急性缺血性腦卒中患者血清HIF-1α、AQP9水平與出血轉(zhuǎn)化的相關(guān)性分析

成旭靜，耿紅艷，劉新靜

急性缺血性腦卒中(acute ischemic stroke，AIS)又稱急性腦梗死(cerebral infarction，CI)，是由于腦動(dòng)脈閉塞導(dǎo)致的腦組織梗死，是目前臨床致死率和致殘率極高的一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)血管事件[1，2]。出血轉(zhuǎn)化(hemorrhagic transformation，HT)是發(fā)生在AIS后梗死區(qū)內(nèi)繼發(fā)性出血，是AIS一種嚴(yán)重并發(fā)癥，可導(dǎo)致患者病情惡化、預(yù)后差，因此早期評(píng)估AIS患者HT發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)意義重大[3]。缺氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia-inducible factor -1 α，HIF-1α)是在缺氧條件下維持組織細(xì)胞存活、細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的主要核轉(zhuǎn)錄因子，與神經(jīng)細(xì)胞損傷修復(fù)、AIS嚴(yán)重程度及預(yù)后密切相關(guān)[4，5]。水通道蛋白9(aquaporin 9，AQP9)存在于線粒體內(nèi)膜，對(duì)腦組織能量平衡具有一定調(diào)節(jié)作用，與腦缺血缺氧程度及腦水腫呈正相關(guān)[6，7]。研究報(bào)道，HIF-1 α、AQP9水平與缺氧缺血性腦損傷新生大鼠腦組織水腫及神經(jīng)細(xì)胞凋亡有關(guān)[8]，然而關(guān)于二者與AIS患者HT的相關(guān)性尚鮮有報(bào)道?；诖耍狙芯繑M通過檢測AIS患者血清HIF-1 α、AQP9水平，探究其與HT的相關(guān)性及對(duì)AIS患者發(fā)生HT的早期預(yù)測價(jià)值?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2017年10月～2019年4月本院收治的183例AIS患者，根據(jù)復(fù)查CT檢測結(jié)果分為HT組(84例)和非HT組(99例)?；颊呒{入標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合《2010年中國急性缺血性腦卒中診治指南》中關(guān)于AIS診斷標(biāo)準(zhǔn)[9]；(2)均經(jīng)頭顱CT或核磁共振成像(magnetic resonance imaging，MRI)證實(shí)；(3)均行靜脈溶栓治療；(4)均首次發(fā)病且在4.5 h內(nèi)入院；(5)入院前首次CT檢查未發(fā)現(xiàn)出血，發(fā)病7 d～14 d復(fù)查發(fā)現(xiàn)低密度區(qū)內(nèi)高密度影為發(fā)生HT判定標(biāo)準(zhǔn)。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并嚴(yán)重肝、腎疾病或發(fā)病1 m內(nèi)出現(xiàn)心肌梗死者；(2)合并感染性疾病或自身免疫性疾病者；(3)合并惡性腫瘤者；(4)有顱腦手術(shù)史并發(fā)生腦梗死或腦出血者。

1.2 方法

1.2.1 資料收集 收集所有受試者入院后記錄基線資料，主要包括患者性別、年齡、體質(zhì)量指數(shù)(body mass index，BMI)、高血壓史、糖尿病史、高血脂癥史及入院治療前急診基線美國國立衛(wèi)生研究院卒中量表(national institutes of health stroke scale，NIHSS)評(píng)分、基線收縮壓、基線舒張壓、基線血糖、溶栓時(shí)間窗、血清標(biāo)本等資料。

1.2.2 血清HIF-1α、AQP9水平檢測 采用免疫印跡(western blot，WB)檢測血清HIF-1α、AQP9蛋白表達(dá)水平。采用蛋白抽提試劑盒(貨號(hào)：P0028，上海碧云天有限公司)提取血清總蛋白，BCA試劑盒檢測(貨號(hào)：P0010S，上海碧云天有限公司)蛋白濃度，置于-80 ℃保存?zhèn)溆?。?0 g蛋白樣品，6% SDS-PAGE電泳2 h，PVDF膜轉(zhuǎn)膜70 min。5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，添加兔源一抗anti-HIF-1α抗體(貨號(hào)：ab216842，稀釋比1∶500，英國Abcam公司)，anti-AQP9抗體(貨號(hào)：ab15127，稀釋比1∶1000，英國Abcam公司)，anti-GAPDH抗體(貨號(hào)：ab181602，稀釋比，英國Abcam公司)4 ℃孵育過夜，TBST緩沖液洗膜3次，添加二抗羊抗兔IgG(貨號(hào)：ab205718，稀釋比1∶5000，英國Abcam公司)室溫孵育1.5 h，按上述方法洗膜，顯色，曝片，觀察結(jié)果并進(jìn)行分析。

