實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)及其應(yīng)用研究進(jìn)展

梁子英 劉芳

摘要? ? 實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)是在傳統(tǒng)PCR技術(shù)上發(fā)展而來(lái)的，不僅能判斷某一基因的有無(wú)，而且還能對(duì)其進(jìn)行定量分析。由于該技術(shù)與常規(guī)PCR相比，能夠進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)、自動(dòng)化程度高而被廣大研究者青睞。本文對(duì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR的原理、數(shù)據(jù)分析、定量方法、分類以及應(yīng)用進(jìn)行了系統(tǒng)而詳細(xì)的綜述。

關(guān)鍵詞? ? 熒光定量PCR;原理;定量方法;分類;應(yīng)用

中圖分類號(hào)? ? Q503? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼? ? A

文章編號(hào)? ?1007-5739（2020）06-0001-03? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?開(kāi)放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）

Research? Progress? on? Real-time? Quantitative? PCR? Technology? and? Its? Application

LIANG Zi-ying? ? LIU Fang *

（College of Biological Sciences，China Agricultural University，Beijing 100193）

Abstract? ? Real-time quantitative PCR technology is developed from traditional PCR technology.It can not only judge the presence or absence of a certain gene，but also perform quantitative analysis on it.Compared with conventional PCR，this technology is capable of real-time monitoring and has a high degree of automation，which is favored by researchers.In this paper，the principles，data analysis，quantitative methods，classification and applications of real-time quantitative PCR were reviewed systematically and in detail.

Key words? ? real-time quantitative PCR;principle;quantitative method;classification;application

1? ? 實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)的原理及數(shù)據(jù)分析

1.1? ? 實(shí)時(shí)熒光定量PCR的原理

