新疆石河子地區(qū)某規(guī)模奶牛場奶牛乳房炎鏈球菌的分離鑒定及藥敏試驗

文/馬 博 卜三平 劉 鴿

（1 新疆巴音郭楞職業(yè)技術(shù)學(xué)院；2 新疆維吾爾自治區(qū)畜牧總站）

奶牛乳房炎（Mastitis）也稱乳腺炎，是泌乳奶牛乳腺細(xì)胞受到物理、化學(xué)和病原微生物的共同作用而形成的一種炎癥反應(yīng)，其中病原微生物感染是最主要的致病因素[1～5]。奶牛乳房炎在各奶牛場中普遍存在，是制約奶牛場經(jīng)濟效益的疾病之一，也是影響乳制品質(zhì)量的重要因素。根據(jù)奶牛乳房有無紅、腫、熱、痛等臨床癥狀，將奶牛乳房炎分為臨床型乳房炎和隱性乳房炎。導(dǎo)致奶牛乳房炎的致病菌有150 余種，其中常見的有20 多種，以大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、鏈球菌三大致病菌為主，其中鏈球菌是革蘭氏陽性菌，引起奶牛乳房炎的鏈球菌主要有無乳鏈球菌、停乳鏈球菌、乳房鏈球菌、化膿鏈球菌等[6～9]。檢測奶牛乳房炎常用的方法有乳樣體細(xì)胞檢測法、蘭州隱性乳房炎檢測試劑法、乳樣酸度檢測法、乳樣電導(dǎo)率檢測法，其中前兩種方法在實際生產(chǎn)中應(yīng)用最為廣泛。

目前，治療奶牛乳房炎仍以使用抗生素為主，但長期使用抗生素容易使致病菌產(chǎn)生耐藥性，所以選擇敏感藥物尤為重要。結(jié)合奶牛場的實際情況也有使用抗菌肽、噬菌體、中藥等進(jìn)行治療的案例。本試驗主要針對新疆石河子地區(qū)某規(guī)模奶牛場進(jìn)行了乳房炎鏈球菌流行病學(xué)調(diào)查和分離，對分離到的菌株進(jìn)行藥敏試驗，旨在為新疆石河子地區(qū)奶牛場乳房炎的防治工作提供一定的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源

在新疆石河子地區(qū)的某規(guī)模奶牛場進(jìn)行乳房炎流行病學(xué)調(diào)查，發(fā)現(xiàn)部分臨床型乳房炎奶牛和隱性乳房炎奶牛。選擇12 頭臨床型乳房炎奶牛的20 個乳區(qū)乳樣和12 頭隱性乳房炎奶牛的16 個乳區(qū)乳樣進(jìn)行細(xì)菌分離與鑒定。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

凈化工作臺（上海鴻都電子科技有限公司）、4 ℃保鮮冰箱（山東青島海爾集團）、控溫冰箱（日本三洋冰箱設(shè)備）、電熱套（KDM型，江蘇南通設(shè)備廠）、培養(yǎng)皿、涂布器、恒溫箱（常設(shè)置成37 ℃恒溫）、電子稱（上海精密科學(xué)儀器廠）、磁力加熱攪拌器（78-1型，江蘇榮華儀器設(shè)備場）、高壓鍋、游標(biāo)卡尺、接種環(huán)、酒精燈、鑷子、顯微鏡等。PCR儀（TC-512）、高倍顯微鏡、移液槍、水浴鍋（XMTD-8222）、超速離心機（GS-21R）、高速冷凍離心機（Multifuge X1R）、微波爐、凝膠成像儀（Bio-Rad）、電泳槽（Power Wave XS2）、電泳儀（DYY-6B）。

1.1.3 主要試劑

瓊脂糖、革蘭氏快速染色液、TaqDNA聚合酶、DL-2000 DNA Marker（購自TaKaRa有限公司，大連）、細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（引物由北京睿博興科生物技術(shù)有限公司完成）、多種藥敏紙片。

鏈球菌選擇性培養(yǎng)基、兔鮮血培養(yǎng)基（兔血含量10 mL/L）、普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、LB液體培養(yǎng)基、LB固體培養(yǎng)基、鄧亨氏水、麥芽糖培養(yǎng)基、葡萄糖培養(yǎng)基、蔗糖培養(yǎng)基、乳糖培養(yǎng)基、甘露醇發(fā)酵試驗、七葉苷水解試驗、過氧化氫酶試驗生化鑒定培養(yǎng)基等按照實驗室常規(guī)配置[10]。