2 結(jié) 果

2.1 HT組與非HT組AIS患者基線資料比較 HT組與非HT組AIS患者性別、年齡、BMI、高血壓比例、糖尿病比例、高血脂癥比例差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與非HT組比較，HT組AIS患者基線NIHSS評(píng)分、基線收縮壓、基線舒張壓、基線血糖、溶栓時(shí)間窗均顯著增加(P<0.05)(見表1)。

表1 HT組與非HT組AIS患者基線資料比較例(%)]

表1續(xù) HT組與非HT組AIS患者基線資料比較例(%)]

2.2 HT組與非HT組AIS患者血清HIF-1α、AQP9蛋白水平比較 與非HT組比較，HT組AIS患者血清HIF-1α、AQP9蛋白水平均顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(見表2、圖1)。

圖1 WB檢測血清HIF-1α、AQP9蛋白表達(dá)

表2 HT組與非HT組AIS患者血清HIF-1α、AQP9蛋白水平比較

2.3 HT組AIS患者血清HIF-1α、AQP9蛋白水平的相關(guān)性 Pearson分析結(jié)果顯示，HT組AIS患者血清HIF-1α、AQP9蛋白水平成正相關(guān)(r=0.679，P<0.05)(見圖2)。

圖2 HT組AIS患者血清HIF-1α、AQP9蛋白水平的相關(guān)性

2.4 Logistic回歸分析影響AIS患者發(fā)生HT的危險(xiǎn)因素 以是否發(fā)生HT為因變量(是=1，非=0)，以NIHSS評(píng)分、基線收縮壓、基線舒張壓、基線血糖、溶栓時(shí)間窗、血清HIF-1α、AQP9蛋白水平為自變量進(jìn)行Logistic回歸分析，結(jié)果顯示，NIHSS評(píng)分、溶栓時(shí)間窗和血清HIF-1α、AQP9蛋白水平是AIS患者溶栓后發(fā)生HT的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05)(見表3)。

表3 Logistic回歸分析影響AIS患者發(fā)生HT的危險(xiǎn)因素

2.5 NIHSS、溶栓時(shí)間窗、血清HIF-1α、AQP9水平對(duì)AIS患者發(fā)生HT的預(yù)測價(jià)值 分別以NIHSS、溶栓時(shí)間窗、血清HIF-1α、AQP9水平為檢測變量繪制ROC曲線發(fā)現(xiàn)曲線下面積(area under the curve，AUC)分別為0.707(95%CI：0.632～0.782)、0.790(95%CI0.721～0.859)、0.881(95%CI0.829～0.932)、0.869(95%CI0.814～0.924)，截?cái)嘀捣謩e為13.39分、296.31 min、0.33、0.32，靈敏度分別為44%、66.70%、86.90%、83.30%，特異度分別為91.90%、87.90%、87.90%、88.90%。另采用SPSS 25.0軟件的聯(lián)合應(yīng)用理論模式：基于本研究樣本資料，對(duì)各單獨(dú)應(yīng)用指標(biāo)進(jìn)行綜合Logistic回歸，再依據(jù)所得參數(shù)(β分別為0.578、0.025、7.711、8.036)，歸一化加權(quán)計(jì)算并對(duì)應(yīng)處理各樣本資料，并據(jù)其進(jìn)行聯(lián)合應(yīng)用的ROC分析。結(jié)果顯示NIHSS、溶栓時(shí)間窗、血清HIF-1α及AQP9水平聯(lián)合應(yīng)用預(yù)測AIS發(fā)生HT AUC為0.980，靈敏度和特異度分別為94.00%和94.90%，顯然該聯(lián)合模式，其診斷效能比單一指標(biāo)均有明顯提高(見圖3)。

