瓦氏黃顙魚病原菌的分離鑒定及防控藥物篩選

賈 丹，孔令富，嚴 暉，戴春祥，胡 青，高 宇

(云南農(nóng)業(yè)大學 動物科學技術(shù)學院，云南 昆明 650201)

【研究意義】黃顙魚(Pelteobagrusfulvidraco)和瓦氏黃顙魚(Pelteobagrusvachelli)均隸屬于鲇形目(Siluriformes)，鲿科(Bagridae)，黃顙魚屬(Pelteobagrus)[1]，具有味道鮮美、口感好、無肌間刺且營養(yǎng)價值高等特點，深受消費者的青睞。該魚市場需求量大，價格高，是中國主要的水產(chǎn)養(yǎng)殖品種[2～3]。瓦氏黃顙魚是近幾年興起的一種本土經(jīng)濟魚類，隨著人工養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴大，集約化的發(fā)展，有的爆發(fā)性疾病日趨嚴重[4]。由于自然環(huán)境、養(yǎng)殖密度、餌料和水質(zhì)等因素的影響，黃顙魚在養(yǎng)殖過程中發(fā)生的病害日趨增多。【前人研究進展】黃顙魚疾病出現(xiàn)的赤皮、水腫、體表潰瘍、腹水等癥狀均為感染嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)所引起[4-7]。嗜水氣單胞菌(A.hydrophila)屬于弧菌科、氣單胞菌屬，是嗜溫、有動力的氣單胞菌群，可從淡水、污水中分離得到[8]，是一種典型的人、獸、魚共患病病原菌[9]。目前，由嗜水氣單胞菌引起的疾病大多采用抗生素進行防治，但抗生素不科學的施用已產(chǎn)生嚴重的耐藥性[10]，且耐藥性隨著菌株傳代次數(shù)的增加而增強[11]；加之嗜水氣單胞菌常與其他致病菌的混合感染，增加了對嗜水氣單胞菌的防治難度。在水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中，隨著對細菌性疾病防治安全性和生態(tài)性要求的不斷提高，嗜水氣單胞菌已引起國內(nèi)外學者的高度重視。【本研究切入點】2017年8月云南省某養(yǎng)殖有限公司的瓦氏黃顙魚死亡的發(fā)生，給該地的養(yǎng)殖戶造成了很大的經(jīng)濟損失?！緮M解決的關(guān)鍵問題】為此，針對云南省養(yǎng)殖的患病瓦氏黃顙魚問題，對分離菌進行了形態(tài)觀察、生理生化鑒定、16S rRNA和主要粘附素基因(major adhesin gene，Mah)序列分析，從患病魚體肝臟中分離鑒定出嗜水氣單胞菌，并對分離菌株進行了藥敏試驗，旨在為有效控制由嗜水氣單胞菌引起的相關(guān)疾病提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 患病魚解剖與觀察

患病瓦氏黃顙魚，2017年8月由云南省安寧市八街鎮(zhèn)安寧友誼觀賞魚養(yǎng)殖有限公司提供。對發(fā)病瓦氏黃顙魚進行解剖，以肉眼觀察和鏡檢相結(jié)合的方法，對發(fā)病魚體表、鰓和內(nèi)臟的病癥及有無寄生蟲進行觀察并記錄其癥狀。送檢的瓦氏黃顙魚大部分出現(xiàn)體表潰瘍(圖1)，挑取潰瘍部位壓片鏡檢，無真菌菌絲；肛門紅腫。解剖后，可見腸道內(nèi)無食物殘留，腹腔內(nèi)有少量淡黃色粘稠積液，肝臟呈淡紅色，膽囊腫大。

圖1 患病瓦氏黃顙魚的典型臨床癥狀

1.2 病原菌的分離純化

用75 %的酒精棉球?qū)哂械湫桶Y狀的瀕死瓦氏黃顙魚體表進行消毒，無菌條件下從魚體表潰瘍處、肝臟、脾臟和腎臟等部位穿刺取樣，接種于BHI(OXOID公司)瓊脂平板上，28 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，長出單菌落后，平板劃線法對細菌進行純化。將單一形態(tài)菌落接種于BHI液體培養(yǎng)基中，28 ℃振蕩培養(yǎng)24 h，取1 mL菌液加入20 %無菌甘油保存于-20 ℃中備用。