1.2 方法

1.2.1 鏈球菌的富集、分離和純化

將36 份乳樣進(jìn)行待分離細(xì)菌的富集，用接種環(huán)蘸取乳樣到普通營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，置于37 ℃條件下震蕩培養(yǎng)24 h左右。將在肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)好的菌在鏈球菌選擇性平板培養(yǎng)基上劃線接種，置于恒溫箱中，在37 ℃條件下恒溫培養(yǎng)12～24 h。等細(xì)菌在鏈球菌選擇性平板培養(yǎng)基上生長良好后，及時挑取單個典型菌落，并在兔鮮血培養(yǎng)基上劃線接種培養(yǎng)，置于37 ℃的恒溫箱中培養(yǎng)12～24 h，進(jìn)行涂片，革蘭氏染色，鏡檢，使用顯微鏡仔細(xì)觀察染色后玻片上菌體的染色特性和形態(tài)。最終，將得到的菌落在鏈球菌液體培養(yǎng)基上接種，以達(dá)到增殖培養(yǎng)的目的[11]。

1.2.2 鏈球菌的生化鑒定

對培養(yǎng)的鏈球菌進(jìn)行分離、純化、培養(yǎng)后，進(jìn)行生化鑒定，分別進(jìn)行蔗糖試驗、麥芽糖試驗、乳糖試驗、過氧化氫酶試驗、甘露醇發(fā)酵試驗、七葉苷水解試驗，仔細(xì)觀察每個試驗的結(jié)果，并做好相關(guān)的記錄。

1.2.3 分離菌株的16S rRNA鑒定

參考16S rRNA基因測序法，完成16s rDNA PCR擴增。上游引物：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’；下游引物：5’-GGTTACCTTGTTACCACTT-3’（北京睿博興科生物技術(shù)有限公司合成）。按照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（TIANGEN公司）操作步驟提取鏈球菌菌株的基因組DNA。

用基因組DNA為模板擴增16S rRNA基因，PCR法采用25 μL反應(yīng)體系：ddH2O 8.5 μL，PCR Mix 12.5μL，模板2 μL，上、下游引物均1.0 μL；反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性40 s，57 ℃退火40 s，72 ℃延伸2 min，30 個循環(huán)；72 ℃延伸7 min。觀察目的條帶的電泳圖像。

1.2.4 耐藥性敏感試驗

在普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上加50 μL已經(jīng)培養(yǎng)好的菌液，用“L”棒涂勻，菌液干燥后，在平板上貼5 片不同的藥敏紙片（要分布均勻，以免影響試驗），紙片的制作標(biāo)準(zhǔn)參照NCCLS（美國國家臨床試驗室標(biāo)準(zhǔn)化委員會）；試驗方法參考《獸醫(yī)微生物學(xué)》[12]，放置溫箱培養(yǎng)20 h左右，測抑菌環(huán)直徑，根據(jù)抑菌圈的大小來判斷該株菌對抗生素的敏感性[13]。

2 試驗結(jié)果

2.1 鏈球菌菌株的分離與鑒定

在37 ℃的環(huán)境中培養(yǎng)19 h左右，分離到的菌株在普通平板培養(yǎng)基上生長貧瘠；在兔鮮血瓊脂培養(yǎng)基上生長良好，形態(tài)特征為圓形、表面光滑、隆起、濕潤、溶血性、菌落周邊成半透明邊緣的露滴狀，直徑大小為1.0～2.0 mm的菌落（圖1）；在鏈球菌選擇性平板培養(yǎng)基上接種后形成形態(tài)特征為圓形、表面光滑、大小如針尖狀的菌落；把分離到的細(xì)菌進(jìn)行涂片、革蘭氏染色、鏡檢，觀察記錄試驗結(jié)果，可見紫色、革蘭氏陽性、成鏈狀（有短鏈、長鏈和雙鏈）排列（圖2）；將菌液在4 ℃保鮮冰箱中放置較長時間后，試管底部會有不同程度的沉淀，而選擇性液體培養(yǎng)基的上部澄清，并無菌膜形成。

圖1 血平板生長情況

圖2 顯微鏡觀察情況

2.2 生化鑒定結(jié)果

在七葉苷水解試驗中，10 株為陰性，2 株為陽性；分離菌在進(jìn)行蔗糖、麥芽糖、乳糖、甘露醇發(fā)酵等的試驗中，均為陽性。按照《柏杰明細(xì)菌鑒定手冊》的相關(guān)知識，將分離到的菌株與之對照，對分離細(xì)菌的生化鑒定結(jié)果符合有關(guān)鏈球菌的生化鑒定，試驗結(jié)果判定12 株分離菌均為鏈球菌。

2.3 分離株的16S rRNA擴增

對12 株奶牛乳房炎鏈球菌分離株引物擴增16S rRNA基因后，分離菌株均得到了大小為1 550 bp的目的片段（圖3）。

圖3 12株鏈球菌16S rRNA PCR擴增

2.4 耐藥性試驗結(jié)果

根據(jù)藥敏試驗發(fā)現(xiàn)，從新疆石河子地區(qū)某規(guī)模奶牛場得到的12 株鏈球菌對各抗生素的敏感性差異很大，從0.00%到100.00%不等；對頭孢唑啉、鏈霉素、氨芐西林、氧氟沙星、環(huán)丙沙星、四環(huán)素的敏感率均高于55.00%，對鏈霉素的敏感率則高達(dá)100.00%，而對頭孢唑啉、氨芐西林的敏感率分別為83.00%和92.00%；而分離菌株對青霉素、克林霉素、萬古霉素、強力霉素四種藥物都有較好的耐藥性；分離的12株鏈球菌中多數(shù)對慶大霉素、紅霉素表現(xiàn)為既不耐受也不敏感（表1）。