實(shí)時(shí)熒光定量PCR與常規(guī)PCR相比，主要體現(xiàn)在熒光、實(shí)時(shí)與定量3個(gè)關(guān)鍵詞上。熒光是指在標(biāo)準(zhǔn)PCR體系中加入了熒光物質(zhì);實(shí)時(shí)是指通過(guò)熒光信號(hào)的積累能夠?qū)崟r(shí)監(jiān)測(cè)每次循環(huán)后PCR產(chǎn)物的變化，并生成熒光擴(kuò)增曲線;定量是指該技術(shù)能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)初始模板的定量分析。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR的擴(kuò)增曲線可由4個(gè)時(shí)期進(jìn)行描述，即基線期、指數(shù)增長(zhǎng)期、線性增長(zhǎng)期與平臺(tái)期。在基線期部分，強(qiáng)背景信號(hào)掩蓋了微弱的熒光信號(hào)，故此時(shí)期無(wú)法對(duì)模板的起始量進(jìn)行分析。反應(yīng)進(jìn)入平臺(tái)期，反應(yīng)管內(nèi)的dNTP、酶等被耗盡，反應(yīng)環(huán)境已不適合PCR反應(yīng)的進(jìn)行，此時(shí)的PCR產(chǎn)物不再增加，熒光信號(hào)達(dá)到水平狀態(tài)，且同一模板的多次技術(shù)重復(fù)的擴(kuò)增曲線在該時(shí)期重復(fù)性差、可變性高，故在這一時(shí)期同樣不適合進(jìn)行模板初始量的分析。在線性增長(zhǎng)期，雖然PCR反應(yīng)仍在進(jìn)行，但產(chǎn)物已不再呈指數(shù)形式增加，在該時(shí)期也不適合模板初始量的分析。在指數(shù)增長(zhǎng)期，反應(yīng)各組分（引物、dNTP、Mg+、酶）均過(guò)量，反應(yīng)所需的環(huán)境適中，聚合酶活性仍較高，該時(shí)期的擴(kuò)增效率高，產(chǎn)物數(shù)量以指數(shù)形式增加，且與初始模板量成線性相關(guān)[1]。另外，在指數(shù)增長(zhǎng)期內(nèi)，同一模板的多個(gè)技術(shù)重復(fù)具有高度的重復(fù)性，在這一時(shí)期進(jìn)行數(shù)據(jù)分析具有可靠性。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR中的3個(gè)概念，即基線、閾值與CT值是理解其原理的關(guān)鍵。在線性圖譜中，基線體現(xiàn)在與X軸平行的部分，對(duì)數(shù)圖譜中，它體現(xiàn)在背景信號(hào)雜亂的部分，系統(tǒng)會(huì)自動(dòng)形成基線的起始循環(huán)數(shù)與終止循環(huán)數(shù)，也可手動(dòng)調(diào)節(jié)。熒光閾值指的是熒光強(qiáng)度值，將它界定為3～15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)標(biāo)準(zhǔn)差的10倍[2]，在擴(kuò)增曲線里，穿過(guò)閾值與X軸形成的平行線即為閾值線，系統(tǒng)可自動(dòng)形成也可手動(dòng)設(shè)置，手動(dòng)設(shè)定閾值時(shí)，在指數(shù)增長(zhǎng)期內(nèi)重復(fù)性好的范圍內(nèi)上下調(diào)節(jié)。CT值是指熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)次數(shù)[3]，與靶點(diǎn)的初始量成反比。整個(gè)擴(kuò)增過(guò)程，基線決定閾值，閾值決定CT值，為了保證試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，需保證擴(kuò)增曲線的基線以及閾值設(shè)置的合理性。系統(tǒng)一般將基線起始循環(huán)數(shù)設(shè)為3，正確的基線終止循環(huán)數(shù)很重要，若背景信號(hào)過(guò)強(qiáng)，系統(tǒng)會(huì)將背景信號(hào)誤判為擴(kuò)增信號(hào)，自動(dòng)生成的基線范圍比實(shí)際范圍小，影響擴(kuò)增曲線的帶型以及最終檢測(cè)到的CT值，這種情況可手動(dòng)設(shè)置基線終止循環(huán)數(shù)，一般將其設(shè)為該樣品開(kāi)始擴(kuò)增的前一個(gè)循環(huán)。