圖3 NIHSS、溶栓時(shí)間窗、血清HIF-1α、AQP9水平預(yù)測AIS患者發(fā)生HT的ROC曲線

3 討 論

HIF-1是由α、β兩種亞基組成的異源二聚體，HIF-1α是一種氧調(diào)節(jié)亞基，廣泛存在于哺乳動(dòng)物細(xì)胞，通常情況下HIF-1α在細(xì)胞中可被迅速降解，含量極少，缺氧狀態(tài)下，HIF-1α水解酶活性降低，導(dǎo)致HIF-1α累積，進(jìn)而啟動(dòng)一系列機(jī)體對(duì)缺氧環(huán)境的適應(yīng)性反應(yīng)，促進(jìn)低氧環(huán)境下細(xì)胞存活及增殖，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[10]。腦出血后，大腦組織將呈現(xiàn)能量代謝改變、電解質(zhì)平衡紊亂等狀態(tài)，研究證實(shí)水通道蛋白家族(aquaporins，AQPs)廣泛存在于各種細(xì)胞器官的細(xì)胞膜及細(xì)胞器膜上，其中AQP9在腦水腫發(fā)病中研究較多，與電解質(zhì)平衡紊亂等有關(guān)[11，12]。Ding等[13]研究報(bào)道，由錳超氧化物歧化酶表達(dá)為標(biāo)志物指示腦外傷后缺氧狀態(tài)發(fā)現(xiàn)，缺氧環(huán)境可促進(jìn)HIF-1α表達(dá)，進(jìn)而上調(diào)AQP9表達(dá)。姚璐等[8]研究報(bào)道，燈盞乙素可降低缺氧缺血性腦損傷新生大鼠腦組織HIF-1α、AQP9表達(dá)，抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡，減輕大鼠腦組織水腫。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與非HT組比較，HT組AIS患者血清HIF-1α、AQP9水平顯著升高，且二者成正相關(guān)，提示HIF-1α、AQP9可能協(xié)同影響AIS患者合并HT發(fā)生。

目前臨床早期(3 h～4.5 h內(nèi))對(duì)AIS患者采取溶栓治療可有效改善AIS患者預(yù)后，但由于有效時(shí)間窗的限制，臨床實(shí)際應(yīng)用中獲救人數(shù)仍占少數(shù)。AIS患者腦缺血再灌注損傷是導(dǎo)致溶栓治療率低的主要原因之一。HT是AIS患者腦血管內(nèi)皮受損而使紅細(xì)胞外滲的結(jié)果，是溶栓后主要危險(xiǎn)并發(fā)癥，可進(jìn)而啟動(dòng)一系列氧化應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致缺血再灌注羥自由基形成并產(chǎn)生神經(jīng)毒性，引起血腦屏障通透改變，從而導(dǎo)致腦組織水腫，造成缺血半暗帶增加及內(nèi)環(huán)境紊亂。徐耑等[14]研究報(bào)道，基線收縮壓高、基線NIHSS評(píng)分較高、早期頭部CT有缺血改變、溶栓24 h內(nèi)血壓變異性大是房顫患者靜脈溶栓后發(fā)生HT的危險(xiǎn)因素。王凱等[15]研究報(bào)道，AIS患者伴重度腦微出血是AIS患者預(yù)后不良的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。本研究結(jié)果顯示，與非HT組比較，HT組AIS患者基線NIHSS評(píng)分、基線收縮壓、基線舒張壓、基線血糖、溶栓時(shí)間窗均顯著增加，且NIHSS評(píng)分、溶栓時(shí)間窗和血清HIF-1α、AQP9水平增加均是引起AIS患者發(fā)生HT的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，提示血清HIF-1α、AQP9水平及臨床基線資料可能對(duì)AIS患者發(fā)生HT預(yù)后評(píng)估具有重要價(jià)值。本研究進(jìn)一步采用ROC分析NIHSS、溶栓時(shí)間窗、血清HIF-1α、AQP9水平預(yù)測AIS患者發(fā)生HT結(jié)果顯示，AUC分別為0.707、0.790、0.881、0.869，截?cái)嘀捣謩e為13.39分、296.31 min、0.33、0.32，靈敏度分別為44%、66.70%、86.90%、83.30%，特異度分別為91.90%、87.90%、87.90%、88.90%。四者聯(lián)合應(yīng)用預(yù)測AIS發(fā)生HT AUC為0.980，靈敏度和特異度分別為94.00%和94.90%，顯然該聯(lián)合模式，其診斷效能比單一指標(biāo)均有明顯提高。提示檢測血清HIF-1α、AQP9水平聯(lián)合臨床NIHSS、溶栓時(shí)間窗指標(biāo)可能對(duì)臨床預(yù)測AIS發(fā)生HT有更好的參考價(jià)值。

綜上所述，血清HIF-1α、AQP9水平升高可能與AIS患者發(fā)生HT有關(guān)，且是影響AIS繼發(fā)HT的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，二者聯(lián)合檢測對(duì)AIS發(fā)生HT具有一定預(yù)測價(jià)值。但由于本研究樣本量少，存在不足，另關(guān)于血清HIF-1α、AQP9水平預(yù)測AIS發(fā)生HT最佳截?cái)嘀瞪胁磺宄笃谟写M(jìn)一步深入探究。