1.3 分離菌的生理生化鑒定

取純化后的菌落分別接種在BHI平板和血瓊脂(Solarbio公司)平板上，28 ℃培養(yǎng)24 h后觀察菌落特征及溶血性，革蘭氏染色觀察菌體形態(tài)。無菌條件下，將純化菌株接種于細菌生理生化微量鑒定管(杭州微生物試劑有限公司)中，對其碳水化合物、氨基酸、明膠和吲哚等進行生理生化指標分析。

1.4 16S rRNA和Mah基因擴增及系統(tǒng)發(fā)育樹分析

將保存菌株接種在BHI平板中培養(yǎng)24 h，挑取單菌落接種于BHI液體培養(yǎng)基中，150 r/min 28 ℃振蕩過夜后，用細菌基因組DNA快速提取試劑盒(北京艾德萊生物科技有限公司)提取菌株基因組DNA。PCR反應體系為50 μl：包含1 μl DNA模板，25 μl Master Mix(昆明碩擎生物有限公司)，特異性引物各1 μl(表1)，加ddH2O至50 μl。PCR反應循環(huán)為：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。

PCR反應結(jié)束后，取5 μl擴增的產(chǎn)物使用6×核酸上樣緩沖液點樣，GelRed試劑(Biotium公司)按1∶10 000溶于1 %瓊脂糖凝膠溶液中，采用1×TAE電泳緩沖液以5 V/cm電泳30 min后，用紫外透射儀(JY02型)觀察電泳條帶，并將PCR產(chǎn)物送昆明碩擎生物有限公司測序。

將測定菌株的16S rRNA和Mah基因序列在GenBank中進行Blast搜索和分析，選用Clustal W法與已知的嗜水氣單胞菌16S rRNA和Mah序列進行同源序列比對并推導Mah的氨基酸序列。以16S rRNA核苷酸和Mah氨基酸序列為分子標記，分別用DNAstar軟件包中的MegAlign計算序列相似性；用MEGA7軟件中鄰接法(NJ)構(gòu)建16S rRNA核苷酸和Mah氨基酸系統(tǒng)發(fā)育樹，自展法(Bootstrap)進行1000次重復，并用一致性指數(shù)(consistency index，CI)來衡量分析結(jié)果的可靠性。

表1 特異性引物序列

1.5 分離菌的人工回歸感染試驗

供試魚在循環(huán)水養(yǎng)殖缸中暫養(yǎng)7 d后，將保存的菌株接種于BHI液體培養(yǎng)基中，28 ℃ 150 r/min振蕩培養(yǎng)24 h，4000 r/min離心5 min收集菌體，0.6 %生理鹽水重懸。利用分光光度計準確調(diào)整菌液濃度為1.0×107cfu/mL，對供試魚進行胸鰭基部注射，實驗組0.2 mL/尾，對照組注射0.2 mL/尾0.6 %生理鹽水。觀察并記錄7 d內(nèi)供試魚死亡數(shù)及癥狀，發(fā)病時水溫，剖檢死亡或瀕死供試魚，并從其肝臟、腎臟等部位再次分離細菌，進行菌體形態(tài)觀察和生理生化鑒定。

1.6 藥敏試驗

氨芐青霉素、鹽酸多西環(huán)素、氟苯尼考、硫酸新霉素、諾氟沙星、鹽酸環(huán)丙沙星藥敏紙片購自杭州微生物試劑有限公司；新諾明、磺胺嘧啶、甲砜霉素購自BCMEI公司，磺胺二甲嘧啶、噁喹酸購自華夏試劑有限公司，根據(jù)《淡水養(yǎng)殖魚類疾病與防治手冊》[12]由實驗室制作其余藥敏片。

采用紙片瓊脂擴散法(K-B法)進行藥敏試驗，將分離純化菌株接種于BHI液體培養(yǎng)基中，28 ℃培養(yǎng)24 h后，0.6 %生理鹽水調(diào)整菌濃度為1.0×107cfu/mL，取150 μl菌液均勻涂布于BHI瓊脂平板上，同時粘貼藥敏紙片，每皿4片，每種藥3個重復，經(jīng)28 ℃培養(yǎng)24 h后觀察并測量記錄藥敏片周圍抑菌圈的直徑，以抑菌圈直徑大小作為指標對實驗結(jié)果進行判定。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株形態(tài)觀察