1.2? ? 實(shí)時(shí)熒光定量PCR的數(shù)據(jù)分析

在指數(shù)增長(zhǎng)期，PCR產(chǎn)物量以指數(shù)形式增加，根據(jù)這一原則，假設(shè)擴(kuò)增效率為E，模板起始量為N0，m個(gè)循環(huán)后PCR產(chǎn)物量為Nm，則有Nm=N0（1+E）m（1），對(duì)該等式兩邊取對(duì)數(shù)，則有LgN0=-m·lg（1+E）+Lg Nm（2），若循環(huán)數(shù)達(dá)到某一CT值時(shí)，熒光閾值為Q，式（1）可寫(xiě)成：Q=N0（1+E）CT，式（2）可寫(xiě)成：LgN0=-CT·lg（1+E）+LgQ。當(dāng)需要對(duì)靶基因在mRNA水平上進(jìn)行表達(dá)量分析時(shí)，通常采用式（1）進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。當(dāng)需要對(duì)靶基因拷貝數(shù)進(jìn)行絕對(duì)定量時(shí)，則需要用式（2）進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2? ? 實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)的定量方法

“絕對(duì)定量”與“相對(duì)定量”是實(shí)時(shí)熒光定量PCR的2種定量方法[4]，研究者可選擇適合自身研究的定量方法。

2.1? ? 絕對(duì)定量法

絕對(duì)定量法也稱作標(biāo)準(zhǔn)曲線法[5]，是一種利用已知的標(biāo)準(zhǔn)曲線來(lái)定量未知樣本目的模板起始量的方法。以5點(diǎn)梯度稀釋所得的標(biāo)準(zhǔn)品為模板，經(jīng)實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增，以目的模板初始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，檢測(cè)到的CT值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性回歸方程，將未知樣本的CT值帶入該方程即可計(jì)算出目的模板的起始量。標(biāo)準(zhǔn)曲線的各項(xiàng)指標(biāo)：斜率、擴(kuò)增效率（E）、相關(guān)系數(shù)（R2）、間距均需進(jìn)行嚴(yán)格評(píng)價(jià)，從而確保該曲線的可用性。各點(diǎn)間距應(yīng)相等，間距以及斜率的絕對(duì)值應(yīng)滿足3.100～3.582，相關(guān)系數(shù)R2>0.99，擴(kuò)增效率（E）在90%～110%之間。擴(kuò)增效率、斜率以及間距三者相互關(guān)聯(lián)，擴(kuò)增效率（E）=10（-1/斜率）-1，斜率的絕對(duì)值恰是各點(diǎn)之間的平均間距。當(dāng)擴(kuò)增效率<90%時(shí)，間距以及斜率的絕對(duì)值會(huì)>3.582;當(dāng)擴(kuò)增效率>110%時(shí)，間距以及斜率的絕對(duì)值會(huì)<3.10，故擴(kuò)增效率越低，斜率的絕對(duì)值越大，間距越寬;擴(kuò)增效率越高，斜率的絕對(duì)值越小，間距越窄。擴(kuò)增效率過(guò)低，酶的活性可能出現(xiàn)了問(wèn)題，或反應(yīng)體系不適合反應(yīng)的有效進(jìn)行。若擴(kuò)增效率過(guò)高，反應(yīng)管內(nèi)可能存在目的基因擴(kuò)增之外的其他非特異擴(kuò)增，需要對(duì)引物進(jìn)行一個(gè)溶解曲線的檢測(cè)，優(yōu)化反應(yīng)體系以及反應(yīng)程序。

2.2? ? 相對(duì)定量法

相對(duì)定量可分析某一靶基因在不同樣品之間、同一樣品的不同部位之間以及某一樣品的某一部位在不同動(dòng)態(tài)時(shí)期之間的mRNA水平上表達(dá)量的比值，也可分析靶基因與內(nèi)參基因在同一樣品中拷貝數(shù)的比值。在相對(duì)定量中，需要用內(nèi)參基因來(lái)消除因模板濃度不同所帶來(lái)的誤差，進(jìn)而對(duì)靶基因的初始量進(jìn)行校正[6]。常用的有2-ΔΔCT法[7]，雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法[8-9]。

2.2.1? ? 2-ΔΔCT法。使用該方法的前提是靶基因與內(nèi)參基因的擴(kuò)增效率相等且均為100%[10]，假設(shè)靶基因在處理組與對(duì)照組中的初始量分別為N1與N2，當(dāng)達(dá)到某一熒光閾值時(shí)，靶基因在處理組與對(duì)照組中的閾值循環(huán)數(shù)分別為CT1與CT2，則有C1·N1·2C2·N2·2（C1、C2分別為處理組與對(duì)照組的濃度），假設(shè)內(nèi)參基因在處理組與對(duì)照組中的初始量分別為N1′與N2′，當(dāng)達(dá)到某一熒光閾值時(shí)，內(nèi)參基因在處理組與對(duì)照組中的閾值循環(huán)數(shù)分別為CT1′與CT2′，則有C1·N1′·2=C2·N2′·2，故有，C1·N1·2/C1·N1′·2=C2·N2·2/C2·N2′·2，由于內(nèi)參基因在處理組與對(duì)照組中的初始量是相同的，即N1′=N2′，故靶基因在處理組與對(duì)照組中的比值N1/N2=2，即N1/N2=2-ΔΔCT，其中ΔΔCT=ΔCT處理組-ΔCT對(duì)照組=（CT靶基因-CT內(nèi)參基因）處理組-（CT靶基因-CT內(nèi)參基因）對(duì)照組。該方法不需要生成標(biāo)準(zhǔn)曲線，操作簡(jiǎn)便、效率高，但靶基因以及內(nèi)參基因的擴(kuò)增效率需達(dá)100%。此方法通常用于某一基因在mRNA水平上的表達(dá)量分析。