3 討論與分析

3.1 鏈球菌在奶牛場普遍存在，對某些抗生素的敏感性差異很大

目前，鏈球菌屬共有30 多種，比較常見的有10 多種，其中無乳鏈球菌為奶牛乳房炎最常見的致病菌[14～19]。鏈球菌可致人或動物的各種化膿性疾病、肺炎、乳腺炎、敗血癥等。鏈球菌在自然界中廣泛存在，在人和動物的排泄物中較為常見[20]。鏈球菌的分離也是實驗室比較常規(guī)的試驗技術(shù)，分離過程中應(yīng)嚴(yán)格按照試驗步驟進(jìn)行。本試驗從36 份乳房炎乳樣中分離到12 株鏈球菌，分離率高達(dá)33.33%（12/36），且12 株鏈球菌對各抗菌藥的敏感性差異很大，對頭孢唑啉、鏈霉素、氨芐西林、氧氟沙星、環(huán)丙沙星、四環(huán)素高度敏感，對慶大霉素、紅霉素中度敏感，對青霉素、克林霉素、萬古霉素、強力霉素明顯耐藥；分離得到的12 株鏈球菌對鏈霉素的敏感率則高達(dá)100.00%，而對頭孢唑啉、氨芐西林的敏感率分別為83.00%和92.00%。

表1 12 種抗生素對12 株鏈球菌耐藥性試驗結(jié)果

3.2 本試驗分離的鏈球菌對抗生素的耐藥性與其他地區(qū)的試驗結(jié)果相似，同一種細(xì)菌的耐藥性與地域有的一定關(guān)系

2018年王帥等人對黑龍江、上海、河北、山東、內(nèi)蒙古的部分牧場共計497 份乳房炎患牛的乳樣進(jìn)行無乳鏈球菌分離鑒定及藥物敏感性分析，共分離出無乳鏈球菌18 株，其中內(nèi)蒙古地區(qū)乳樣分離菌株對11 種抗菌藥物耐藥，黑龍江地區(qū)乳樣分離菌株對7種抗菌藥物耐藥[21]，耐藥性與本試驗結(jié)果相似。耐藥性的規(guī)律與薛梅等人在2015年的研究結(jié)果相似，對青霉素均是高度耐藥[22]。同一種細(xì)菌的耐藥性與地域有的一定關(guān)系，因為不同地域可能使用同一種抗生素的頻率不同，導(dǎo)致耐藥菌株出現(xiàn)的概率或者選擇強度不同。

3.3 應(yīng)做好鏈球菌性奶牛乳房炎的治療及預(yù)防

從鏈球菌分離情況看，該規(guī)?；膛ｐB(yǎng)殖場的奶牛乳房炎的致病菌中存在鏈球菌。致奶牛乳房炎鏈球菌是環(huán)境性致病菌，可在奶牛圈舍中大量生存，因此，做好奶牛圈舍的環(huán)境化學(xué)消毒工作，切斷傳播途徑尤為重要。奶牛乳頭或乳房在擠奶廳因物理因素受傷是一種較為常見的現(xiàn)象，因此，要加強對擠奶廳工作人員擠奶規(guī)范操作的培訓(xùn)，并保證擠奶環(huán)境清潔，防止環(huán)境中菌群增殖。

在使用抗生素治療由鏈球菌引起的奶牛乳房炎時，要特別注意選擇用藥，并嚴(yán)格遵守用藥規(guī)范[14]。由于細(xì)菌對抗生素易產(chǎn)生耐藥性，在臨床治療過程中應(yīng)科學(xué)選擇多種比較敏感的藥物，聯(lián)合或交替使用，以減少單個藥物的使用劑量或使用時間，可減緩耐藥菌株的產(chǎn)生，降低乳汁中的藥物殘留[23～26]。

使用無抗生素成分的藥物治療奶牛乳房炎是一種比較安全、綠色的方案，應(yīng)根據(jù)奶牛場的實際情況進(jìn)行選擇[27～29]。在實際生產(chǎn)中發(fā)現(xiàn)奶牛乳房炎以多種致病菌混合感染為主，而快速診斷是診斷奶牛乳房炎的重要研究方向，但目前停留在實驗室階段的較多，奶牛場實際生產(chǎn)中急需更為準(zhǔn)確、快速的可現(xiàn)場同時診斷多種致病菌的技術(shù)[30，31]。鏈球菌性乳房炎對奶牛的乳房危害很大，嚴(yán)重影響奶牛乳房乳腺細(xì)胞的泌乳功能，應(yīng)做好充分有效的預(yù)防工作，避免鏈球菌在奶牛群中的感染，使用生物疫苗進(jìn)行預(yù)防免疫是預(yù)防奶牛乳房炎的重要且有效的手段，受到了奶牛場的普遍歡迎。C