將從肝臟中分離的菌株命名為Ah0003，接種在血瓊脂平板上，28 ℃培養(yǎng)24 h后，菌株呈圓形、中央隆起、表面光滑、邊緣整齊、半透明、灰白色，有溶血環(huán)出現(xiàn)。該菌在BHI平板上生長良好；分離純化后的細菌經(jīng)革蘭氏染色后為陰性，普通光學顯微鏡400×下可見菌體兩斷鈍圓、短桿狀。

2.2 生理生化特性檢測

常規(guī)生理生化特性測定結(jié)果表明，該菌株能利用甘露糖、葡萄糖、蔗糖、阿拉伯糖等，不能利用山梨糖、棉子糖、纖維二糖、鼠李糖、乳糖和密二糖等，與乙酰胺、肌醇反應為陰性，賴氨酸、精氨酸水解酶實驗為陽性，吲哚實驗、運動性實驗和明膠實驗為陽性(表2)，根據(jù)以上特征，初步鑒定為嗜水氣單胞菌。

表2 Ah0003菌株的主要生理生化特征

注：+：陽性；-：陰性；NA：未提供。

Note: +: Positive;-: Negative; NA: not applicate.

圖2 11株氣單胞菌屬菌株16s rRNA序列系統(tǒng)發(fā)育樹

2.3 Ah0003菌株的16S rRNA基因序列分析

通過對Ah0003菌株的基因組DNA進行PCR反應，得到一段長度序列為1500 bp左右的PCR擴增產(chǎn)物。測序結(jié)果顯示Ah0003 16S rRNA序列長為1374 bp。

將Ah0003菌株的16S rRNA基因序列提交到GenBank進行BLAST搜索，與已經(jīng)報道的嗜水氣單胞菌16S rRNA基因序列進行分析，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2)。菌株Ah0003與A.hydrophila自然構(gòu)成一個分支(bootstrap 93)。將Ah0003核苷酸序列用DNAstar軟件進行序列同源性分析，結(jié)果顯示Ah0003與A.hydrophila16S rRNA的序列相似性為99.5 %。

圖4 幾株嗜水氣單胞菌Mah氨基酸序列系統(tǒng)發(fā)育樹

2.4 Ah0003菌株的主要粘附素基因(Mah)序列分析

克隆得到致病菌株Mah部分序列見圖3，推導的蛋白質(zhì)編碼318個氨基酸殘基，分子量為34.694 kDa，與嗜水氣單胞菌菌株WC10-1、NSAH-01、BA17、GA1和TPS-30氨基酸相似性分別為99.7 %、99.7 %、84.1 %、83.9 %和87.5 %。Ah0003與WC10-1的Mah氨基酸序列高度同源，聚類為嗜水氣單胞菌主要粘附素基因的一個分支(圖4)。

2.5 回歸感染實驗

Ah0003菌株對瓦氏黃顙魚和尼羅羅非魚均有比較強的致病力(表3)，供毒后第2天開始出現(xiàn)死亡現(xiàn)象，水溫均為25 ℃，供毒7 d內(nèi)累計死亡率分別為90 %和100 %，發(fā)生死亡的瓦氏黃顙魚癥狀與自然病例相同，對照組在觀察期14 d內(nèi)無明顯疾病癥狀，無魚體死亡。從人工感染瀕死的魚體肝臟和腎臟中，均再次分離到與自然發(fā)病分離菌相同的細菌。

圖3 Ah0003菌株Mah核苷酸與推測的氨基酸序列

表3 人工感染試驗結(jié)果

表4 Ah0003菌株對藥物敏感性的實驗結(jié)果

注：S：高度敏感；I：中度敏感；R：不敏感。

Note: S: Highly sensitive; I: Moderately sensitive; R: Insensitive.

2.6 分離菌株的藥物敏感性

如表4所示，供試菌株對鹽酸環(huán)丙沙星、諾氟沙星、噁喹酸3種藥物高度敏感；對鹽酸多西環(huán)素、氟苯尼考、硫酸新霉素、磺胺二甲嘧啶4種藥物敏感；對氨芐青霉素、磺胺嘧啶、新諾明、甲砜霉素4種藥物不敏感。

3 討 論

近年來，隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖品種的多元化，養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴大，加之品質(zhì)、種質(zhì)以及不良環(huán)境等因素的影響，水產(chǎn)病害日趨嚴重，導致養(yǎng)殖戶虧損風險不斷增大。針對瓦氏黃顙魚的養(yǎng)殖現(xiàn)狀，以及養(yǎng)殖場的常見疾病，研究對魚病的預防、控制、治療的有效措施勢在必行。