2.2.2? ? 雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法。雙標(biāo)準(zhǔn)曲線即靶基因以及內(nèi)參基因各對(duì)應(yīng)的一套標(biāo)準(zhǔn)曲線。假設(shè)靶基因的平均擴(kuò)增效率為E3，在待測(cè)樣品以及校準(zhǔn)樣品中的初始拷貝數(shù)分別為N3與N4，當(dāng)達(dá)到某一閾值時(shí)，該靶基因在待測(cè)樣品以及校準(zhǔn)樣品中檢測(cè)到的CT值分別為CT3與CT4，則有C3·N3·（1+E3）=C4·N4·（1+E3）（其中，C3與C4分別為待測(cè)樣品以及校準(zhǔn)樣品的濃度），假設(shè)內(nèi)參基因的平均擴(kuò)增效率為E4，內(nèi)參基因在待測(cè)樣品以及校準(zhǔn)樣品中的初始拷貝數(shù)分別為N3′與N4′，當(dāng)達(dá)到某一閾值時(shí)，內(nèi)參基因在待測(cè)樣品以及校準(zhǔn)樣品中檢測(cè)到的CT值分別為CT3′與CT4′，則有C3·N3′·（1+E4）=C4·N4′·（1+E4），則靶基因與內(nèi)參基因在待測(cè)樣品中的拷貝數(shù)比值N3/N3′=N4/N4′·（（1+E3）/（1+E4）），其中，N4為靶基因在校準(zhǔn)樣品中的初始拷貝數(shù)，校準(zhǔn)樣品中靶基因的拷貝數(shù)是已知的，并且是經(jīng)過(guò)Southern雜交驗(yàn)證的;N3′與N4′是指內(nèi)參基因在待測(cè)樣品以及校準(zhǔn)樣品中的初始拷貝數(shù)，在拷貝數(shù)變異檢測(cè)中，內(nèi)參基因需具有“同一物種內(nèi)具有恒定低拷貝”這一特點(diǎn)，也就是N3′=N4′，故靶基因在待測(cè)樣品中的初始拷貝數(shù)N3=N4·（1+E3）/（1+E4）。利用該方法需生成標(biāo)準(zhǔn)曲線，操作嚴(yán)謹(jǐn)復(fù)雜，但計(jì)算結(jié)果準(zhǔn)確，誤差小，對(duì)結(jié)果要求較高的分析通常采用該方法。

3? ? 實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)的分類

3.1? ? DNA染料法

用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR的DNA染料有SYBR Green I、SYBR Gold、EvaGreeEB與EB。SYBR Green I是目前試驗(yàn)過(guò)程中最常用的一種，該染料結(jié)合于雙鏈DNA的小溝處[11]，游離的染料分子只發(fā)出微弱的熒光，錨定到雙鏈DNA上的染料才會(huì)發(fā)出強(qiáng)熒光。在PCR延伸階段，SYBR Green I染料結(jié)合上去，發(fā)出熒光，雙鏈合成越多，熒光強(qiáng)度越強(qiáng)。SYBR Green I與DNA的結(jié)合具有非特異性，除了與目的片段結(jié)合外，還能與其他非目的片段的雙鏈DNA分子結(jié)合，如非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物、引物二聚體。為了檢測(cè)產(chǎn)物中是否含有非特異或引物二聚體，在PCR反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行一個(gè)溶解曲線分析，即溫度從50 ℃升高到95 ℃，監(jiān)測(cè)這一過(guò)程中熒光信號(hào)的變化情況，用熒光信號(hào)變化的速度與溫度作圖，形成溶解曲線，若未形成非特異或引物二聚體，特征峰只有1個(gè)，且相同基因形成特征峰的Tm值相同;若有非特異或引物二聚體時(shí)，就會(huì)出現(xiàn)特征峰之外的雜峰。由于染料法對(duì)雙鏈DNA的識(shí)別不具有特異性，所以試驗(yàn)過(guò)程中需要合理地設(shè)計(jì)引物。

