（Right）30 km Long-distance Running

2.2 雙向凝膠電泳（2-DE）圖譜差異性表達分析結果

對運動前、后尿液蛋白質2-DE 表達圖譜進行分析，運動前、后平均檢測到蛋白質點（1011±243）和（1737±15）個。運動前、后各重復電泳3 次，同時分別取一張膠為參考膠，其余膠與其匹配，匹配率分別為66.44%和73.02%，表明試驗獲得了良好的重復性。

2-DE 圖譜經軟件進一步分析，30 km 運動后與運動前相比，共有110 個差異性表達蛋白點，其中運動后表達量下調的點（含消失點）和表達量上調的點（含新增點）均為55 個，分別見圖2、3。

圖230 km運動后表達下調點圖譜Figure2 Expression Downregulation Point 2-DE Maps of Urine Proteins from Athletes

圖330 km運動后表達上調點圖譜Figure3 Expression Upregulation Point 2-DE Maps of Urine Proteins from Athletes

在運動后差異表達量下調/上調的55 個點中，其具體數目及倍數分布情況見表2、3。

表230 km運動后差異表達量下調/上調蛋白點數目及倍數分布Table2 the Number and Change Folds of Differentially Expressed Proteins After Exercise

表330 km運動后差異表達≥5倍的蛋白點Table3 Information Related to the Proteins with Fold Change of ≥5

表430 km運動后差異表達蛋白點質譜鑒定結果一覽表Table4 Protein Expression Levels in the Urine Samples from Athletes After Running Identified by MALDI-TOF-TOF

2.3 質譜鑒定結果

選擇運動后差異表達量上調≥5 倍和新增的蛋白點10 個，利用MALDI-TOF-TOF-MS質譜儀對這些差異性蛋白質斑點進行檢測，通過NCBI 數據庫檢索，鑒定出6 個蛋白（見表4）。其中，B37、B18、B25、B26、B43 同為白蛋白；運動前后6 個蛋白質的蛋白點視圖（Spots view）見圖4。

圖430 km運動前后6個差異表達蛋白點視圖Figure4 Differential 2-DE Analysis of Urine as Sampled Before and After the Race

3 討 論

機體運動可引起內環(huán)境、代謝產物以及營養(yǎng)狀態(tài)等發(fā)生改變，進一步會影響有關基因的表達與蛋白的合成[11]，使運動前、后蛋白組圖譜差異表達。本研究在對差異表達蛋白質斑點鑒定的基礎上，分析其功能發(fā)現這些蛋白與機體能量代謝方式的轉變、物質的轉運、應激保護等有關。

3.130 km跑對尿液能量代謝相關蛋白的影響

鋅α2-糖蛋白（zinc α2-glycoprotein，ZAG）是血清中一種可溶性糖蛋白[12]。最近研究表明，其是一種新型脂質動員因子，能促進脂肪分解，降低體重[13-14]；同時，也是診斷前列腺癌等疾患的一種生物標志物[15]。

目前，關于ZAG 和運動之間的研究還比較少。研究發(fā)現[16-17]，運動可使脂肪組織ZAGmRNA的表達水平上調，進而減脂，降低體重，提示ZAG可能是一調節(jié)脂代謝的候選基因。本研究中，ZAG運動后較運動前表達量增加5.2倍，其含量的增加很可能與機體為了滿足30 km長時間耐力運動時能量的需求，而引起ZAG 蛋白合成率增加，加強脂肪動員和促進脂肪分解有關。研究表明，鋅α2-糖蛋白可引起脂動員，促進BAT與肌肉組織表達解偶聯(lián)蛋白，增加機體能量消耗和脂質利用[18]，這更進一步支持該觀點。同時，M.KOHLER等[19]應用2-DE+MS技術在馬拉松運動后尿液中也檢測出ZAG，與本實驗結果一致。目前，ZAG與運動尤其是脂肪細胞的功能相關研究文獻很少，有待深入研究。

3.230 km跑對尿液應激保護相關蛋白的影響

維生素D 結合蛋白（vitamin D-binding protein，VDB）是一種多功能α-球蛋白，其包括白蛋白（ALB）、前白蛋白（PA）、甲胎蛋白（AFP）等，不僅具有攜帶維生素D 及血漿中的維生素D 的代謝物的功能[20]，同時還有促進清除肌動蛋白、增加補體C5 對中性粒細胞的趨化活性、調節(jié)破骨細胞活性、運輸脂肪酸和內毒素的功能[21-23]。

目前有關VDB 與運動的研究甚少，本實驗發(fā)現，受試者在30 km 運動前，尿液中尚未發(fā)現VDB，而在運動后作為新增點出現，這可能與長時間耐力運動時，代謝產物大量堆積以及肌組織有一定程度的損傷和局部炎癥而致使肝臟細胞在這種運動應激條件下分泌VDB 增多，加強機體對代謝物的清除等功能，起到保護機體的作用有關，提示耐力運動可能致使機體肌組織伴有一定程度的損傷及炎癥。目前，VDB 與運動的作用關系及機制知之甚少，有待于從定量的角度進一步更深入的研究與解析。

3.330 km跑對尿液細胞骨架相關蛋白的影響

肌動蛋白（Actin）是真核細胞中含量最豐富的蛋白質之一，它是細胞的一種重要的骨架蛋白。Actin分為3種類型，即α、β、γ-Actin[24]。β-Actin分布廣泛，其是肌纖維及細胞骨架中具有收縮功能的一種主要蛋白成分。Actin 是構成骨骼肌肌原纖維細絲的主要蛋白，參與肌肉的收縮，協(xié)助完成機體機械活動。