嗜水氣單胞菌是引起水產(chǎn)動物細菌性敗血癥的重要病原菌之一，多數(shù)菌株為條件性致病菌，可引起魚和蝦感染發(fā)病。如嗜水氣單胞菌感染草魚(Ctenopharyngodonidella)、鯉魚(Cyprinuscarpio)、青魚(Mylopharyngodonpiceus)和異育銀鯽(Carassiusauratus)引發(fā)細菌性敗血癥[14-16]；導致克氏原螯蝦(Procambarusclarkii)和凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)爆發(fā)性死亡[17-18]。2012-2017年，廣西多地發(fā)生嗜水氣單胞菌感染黃顙魚致死的病例報道，經(jīng)濟損失嚴重，癥狀大多為體表潰瘍、大量腹水、腸炎和肝臟發(fā)白等[6-7,19]。從體表潰瘍的瓦氏黃顙魚體內(nèi)分離得到的嗜水氣單胞菌對尼羅羅非魚同樣具有致病性，提示嗜水氣單胞菌在不同水產(chǎn)養(yǎng)殖物種中可能存在跨物種傳播。

細菌核糖體RNA(rRNA)包括5S rRNA、16S rRNA和23S rRNA 3種類型。5S rRNA基因序列較短，不適合鑒定細菌種類；23S rRNA基因序列較長，且其堿基突變率高，不適合鑒定親緣關(guān)系較遠的細菌種類；16S rRNA基因序列適中且具有保守性、普遍性和穩(wěn)定性等特點，可對微生物進行簡便、快速、準確的分類鑒定[20]。常規(guī)的微生物生理生化鑒定需要測定多項理化指標，操作繁瑣，由于弧菌科種類繁多，種間的生理生化反應差異小，很難鑒定出其屬于哪一種細菌，分子生物學方法對傳統(tǒng)細菌鑒定起到了很好的補充作用[21]。Mah為嗜水氣單胞菌的毒力因子之一，主要作用是通過粘附素定植于宿主組織細胞表面，研究表明Mah融合表達的蛋白具有良好的抗原性和免疫原性，能顯著減少不同Ah菌株對鯉魚上皮瘤細胞的粘附作用[22]。

2012-2017年從廣西多地患病黃顙魚中分離出嗜水氣單胞菌，該嗜水氣單胞菌株對硫酸新霉素、氟苯尼考、鹽酸環(huán)丙沙星、磺胺二甲嘧啶、氟奎諾酮類等藥物敏感，對青霉素、氨芐青霉素、復方新諾明等藥物不敏感[7,19]。2015年江蘇地區(qū)暴發(fā)黃顙魚出血性腸炎，分離到的2株嗜水氣單胞菌顯示出不同的耐藥性，但均對依諾沙星、頭孢曲松、恩諾沙星等藥物敏感，對青霉素和鏈霉素等藥物產(chǎn)生耐藥性[5]。2011年從浙江地區(qū)患病的西伯利亞鱘體內(nèi)分離得到1株嗜水氣單胞菌，對慶大霉素、強力霉素、丁胺卡那霉素、氟苯尼考、阿奇霉素及左氧氟沙星等藥物高度敏感，但對青霉素、紅霉素和阿莫西林等藥物具有耐藥性[23]。供測試的11種抗生素中，云南省分離的嗜水氣單胞菌同樣對氨芐青霉素等藥物出現(xiàn)耐藥，提示嗜水氣單胞菌對氨芐青霉素的耐藥性已廣泛存在。但該致病菌對鹽酸環(huán)丙沙星、磺胺二甲嘧啶和氟苯尼考等藥物的敏感程度與廣西等地分離的嗜水氣單胞菌實驗結(jié)果存在差異，究其原因與不同養(yǎng)殖區(qū)域的養(yǎng)殖環(huán)境、養(yǎng)殖技術(shù)以及用藥習慣等有關(guān)，或是細菌的高突變率導致其快速進化，從而引起菌種之間耐藥性的差異。

4 結(jié) 論

通過形態(tài)學、生理生化特征、16S rRNA和Mah基因序列將從云南省患病瓦氏黃顙魚肝臟中分離的Ah0003菌株鑒定為嗜水氣單胞菌；Ah0003對鹽酸環(huán)丙沙星、諾氟沙星、噁喹酸高度敏感，可考慮作為防治瓦氏黃顙魚嗜水氣單胞菌引起相關(guān)疾病的藥物。