3.2? ? 熒光探針?lè)?/p>

熒光探針是指在寡聚核苷酸上結(jié)合熒光報(bào)告基團(tuán)與熒光淬滅基團(tuán)，由激發(fā)態(tài)的報(bào)告基團(tuán)回到基態(tài)的過(guò)程會(huì)釋放熒光，當(dāng)報(bào)告基團(tuán)與淬滅基團(tuán)離得很近時(shí)，激發(fā)態(tài)的報(bào)告基團(tuán)會(huì)將熒光傳遞給淬滅基團(tuán)從而不發(fā)射熒光。熒光探針?lè)ù篌w上分為水解探針?lè)ā㈦p聯(lián)置換探針?lè)ê碗s交探針?lè)ā?/p>

3.2.1? ? 水解探針?lè)?。水解探針的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)是寡核苷酸序列的5′端為熒光報(bào)告基團(tuán)，3′端為熒光淬滅基團(tuán)。PCR擴(kuò)增前，探針游離于靶序列外，報(bào)告基團(tuán)發(fā)出的熒光被淬滅基團(tuán)吸收，檢測(cè)不到熒光，但有時(shí)會(huì)因淬滅不徹底，會(huì)檢測(cè)到微弱的熒光。在PCR退火時(shí)，探針特異性地結(jié)合到靶序列上，在延伸階段，利用Taq酶5′-3′外切酶的活性將探針?biāo)?，熒光?bào)告基團(tuán)與熒光淬滅基團(tuán)分離，熒光信號(hào)被釋放，并與PCR產(chǎn)物的數(shù)量成正相關(guān)。由于水解探針的作用機(jī)理依賴于Taq酶5′-3′外切酶的活性，所以水解探針又稱為T(mén)aqman探針。

在Taqman探針的基礎(chǔ)上研發(fā)出了Taqman MGB探針，該探針的3′端除了有淬滅基團(tuán)外，增加了一種MGB基團(tuán)，該基團(tuán)能夠與雙鏈DNA的小溝結(jié)合，使探針與靶序列的親和力增強(qiáng)，探針Tm可提升10度左右，長(zhǎng)度可適當(dāng)減少，降低了合成成本[3]。另外，Taqman MGB探針3′端的淬滅基團(tuán)本身不發(fā)熒光，從而降低了熒光本底信號(hào)。

3.2.2? ? 雙鏈置換探針?lè)āｋp鏈置換探針的特點(diǎn)是由正負(fù)兩條鏈組成，互補(bǔ)結(jié)合，正鏈的5′端標(biāo)記有熒光基團(tuán)，3′端通過(guò)結(jié)合磷酸基團(tuán)或氨基基團(tuán)來(lái)阻止其延伸，負(fù)鏈的5′端比正鏈少1～5個(gè)堿基，3′端標(biāo)記有淬滅基團(tuán)。當(dāng)體系中無(wú)靶序列時(shí)，正鏈與負(fù)鏈處于結(jié)合狀態(tài)，兩端的熒光基團(tuán)離得很近，檢測(cè)不到熒光信號(hào)，當(dāng)有靶序列存在時(shí)，正鏈就會(huì)與靶序列結(jié)合從而將負(fù)鏈釋放出去，2條鏈上的熒光基團(tuán)分離，能檢測(cè)到熒光信號(hào)。相較與水解探針，雙鏈置換探針的熒光基團(tuán)以及淬滅基團(tuán)相互作用得更牢固，產(chǎn)生的本底信號(hào)更低[12]。