本研究顯示，30 km 長跑運動后，較運動前相比，運動后尿液中出現新增蛋白點β-Actin。β-Actin的表達量上調，分析原因可能是隨著運動時間的延長而引起骨骼肌細胞內相關收縮蛋白的降解，這致使機體加強對收縮蛋白的合成來維持一定的運動能力及正常功能，進一步導致β-Actin 的表達量在血液中上調，而最終從尿液排出增多。同時，從肌損傷的角度來闡釋，這與上述VDB表達量變化的原因十分相似，二者共同反映的結果顯示，受試者在30 km 運動后骨骼肌在很大程度上可能存在一定的細胞膜通透性增加或損傷，也許二者共同聯(lián)合探析運動對機體骨骼肌效應的化學本質具有重要意義?，F有文獻針對β-Actin與運動的報道目前國內尚未發(fā)現，有待于深入研究。

3.430 km跑對尿液轉運蛋白相關蛋白的影響

白蛋白（albumin，Alb）是血漿中最豐富的蛋白，健康成年人24 h尿蛋白總量約為10～100 mg，定性結果為陰性。研究顯示，尿Alb 含量可用于判斷腎小球濾過膜通透性的改變。同時，尿Alb可作為診斷腎小球相關疾病[25]。

本研究發(fā)現，30 km長跑運動后，尿液中Alb 較運動前作為新增點出現，這和前期定量測試尿Alb結果趨勢一致[26]，表明運動Alb 顯著性增多，這可能與腎小球和（或）白蛋白膜的電荷改變有關。M.KOHLER 等[8，19]發(fā)現馬拉松運動組較對照組比較，尿液蛋白質圖譜中檢測出Alb 以及其碎片，認為是由于運動刺激機體所引起，但同時也不排除相應機體患有腎小球腎炎疾病。在我們的研究中同樣也發(fā)現類似的結果，并且Alb的殘基、碎片較多。出現這種現象的原因，除M.KOHLER 的推測外，很大程度上應該還與蛋白翻譯、修飾以及蛋白降解等多種情況致使同一個蛋白的不同修飾類型或者不同碎片出現在凝膠的不同位置，表現為多個蛋白點，鑒定結果類似有關。

3.530 km跑對尿液其它相關蛋白的影響

本實驗研究結果顯示，這里的其它蛋白是指與疾病有關的蛋白質，包括2種：前列腺特異性抗原（prostate-specific antigen，PSA）、本斯-瓊斯蛋白（bence-Jones protein，BJP）。在醫(yī)學領域，這2 種蛋白分別與前列腺和骨髓瘤腎損傷等疾患有關，并有可能是各自對應疾患的診斷標志物。

PSA是由前列腺腺泡及前列腺導管上皮細胞分泌的一種特異性糖蛋白。血清中PSA 的85%～90%與PMSF 結合，而10%～15%的PSA為游離狀態(tài)，游離的PSA在血清中的含量甚微且恒定[27]。PSA 因有靶器官的特性，目前被認為是診斷前列腺癌的首選標志物。研究報道，任何引起前列腺細胞破壞的病理過程（炎癥、尿潴留等）可致使血清PSA升高[28]。本研究顯示，尿液中PSA運動后較運動前作為新增蛋白點出現，表明運動后尿液中PSA的濃度上升。究其因緣，可能與上述報道的長時間耐力運動引起機體炎癥及尿潴留等因素破壞了前列腺細胞有關。上述因素可能進一步破壞了前列腺腺泡，細胞外PSA被帶到血清中，使PAS含量升高，最終經腎臟外排增多。

BJP是免疫球蛋白分子的輕鏈，Kappa或Lambda鏈[29]。BJP也可偶爾出現在正常人尿中，可表示腎功能損傷。骨髓瘤患者的腎小管細胞基膜或管腔內均有蛋白沉淀，這意味著在生理條件下BJP 具不溶解性或分解代謝有缺陷。目前，BJP 在醫(yī)學領域主要認為其與骨髓瘤腎損傷有關。本研究發(fā)現，運動后尿液中出現SJP 的原因尚不明了，推測可能與長時間運動造成腎小球/管暫時性損傷有關。

上述2 種疾病標志物蛋白在運動后出現，試驗前，經詢問，所有受試者均無相關疾病和病史，耐力運動后尿液中這2 種蛋白濃度增加的具體機制尚不明確，有待深入探討；同時也反映出蛋白質組學這一技術檢測蛋白質組份具有很高的靈敏性。

4 結論與展望

（1）30 km跑引起尿液蛋白質組表達顯著差異，表達上調/下調蛋白點各55個，目標蛋白ZAG、VDB、β-Actin、Alb、PSA、BJP表達上調。

（2）ZAG的差異表達提示其可能為運動營養(yǎng)補劑篩選的候選標志；Alb可能與長時間耐力運動應激有關，用于運動負荷評價；而VDB、β-Actin 的差異表達可能是肌組織損傷的標志，PSA、BJP可能與腎小球/管暫時性損傷有關，4種差異蛋白可能作為診斷運動性疲勞及肌損傷的潛在目標蛋白。

（3）本研究是為構建運動員某一等級、運動負荷及個體尿液2-DE蛋白圖譜的開端。尿液蛋白圖譜差異表達可用于監(jiān)測運動性疲勞、預防肌損傷、運動選材及機體病理性變化；同時，可作為運動員血液生物護照的補充用于反興奮劑檢測，實現監(jiān)測無創(chuàng)化。