3.2.3? ? 雜交探針。雜交探針中最常用的是分子信標(biāo)與雙雜交探針。游離狀態(tài)下的分子信標(biāo)是一種“莖-環(huán)”結(jié)構(gòu)，其環(huán)狀部位與靶序列互補(bǔ)結(jié)合，兩側(cè)的莖臂互補(bǔ)結(jié)合，且與靶序列無(wú)同源性，在兩側(cè)莖的3′與5′端分別標(biāo)記有熒光報(bào)告基團(tuán)與淬滅基團(tuán)。當(dāng)分子信標(biāo)游離于靶序列時(shí)，兩莖臂上的熒光基團(tuán)離得很近，檢測(cè)不到熒光，在PCR退火階段，環(huán)狀部位與靶序列結(jié)合，兩莖臂的互補(bǔ)結(jié)構(gòu)被破壞，兩端的熒光基團(tuán)分離，熒光信號(hào)被釋放。

雙雜交探針是由一對(duì)探針組成，其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)是2條探針能夠與靶序列上的相鄰部位結(jié)合[13]，其中一個(gè)探針的5′端為熒光受體基團(tuán)，另一個(gè)探針的3′端為熒光供體基團(tuán)。在退火階段，兩探針以首尾相接的方式結(jié)合到靶序列上，2個(gè)基團(tuán)離得很近，供體基團(tuán)激發(fā)后產(chǎn)生的熒光能量被受體基團(tuán)吸收，此時(shí)可以檢測(cè)到受體發(fā)出的熒光。當(dāng)這對(duì)探針處于游離狀態(tài)時(shí)，2個(gè)基團(tuán)離的遠(yuǎn)，檢測(cè)不到受體基團(tuán)發(fā)出的熒光。

4? ? 實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)的應(yīng)用

由于實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)較常規(guī)PCR技術(shù)相比，具有污染少、定量準(zhǔn)確、實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)、自動(dòng)化程度高等優(yōu)點(diǎn)，該技術(shù)已被應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因檢測(cè)、作物育種、環(huán)境科學(xué)以及醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域。

4.1? ? 在轉(zhuǎn)基因生物中的應(yīng)用

4.1.1? ? 在轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)中的應(yīng)用。開(kāi)發(fā)與完善轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)技術(shù)已成為對(duì)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品進(jìn)行標(biāo)識(shí)管理，進(jìn)而維護(hù)消費(fèi)者知情權(quán)的一種必然趨勢(shì)。標(biāo)識(shí)的閾值是指產(chǎn)品中含有的轉(zhuǎn)基因作物的百分比，這就需要轉(zhuǎn)基因檢測(cè)方法不能僅僅停留在定性檢測(cè)上，還需要進(jìn)行定量檢測(cè)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)是目前廣泛應(yīng)用的定量檢測(cè)技術(shù)。自Vaitilingom等[14]首次將該技術(shù)應(yīng)用到轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的定量檢測(cè)上以來(lái)，該技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于玉米、大豆、水稻、小麥、番木瓜等轉(zhuǎn)基因生物目的基因的定量檢測(cè)中[15-19]。熒光定量PCR技術(shù)不僅能夠?qū)崿F(xiàn)單一基因的檢測(cè)，還能同時(shí)實(shí)現(xiàn)多個(gè)基因的檢測(cè)，在保證準(zhǔn)確性的同時(shí)大大提高了通量。

4.1.2? ? 在轉(zhuǎn)基因新品種育種過(guò)程中的應(yīng)用。在轉(zhuǎn)基因過(guò)程中，外源基因的插入位點(diǎn)以及數(shù)目都是隨機(jī)的，插入的拷貝數(shù)低（1或2），能很好地表達(dá)，拷貝數(shù)高反而表達(dá)不穩(wěn)定甚至沉默。因此，必須對(duì)轉(zhuǎn)基因T0代的拷貝數(shù)進(jìn)行檢測(cè)，保留低拷貝（1或2拷貝），棄掉高拷貝。T0自交得到的T1是處于分離狀態(tài)的，當(dāng)T0為1拷貝時(shí)，T1會(huì)出現(xiàn)0、1、2這3種拷貝數(shù)類型，0拷貝的植株是不含外源基因的，在壓力篩選過(guò)程中被淘汰，1拷貝的T1單株在自交下一代中仍會(huì)出現(xiàn)分離，2拷貝單株的自交后代仍為2拷貝，不再分離，故2拷貝單株是純系單株。當(dāng)T0為2拷貝時(shí)，T1會(huì)出現(xiàn)0、1、2、3、4這5種拷貝數(shù)類型，1、2、3這3種拷貝數(shù)類型的單株的下一代仍會(huì)出現(xiàn)分離，4拷貝單株的自交后代拷貝數(shù)仍為4，不再分離，在此種情況下，4拷貝單株是純系單株。為了更快更早地拿到純系單株，通過(guò)檢測(cè)T1單株外源基因的拷貝數(shù)即可判斷出純系單株，再通過(guò)對(duì)T2代進(jìn)行拷貝數(shù)檢測(cè)，完成純系驗(yàn)證，通過(guò)這種方式可以快速準(zhǔn)確地拿到純系種子。通過(guò)檢測(cè)T0以及T1植株外源基因的拷貝數(shù)即可拿到純系T1單株，最終，純合的T1自交可得到純合的T2種子，再對(duì)純合的T2植株進(jìn)行表達(dá)量分析，只有對(duì)純合的、過(guò)表達(dá)的T2植物的表型及功能的研究才是有意義的，用該方式獲得過(guò)表達(dá)的純系T2，與傳統(tǒng)的育種方法相比，大大地縮短了育種年限。然而，無(wú)論在T0、T1以及T2中的外源基因拷貝數(shù)的檢測(cè)，還是對(duì)純合T2的表達(dá)量分析，均可以通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)來(lái)實(shí)現(xiàn)，準(zhǔn)確性高，通量大，適用于大批次樣品的檢測(cè)。

4.2? ? 在農(nóng)作物育種中的應(yīng)用

分子標(biāo)記輔助育種中的單核苷酸多態(tài)性標(biāo)記SNP技術(shù)因在全基因組中覆蓋率廣、圖譜密度高而被廣泛地開(kāi)發(fā)與利用。SNP位點(diǎn)的檢測(cè)方法有測(cè)序法、單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析法、變性高效液相色譜法、寡核苷酸鏈連接分析法、基于熒光定量PCR的Taqman探針?lè)ㄅcHRM法。其中，測(cè)序法、單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析法與變性高效液相色譜法均因成本高、通量低而未得到廣泛使用，寡核苷酸鏈連接分析法由于可操作性差也未被廣泛使用?；跓晒舛縋CR的Taqman探針?lè)ㄅcHRM法因其通量高、在封閉的環(huán)境中進(jìn)行反應(yīng)、污染率低等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛地利用。

4.3? ? 在其他方面的應(yīng)用

熒光定量PCR技術(shù)在食品監(jiān)測(cè)以及環(huán)境監(jiān)測(cè)中均有應(yīng)用。食品中可能含有一些有害的細(xì)菌，利用熒光定量PCR技術(shù)可對(duì)食品中的某一細(xì)菌進(jìn)行定量分析[20]，靈敏度和可靠性高。環(huán)境中的微生物[21]，如大氣環(huán)境中的大腸桿菌，水環(huán)境中的藍(lán)細(xì)菌、赤潮藻、假單胞菌，土環(huán)境中的炭疽芽孢桿菌是否超標(biāo)，嚴(yán)重影響著人類、水生生物以及植物的健康生長(zhǎng)，熒光定量PCR技術(shù)能對(duì)其實(shí)現(xiàn)定量分析，對(duì)環(huán)境進(jìn)行檢測(cè)。另外，熒光定量PCR技術(shù)也廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)，如癌癥的診斷、病原體的感染以及基因缺陷性疾病的檢測(cè)。

5? ? 參考文獻(xiàn)

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